Sumário
Fundo
O retinóide 4-oxo-N- (4-hidroxifenil) retinamida (4-oxo-4-HPR) é um metabolito polar de fenretinida (4-HPR ) muito eficaz para matar células cancerosas de diferentes histotipos, capazes de inibir o crescimento de células resistentes 4-HPR-e para actuar sinergicamente em combinação com o fármaco original. Ao contrário de 4-HPR e outros retinóides, 4-oxo-4-HPR inibe a polimerização da tubulina, levando à formação do fuso multipolar e paragem da mitose. Aqui investigámos se 4-oxo-4-HPR, como 4-HPR, desencadeada a morte celular também através de espécies reactivas de oxigénio (ROS) geração e se a sua actividade antimicrotúbulo foi relacionado com um mecanismo de ROS-dependente no ovário (A2780), mama ( T47D), cervical (HeLa) e neuroblastoma (SK-N-BE) linhas celulares de cancro.
Metodologia /Principais achados
Nós forneceram evidências de que 4-oxo-4-HPR, além de ator como um agente antimicrotúbulo, a apoptose induzida através de uma cascata de sinalização a partir de geração de ROS e envolvendo resposta de stress do retículo endoplasmático (ER), activação de Jun N-terminal quinase (JNK), e regulação positiva da proteína morfogenética do osso placentária pró-apoptótica (PLAB). Através de análise de tempo-curso e a inibição da via de sinalização relacionados com a ROS (a montante pela vitamina C e a jusante por silenciamento PLAB), demonstrou-se que a actividade anti-mitótico de 4-oxo-4-HPR era independente do stress oxidativo induzido pelo retinóide . De facto, a produção de ROS ocorreu mais cedo do que a paragem da mitose (dentro de 30 minutos e 2 horas, respectivamente) e revogação da via de sinalização relacionados com ROS não impediu a paragem da mitose induzida por 4-oxo-4-HPR.
Conclusões /Significado
Estes dados indicam que a 4-oxo-4-HPR actividade anti-cancro é devido a, pelo menos, dois mecanismos independentes e fornecer uma explicação sobre a capacidade de 4-oxo-4-HPR ser mais potente do que o fármