Abstract

Survival taxas para pacientes com câncer de pâncreas são extremamente pobres, devido à sua progressão assintomática ao avançado e estágio metastático para os quais as terapias atuais permanecem em grande parte ineficazes. Por conseguinte, os novos agentes terapêuticos e de abordagens de tratamento são desejados para melhorar o resultado clínico. Neste estudo, foram determinados os efeitos de honokiol, um componente biologicamente activo de erva medicinal oriental

Magnolia officinalis /grandiflora

, em duas linhas de células de cancro do pâncreas, MiaPaCa e Panc1, sozinhos e em combinação com o fármaco quimioterapêutico padrão , gemcitabina. Honokiol exerceu efeitos inibidores do crescimento em ambas as linhas celulares de cancro do pâncreas, causando a paragem do ciclo celular em G

1 e fase de indução de apoptose. Ao nível molecular, honokiol diminuiu marcadamente a expressão de ciclinas D1 e (E) e cinases dependentes de ciclinas (Cdk2 e Cdk4), e causou um aumento de Cdk inibidores, p21 e p27. Além disso, o tratamento honokiol levou a aumento de /Bcl-2 e Bax /Bcl-xL rácios Bax para favorecer a apoptose em células de cancro do pâncreas. Estas alterações foram acompanhadas por acumulação citoplásmica aumentada de NF-kB, com uma concomitante diminuição da fracção nuclear e reduzida actividade de transcrição do promotor responsivo a NF-kB. Isto foi associado com a diminuição da fosforilação de inibidor de alfa kappa B (IkB-α) causando a sua estabilização e, portanto, o aumento dos níveis celulares. Importante, honokiol também potenciado os efeitos citotóxicos de gemcitabina, em parte, ao limitar a acumulação nuclear induzida por gemcitabina de NF-kB em linhas celulares de cancro pancreático tratados. Em conjunto, esses resultados demonstram, pela primeira vez, os efeitos do inibidor do crescimento de honokiol em câncer de pâncreas e indicam a sua utilidade potencial como um novo agente natural na prevenção e terapia

Citation:. Arora S, Bhardwaj A, Srivastava SK, Singh S, S McClellan, Wang B, et al. (2011) honokiol detenções ciclo celular, induz a apoptose, e potencializa os efeitos citotóxicos Efeito da gemcitabina em células de cancro pancreático humano. PLoS ONE 6 (6): e21573. doi: 10.1371 /journal.pone.0021573

editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de maio de 2011; Aceito: 02 de junho de 2011; Publicação: 24 de junho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Arora et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por apoio financeiro da National Institutes of /Instituto de Saúde Nacional do Câncer (NIH /NCI) (CA137513) e USAMCI. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é uma das neoplasias mais letais nos Estados Unidos com taxa de mortalidade aumentando a cada ano que vem [1], [2]. De acordo com a estimativa da American Cancer Society, 43140 americanos foram diagnosticados com câncer de pâncreas em 2010 e 36.800 morreram, marcando desta neoplasia como a quarta principal causa de morte por câncer [2]. Devido à sua progressão assintomática, o câncer de pâncreas é diagnosticado numa fase em que ele já tem metástase ou localmente avançado [3]. abordagens terapêuticas contra a doença avançada têm falhado e cerca de 80% dos pacientes diagnosticados com esta doença maligna ainda morrem dentro de 2-8 meses [4]. Gemcitabina, a FDA padrão de aprovação da droga para a terapia do câncer de pâncreas, é relatado para ser minimamente eficaz que melhora a sobrevida do paciente por duas semanas apenas [3], [5]. Portanto, é de extrema importância para desenvolver esquemas terapêuticos alternativos e estratégias para uma gestão eficaz de câncer pancreático.

Várias novas estratégias, que visam o crescimento promover percursos isoladamente e em combinação com gemcitabina, foram testados em cancro do pâncreas melhorar os resultados terapêuticos [6]. Além disso, vários estudos recentes identificaram elementos de sinalização desregulados, tais como Ras, Akt, NF-kB, miRNAs, etc., que não só promover a progressão do câncer, mas também conferem chemoresistance em câncer pancreático [7] – [9]. Indução destes percursos de sobrevivência resultados de activação de mutações de genes, perda de vias e /ou potenciação inibitórias através de mecanismos autócrinos e parácrinos de sinalização [3], [10]. Na verdade, verificou-se agora mostrado que a segmentação de alguns desses nodos de sinalização podem ser úteis na inibição do crescimento do tumor e progressão, assim como para restaurar a sensibilidade das células tumorais aos fármacos citotóxicos [3], [9], [10] .

os produtos naturais têm estado no cerne de quimioterapia para últimas décadas e, de fato, mais de 60% dos medicamentos anticancerígenos atuais têm sua origem a partir de fontes naturais [11]. Em vários estudos recentes, os novos compostos derivados de plantas foram identificados para actuar como agentes anti-tumorais através da modulação de vias biológicas [12]. Honokiol, um composto biphenolic biologicamente ativos isolados a partir dos

Magnolia officinalis /grandiflora,

tem recebido atenção significativa devido às suas potentes propriedades anti-neoplásicos e anti-angiogênicos [13], [14]. Ele rendeu dados promissores contra os cânceres de pele, cólon, pulmão e da mama [13], [15] – [17]. O aspecto surpreendente da honokiol como uma droga anti-neoplásica é o seu potencial para inibir o factor nuclear kappa B (NF-kB), que está associada com a sobrevivência de células de cancro e quimiorresistência [9], [10], [18]. O NF-kB é activado constitutivamente em uma variedade de doenças malignas hematológicas e sólidos, incluindo o cancro do pâncreas e controla a expressão de uma variedade de genes envolvidos na proliferação e sobrevivência celular através de mecanismos directos e indirectos [18] – [20]. No presente estudo, nós examinamos, pela primeira vez, os efeitos de honokiol contra o cancro pancreático. Os nossos dados mostram que honokiol inibe o crescimento de linhas celulares de cancro pancreático humano MiaPaCa e, Panc1, causando a paragem do ciclo celular e a indução de apoptose. Além disso, nosso estudo fornece evidência para um papel de honokiol na quimio-sensibilização das células do cancro do pâncreas citotóxica efeitos da gemcitabina.

Resultados

efeito inibidor do crescimento de honokiol em células de câncer pancreático humano

Duas linhas celulares de cancro pancreático humano viz. MiaPaCa e Panc1 foram empregados como um sistema modelo para investigar o efeito de honokiol sobre o crescimento de células de câncer pancreático. As células tratadas com honokiol (10-60 uM) mostraram alterações na morfologia, em comparação com veículo (DMSO), as células tenha sido tratada com. Com o aumento da concentração de honokiol, as células tornaram-se redondas, encolhida e destacada do substrato (Figura 1A), consistentes com alterações morfológicas associadas à apoptose. Subsequentemente, foi quantificado o os efeitos citotóxicos da honokiol medindo percentagem de viabilidade utilizando o ensaio de WST-1. Os nossos dados demonstraram que honokiol induziu uma diminuição da dose e dependente do tempo do crescimento de ambas as linhas de células de cancro do pâncreas com IC

50 valores de ~43.25, 31,08 e 18,54 uM (contra MiaPaCa), e ~47.44, 34,17 e 21,86 uM (contra Panc1) após 24, 48 e 72 h de tratamentos, respectivamente (Figura 1B). Juntos, estes resultados indicam que o honokiol tem efeitos inibidores do crescimento sobre células de cancro do pâncreas.

e células MiaPaCa Panc1 (A) foram semeadas em placa de 6 poços (1 × 10

5 células /poço) e deixou-se atingir 70-80% antes do tratamento honokiol (10-60 uM) confluência durante 48 h. Após o tratamento, foi observada alteração significativa na morfologia das células de ambos os tipos de células como examinado sob microscópio de contraste de fase. As células tornaram-se redondas, encolhida e isolada a partir da superfície celular de um modo dependente da dose. micrografias representativas são a partir de um dos campos aleatórios de vista (200X) de células tratadas com 20, 40 ou 60 uM honokiol. (B) As células MiaPaCa Panc1 e foram cultivadas em placas de 96 poços de microtítulo (1 × 10

4 células /cavidade) e tratou-se com honokiol (10-60 uM) a 70-80% de confluência. percentagem de viabilidade das células foi medido pelo ensaio de WST-1 após 24, 48 e 72 h. Um valor de OD de células de controlo (tratados com um volume igual de DMSO, concentração final, 0,1%) foi tomada como 100% de viabilidade. Honokiol inibiu a viabilidade das células em uma dose e tempo-dependente forma para ambos os tipos celulares, sugerindo efeito anti-tumoral de honokiol. Os dados são expressos como média ± DP; (N = 3).

Honokiol provoca G

paragem do ciclo celular 1 fase e induz a apoptose em células de cancro do pâncreas

A supressão do crescimento de células cancerosas pode ser causada por prisão da progressão do ciclo celular ou devido à indução de apoptose ou em ambos [12]. Os nossos dados sobre a distribuição do ciclo celular demonstraram que o tratamento com honokiol resultou no enriquecimento de células de cancro do pâncreas em G

1 fase, com uma diminuição concomitante no número de células em (fracção proliferativa) da fase S (Figura 2). Observou-se uma diminuição ~1.28, 2,16 e 2,46 (em dobras MiaPaCa) e ~1.08, 1,53 e 1,93 (em dobras Panc1) no número de células em fase S, a 20, 40 e 60 uM doses de honokiol, respectivamente (Figura 2 ). Em ensaios de apoptose, os nossos dados demonstraram um aumento considerável no índice apoptótico (células negativas positivo /anexina V 7AAD PE) de uma forma dependente da dose depois de 24 h de tratamento honokiol (Figura 3). Aos 20, 40 e 60 uM de concentrações honokiol, observamos -1,25, 2,04 e 3,96 dobras aumentar em índices apoptóticos de MiaPaCa e ~1.34, 1,98 e 3,32 dobras aumentar em índices apoptóticos de células Panc1, respectivamente. Em conjunto, os nossos resultados demonstram que tem propriedades tanto honokiol citostáticos e citotóxicos contra células de cancro do pâncreas.

e MiaPaCa Panc1cells (1 × 10

6 células /poço) foram sincronizadas por cultura em meio livre de soro durante 72 h , seguido por incubação em meio contendo soro durante 24 h e o tratamento subsequente com quer honokiol (20, 40 ou 60 uM) ou DMSO (controlo) durante 24 h. Distribuição de células em diferentes fases do ciclo celular foi analisada por iodeto de propídio (PI) seguido de coloração por citometria de fluxo. acumulação aumentada de células MiaPaCa e Panc1 no G

uma fase do ciclo celular foi observada após tratamento com honokiol de uma maneira dose-dependente (tal como indicado pelos histogramas de fluxo) com uma concomitante diminuição em células em fase S.

e células MiaPaCa Panc1 foram cultivadas em placas de 6 poços (1 × 10

6 células /poço) e deixou-se atingir 70-80% de confluência. As células foram tratadas com quer honokiol (20, 40 ou 60 uM) ou DMSO (controlo) durante 24 h e subsequentemente corados com 7-AAD e PE Anexina V seguido por citometria de fluxo. Os quadrantes inferior esquerdo de cada painéis mostram as células viáveis ​​(negativos para ambos, PE anexina V e 7-AAD). Os quadrantes superiores direitos conter células em apoptose necróticas ou tardias (positivos para ambos, PE anexina V e 7-AAD). Os quadrantes inferior direito representam as células em apoptose precoce (PE anexina V positivos e 7-AAD negativo). Os dados mostram um aumento dependente da dose no número de células apoptóticas em ambas as células e MiaPaCa Panc1 após o tratamento com honokiol, em comparação com células de controlo, indicando apoptotis potencial de induzir honokiol.

Honokiol altera a expressão de -ciclo celular e proteínas associadas à sobrevivência

Para investigar o mecanismo de base de efeitos inibidores de crescimento de honokiol, nós próxima examinado o seu efeito sobre a expressão de proteínas-chave envolvidas na proliferação celular e sobrevivência. Os dados revelaram uma diminuição dependente da dose, na expressão de ciclinas D1 e (E) e cinases dependentes de ciclinas (Cdk2 e Cdk4); enquanto que foi observada uma expressão induzida de inibidores de quinases dependentes de ciclina p21 (p27) e após o tratamento honokiol em ambas as células de cancro do pâncreas Panc1 (Figura 4) e MiaPaCa. Entre as proteínas de sobrevivência observou-se uma redução dependente da dose nos níveis de proteína anti-apoptótica de Bcl-2 e Bcl-xL, ao passo que um aumento concomitante no nível de proteína pro-apoptótica foi observada Bax (Figura 5A), levando a um aumento na proporção de Bax /Bcl-2 (Figura 5B, painel superior) e Bax /Bcl-xL (Figura 5B, painel inferior). Estes resultados demonstram que o honokiol altera a expressão de proteínas envolvidas na regulação do ciclo celular e apoptose para conferir o efeito inibidor do crescimento.

células de cancro pancreático (MiaPaCa e Panc1) foram tratados quer com honokiol (20, 40 ou 60 uM) ou DMSO (controlo) durante 24 h. A proteína total foi isolado e submetido a análise de imunotransferência de proteínas associadas a vários ciclos celulares (ciclina D1, ciclina E, Cdk2, Cdk4, p21 e p27). β-actina foi utilizado como um controlo de carga. Intensidades das bandas imunorreactivas foram quantificadas por densitometria. Os valores densitométricos normalizados estão indicados no topo das bandas que exibem uma diminuição dependente da dose, na expressão de ciclina D1, ciclina E, CDK4 e Cdk2 e aumento da expressão de inibidores de ciclina; p21 e p27, após a exposição ao honokiol, em ambos os tipos de células.

e células MiaPaCa Panc1 (A) foram tratados quer com honokiol (20, 40 ou 60 uM) ou DMSO (controlo) para 24 h. A imunotransferência foi realizada para Bcl-XL, Bcl-2 e Bax proteínas seguido de densitometria das bandas imunorreactivas. Os valores densitométricos normalizados estão indicados no topo das bandas. (B) diagrama de barras que resume os efeitos do tratamento honokiol em relação Bax /Bcl-2 (painel superior) e razão de Bax /Bcl-xL (painel inferior). Os dados sugerem que o honokiol induz apoptose por upregulating pró-apoptótica Bax e regular negativamente as proteínas Bcl-2 e Bcl-XL anti-apoptóticas.

Honokiol atenua a activação constitutiva do NF-kB em células de cancro pancreático humano

NF-kB é constitutivamente activo em muitos tipos de cancro, incluindo o cancro pancreático [18] – [20] e demonstrou-se que a activação deste nó de sinalização facilita a progressão do ciclo celular [21] e resistência à apoptose [22 ]. Portanto, foi investigado se o tratamento de células de cancro do pâncreas com honokiol tem um impacto sobre a activação de NF-kB em células de cancro pancreático. Em primeiro lugar, examinou o efeito de honokiol sobre a actividade de transcrição do promotor responsivo a NF-κB- num ensaio de repórter de luciferase. Os nossos dados indicam uma redução dependente da dose na actividade transcricional de NF-kB (~1.40, 2,08 e 4,0 dobras na MiaPaCa, e ~1.29, 1,96 e 5,26 dobras na Panc1 células) aos 20, 40 e 60 uM de tratamento honokiol, respectivamente (Figura 6A). Para apoiar ainda mais esta observação, o próximo estudou a localização celular (citoplasmática vs. nuclear) subunidade p65 de NF-kB. Os nossos dados demonstraram que o tratamento de imunotransferência honokiol causou um decréscimo marcado e dependente da dose nos níveis de NF-kB na fracção nuclear de ambas as células de cancro do pâncreas e MiaPaCa Panc1 com um aumento simultâneo na fracção citoplasmática (Figura 6B). distribuição celular de NF-kB é controlada pela expressão relativa da sua IkB inibidor biológica, que mantém NF-kB sequestrado no citoplasma num complexo inactivo [23]. Portanto, analisamos os extractos citoplasmáticos de células de câncer de pâncreas tratados com honokiol para a determinação do nível de IkB-α. Os nossos dados demonstraram um aumento dependente da dose no nível do IkB-α sobre honokiol-tratamento (Figura 6B). Isto foi associado com uma diminuição concomitante na fosforilação de IkB-α indicando um aumento da estabilização da IkB-α após exposição a honokiol. Em conjunto, os nossos dados indicam que honokiol suprime a activação constitutiva do NF-kB em células de cancro pancreático.

(A) e MiaPaCa Panc1cells (0,5 × 10

6 células /poço) foram semeadas em placa de 12 poços . No dia seguinte a 60% de confluência, as células foram co-transfectadas com repórter de luciferase de NF-kB e TK-Renilla luciferase (controlo) plasmídeos. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram tratadas com honokiol (20, 40, ou 60 | iM) para o próximo 24 h. Os lisados ​​de proteína foram feitas e luciferase (mosca-fogo; teste e de Renilla, o controlo da eficiência de transfecção) actividade avaliada utilizando um sistema de ensaio de luciferase dupla. Os dados são apresentados como normalizada dobra-mudança na actividade da luciferase (média ± SD; n = 3, * P 0,05). (B) total, extractos nucleares e citoplasmáticos foram preparados a partir de células tratadas com honokiol (20, 40, ou 60 | iM) durante 6 h e a expressão de NF-kB /p65, p-IkB-α (S32 /36) e IκB- α foi determinado por análise de Western blot. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. Intensidades das bandas imunorreactivas foram quantificadas por densitometria. Os valores densitométricos normalizados estão indicados no topo das bandas indicando uma localização de diminuição de NF-kB /p65 no núcleo com um aumento concomitante no citoplasma. Em contraste, a expressão de p-IkB-α foi reduzida levando ao aumento dos níveis de IkB-α. Em conjunto, esses dados sugerem claramente que honokiol inibe a atividade de NF-kB através da estabilização da IkB-α.

Honokiol chemosensitizes as células cancerosas do pâncreas para toxicidade gemcitabina

A gemcitabina é o único FDA aprovado quimioterápico contra o câncer de pâncreas; No entanto, continua a ser minimamente eficaz devido à quimiorresistência [3], [5], [10]. Uma vez que a activação de NF-kB é considerado como um dos mecanismos potenciadores quimiorresistência, nós examinamos se honokiol agiria como um chemosensitizer em células de cancro pancreático. células de cancro pancreático (MiaPaCa e Panc1) foram tratados com isoladamente ou em combinação com gemcitabina a sub-IC

50 concentrações de honokiol e efeito sobre a inibição do crescimento foi examinada utilizando um ensaio de viabilidade celular. Os nossos dados demonstraram que a gemcitabina inibiu o crescimento de células de cancro do pâncreas de uma forma dependente da dose e o tratamento combinado com honokiol levou a uma redução significativa no IC

50 de gemcitabina (Figura 7A). Aos 10 e 20? M doses de honokiol, respectivamente, um ~1.53 e 2,41 vezes (em MiaPaCa) e ~1.40 e 2,08 vezes (em Panc1) diminuição IC

foi observada 50 de gemcitabina significando o efeito quimio-sensibilização de honokiol (Figura 7A). Para identificar um papel do NF-kB, examinámos a sua localização celular em gemcitabina (sozinho ou em combinação com honokiol) tenha sido tratada com células de cancro do pâncreas. Os nossos dados exibidos uma acumulação aumentada de NF-kB, no compartimento nuclear e uma diminuição concomitante na fracção citoplasmática com doses crescentes de gemcitabina em ambas as células Panc1 (Figura 7B) e MiaPaCa. Notavelmente, observou-se que o honokiol (mesmo na dose de 20 | iM) foi eficaz na inibição da activação induzida por gemcitabina de NF-kB tanto em células MiaPaCa e Panc1 (Figura 7C). Estes resultados sugerem claramente que o honokiol potencia a eficácia antitumoral de gemcitabina, agindo como um quimio-sensibilizador em células de cancro pancreático.

e células MiaPaCa Panc1 (A) foram cultivadas em placas de 96 poços de microtítulo (1 × 10

4 células /cavidade). Na sub-confluência, as células foram tratadas com gemcitabina (1,25-40? M) sozinho ou em combinação com honokiol (10 ou 20 fiM) durante 48 h. percentagem de viabilidade foi medida por ensaio de WST-1. Os dados são apresentados como percentagem relativa de viabilidade com respeito às células não tratadas ou tratadas apenas honokiol-para controlar os efeitos supressivos de crescimento honokiol (média ± SD; N = 3. *, P 0,05). Uma diminuição significativa no IC foi observado

50 valores de gemcitabina em células co-tratados com honokiol. (B) As células foram tratadas com gemcitabina (5, 10 e 20 | iM) durante 6 h e a expressão de NF-kB /p65 em nucleares, citoplasmáticos e lisados ​​de células totais foi determinada por análise de Western blot. tratamento Gemcitabina de células resultou na acumulação nuclear aumentada de NF-kB /p65 de um modo dependente da dose extractos citoplasmáticos (C) nuclear e foram preparados a partir de células tratadas com gemcitabina (10 uM), honokiol (20 uM), isoladamente ou em combinação para seis h. A expressão de NF-kB /p65 em lisados ​​de células nucleares, citoplasmáticos e totais foi determinada por análise de Western blot. Os dados mostram que a co-tratamento honokiol restrito acumulação nuclear /p65 NF-kB induzida por gemcitabina. Juntos, estes resultados sugerem que honokiol age como um chemosensitizer e aumenta os efeitos citotóxicos de gemcitabina no cancro pancreático.

Discussão

O câncer de pâncreas continua a ser uma doença maligna devastadora devido à falta de uma terapia eficaz para o tratamento de [3]. O presente estudo demonstrou que honokiol (um composto biphenolic natural) é eficaz na supressão do crescimento de células de cancro pancreático humano (MiaPaCa e Panc1) devido às suas propriedades citostáticas e citotóxicas. Além disso, nossos estudos forneceram evidências para um papel de honokiol na quimio-sensibilização das células de câncer de pâncreas à toxicidade gemcitabina. Honokiol inibiu a atividade de NF-kB e causou expressão alterada de ciclo celular muitos e proteínas associadas à sobrevivência para conferir sua supressiva crescimento e efeitos quimio-sensibilizadores em células de câncer de pâncreas.

crescimento desregulada em células cancerosas é muitas vezes atribuída à perda de controle em vias proliferativas e apoptóticos [24]. Na verdade, os estudos moleculares revelaram que a expressão de reguladores do ciclo celular e proteínas associadas com a sobrevivência das células é frequentemente alterados em vários cancros humanos [25] – [27]. ciclo celular é regulada por acções concertadas de ciclinas, quinases dependentes de ciclina (CDKs) e inibidores de Cdks [26], [28]. Observou-se que o tratamento de células de cancro do pâncreas com honokiol resultou em G

prisão 1-fase de progressão do ciclo celular, juntamente com a redução da ciclina D1, ciclina E, Cdk2 e Cdk4 e aumento na p21 e p27 ao nível da proteína. Ciclina D1 e seu parceiro catalítico Cdk4 dominar em L

1 fase, enquanto que, a ciclina complexo Cdk2 E e regula a progressão do ciclo celular da G

1 a S [26], [28]. Portanto, nossos resultados indicam que a prisão induzida por honokiol de células de câncer de pâncreas em L

fase do ciclo 1 célula pode ser mediada através da regulação negativa de ciclinas e Cdks juntamente com a regulação positiva de proteínas p21 e p27, que formam complexos heterotriméricas com G

1 S-Cdks ciclinas e para inibir a sua actividade [29]. Estes resultados estão de acordo com estudos anteriores sobre o efeito da honokiol na leucemia linfóide humana, células escamosas cancro do pulmão e cancro da mama [16], [17], [30].

Na sequência G

1- fase de paragem do ciclo celular, as células podem ser submetidos a reparação ou a entrar na via apoptótica para manter a integridade celular e eliminação de células pré-malignas e neoplásicas mutadas errou /[31]. Assim, a indução de apoptose é um dos mecanismos de protecção contra o cancro e células de iniciação e progressão do cancro, muitas vezes a resistência adquirida à apoptose [24]. No presente estudo, observou-se uma indução significativa de apoptose em células de cancro do pâncreas tratados com honokiol honokiol indicando que é capaz de potenciar a maquinaria apoptótica. A sobrevivência das células é mantida por um bom equilíbrio das proporções de pró-apoptótica (por exemplo, Bad e Bax) e proteínas anti-apoptóticas (por exemplo, Bcl-2 e Bcl-XL), que controlam o processo da apoptose através da libertação de caspases [ ,,,0],32], [33]. Portanto, expressão alterada das proteínas da família Bcl-2 observados após tratamento honokiol de células de cancro do pâncreas de uma forma que favorece o aumento nas razões de Bax /Bcl-2 e Bax /Bcl-xL podia subjacentes ao efeito apoptótico observada de honokiol. A desregulação de proteínas relacionadas com a apoptose também foi avaliado em células de condrossarcoma de após o tratamento honokiol apoiando ainda mais o seu papel na indução de apoptose [34].

Observou-se também a inibição da actividade de NF-kB após tratamento honokiol, o que foi associado com inibição da fosforilação de IkB-α e aumento concomitante na sua expressão. factor de transcrição NF-kB é activado constitutivamente em várias malignidades e tem sido relatada a ser patologicamente implicado no cancro pancreático [18] – [20]. Estudos recentes têm mostrado que o efeito supressor de crescimento-honokiol em cancros da próstata e do cólon é mediado através da inibição de NF-kB [35]. O factor de transcrição NF-kB é composto por heterodímeros constituídos por Rel (p65, c-Rel e RelB), p52, e as proteínas p50 e está localizada no citoplasma, na sua forma inactiva, em complexo com IkB (inibidor de NFkB que consiste em α e β subunidades que mascara o sinal de localização nuclear [36]. a activação do NF-kB é causado, quando IkB-α fica fosforilado pela IKK (inibidor de quinase) complexa que conduz à sua ubiquitinação e degradação. Isto resulta na libertação de NFkB do citoplasma e o transporte para o núcleo seguido por activação do promotor de NF-kB-responsivas. NF-kB é conhecida por induzir a expressão de ciclina D1, Bcl-2 e Bcl-xL (alterados após tratamento honokiol no estudo corrente), juntamente com uma matriz de proteínas envolvidas na proliferação celular e sobrevivência [37], [38]. por conseguinte, pode ser sugerido que a supressão do crescimento de células de cancro do pâncreas por honokiol é mediado através da inibição de NF-kB.

resultado clínico em câncer pancreático tem permanecido fraco devido ao estado avançado e metastático da doença no momento do diagnóstico e ineficácia do fármaco-terapêutica permitida devido à chemoresistance [3], [5], [10]. Atualmente, a gemcitabina é o quimioterápico padrão nacional para o tratamento do câncer pancreático. A gemcitabina interfere com a síntese de ADN conduz a paragem do ciclo celular e a apoptose em curso final [39], [40]. Um dos mecanismos que limita a eficácia gemcitabina é induzido a activação de NF-kB em resposta ao seu tratamento [41], o que pode causar atrasos apoptótica ou supressão. Neste estudo, nós mostramos efeito quimio-sensibilização de honokiol em células de câncer de pâncreas à toxicidade gemcitabina. Além disso, mostrámos que o tratamento com gemcitabina induzida acumulação nuclear de NF-kB, que poderia ser eficazmente inibida por co-tratamento com honokiol. Estes resultados paralelas indicam que a inibição da actividade de NF-kB pode também mediar a quimiossensibilização de células de cancro do pâncreas por honokiol. Na verdade, tem sido relatado anteriormente que os efeitos anti-cancro de agentes quimioterapêuticos podem ser potenciados pela inibição da actividade de NF-kB [22], [41].

Em conclusão, mostrámos pela primeira vez , o inibidor do crescimento e do potencial de quimio-sensibilização de honokiol em câncer pancreático. Honokiol provoca L

paragem do ciclo celular e uma fase de indução de apoptose através da alteração da expressão de proteínas do ciclo celular e sobrevivência associado. Inibição de NF-kB pode ser um dos mecanismos importantes em supressora do crescimento induzida por quimio-sensibilizadores honokiol e efeitos em células de cancro do pâncreas. Portanto, acreditamos que honokiol poderia ser um romance agente natural promissor para o tratamento de câncer de pâncreas e também pode servir como um chemosensitizer para melhorar a eficácia terapêutica da gemcitabina, que já está em uso clínico como uma droga terapêutica.

materiais e Métodos

Reagentes

meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e Roswell instituto parque memorial (RPMI-1640) meio foram obtidos a partir de Thermo Scientific (Logan, UT). Fetal-soro bovino (FBS) foi de Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA). A penicilina, estreptomicina e tripsina-EDTA foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA). Honokiol foi obtido a partir de LKT Laboratories (St. Paul, MN). Gemcitabina foi fornecida por USAMCI farmácia. FuGENE reagente de transfecção, fosfatase /de inibidores de protease e a proliferação de células de reagente WST-1 foram adquiridos a partir de Roche Diagnostics (Mannheim, Alemanha). O iodeto de propídio /ARNase tampão de coloração e kit de detecção de apoptose Anexina V PE foram adquiridos a BD Bioscience (San Diego, CA). kit extracto nuclear foi obtido a partir do Active Motif, LLC (Carlsbad, CA). Os anticorpos contra Bcl-2, Bax e p-IkB-α (Ser32 /36) (policlonal de coelho), Bcl-XL e NF-kB /p65 (anticorpo monoclonal de coelho), e IkB-α (monoclonal de ratinho) foram obtidos a partir de Cell Signaling tecnologia (Beverly, MA). Os anticorpos contra p21, Cdk4 (monoclonal de ratinho), p27, ciclina D1, ciclina E, Cdk2 (policlonal de coelho), e anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). p-actina (monoclonal de ratinho) de anticorpo foi adquirido de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). ECL plus kit de detecção de western blot foi obtido a partir de Thermo Scientific. pGL4.32 plasmídeo [luc2P /NF-kB OD /Hygro], plasmídeo pRL-TK e kit de ensaio de luciferase duplo Sistema eram de Promega (Madison, WI).

cultura celular e tratamentos

As linhas de células de pâncreas humano MiaPaCa e Panc1 (ATCC, Manassas, VA) foram mantidas em cultura como monocamadas aderentes em meio RPMI-1640 e DMEM, respectivamente, suplementado com 10% (v /v) de FBS, penicilina (100 unidades /ml) e estreptomicina (100 ug /mL). As células foram mantidas em 5% de CO

2 incubadora humidificada a 37 ° C. O meio de crescimento foi trocado a cada três dias e as células foram divididas (01:03) quando atingiram 80% de confluência. Para tratamentos, solução de estoque de honokiol (10 mmol /L) foi preparada em DMSO, armazenado a -20 ° C, e diluiu-se com meio completo fresco imediatamente antes da utilização. As células foram tratadas com várias concentrações de honokiol sozinho, gemcitabina sozinha ou em combinação (como especificado nas legendas das figuras). Um volume igual de DMSO (concentração final, 0,1%) foi adicionada ao controlo

crescimento celular ensaio

As células foram semeadas em placas de 96 poços (1 × 10

4. células /poço) um dia antes do tratamento. A viabilidade celular das células tratadas foi examinada após 24-72 h, usando WST-1 (4- [3- (4-iodofenil) -2- (4-nitrofenil) -2H-5-tetrazolio] -1, 3-benzeno di-sulfonato) kit de ensaio de acordo com as instruções do fabricante, com os controlos apropriados. Este ensaio baseia-se na clivagem de WST-1 em células metabolicamente activas para formar formazano solúvel em água. A absorvência do formazano foi medida a um comprimento de onda de 450 nm, com subtracção de fundo a 630, usando um leitor de microplacas de Referência da Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). O crescimento foi calculada como a percentagem de viabilidade = [(A /B) x 100], onde A e B são a absorvância de células tratadas e de controlo, respectivamente.

-ciclo celular análise

O efeito de tratamento honokiol na progressão do ciclo celular foi determinada por citometria de fluxo, após coloração com iodeto de propídio (PI). Em resumo, células (1 x 10

6 células /poço) foram semeadas em placa de 6 e sincronizado através da sua cultura em meio isento de soro. Após 48 h, o meio foi substituído com meio completo contendo as concentrações desejadas de honokiol ou DMSO. células flutuantes e ligados foram recolhidos após 24 h de tratamento e fixadas em etanol a 70% durante a noite a 4 ° C. As células foram então coradas com iodeto de propídio, usando tampão de coloração de PI /RNase durante 1 h a 37 ° C. As células coradas foram analisadas por citometria de fluxo em um BD-FACS Canto ™ II (Becton-Dickinson, San Jose, CA) para calcular a percentagem de população de células em diferentes fases do ciclo celular utilizando um software Mod Fit LT (Verity Software House, Topsham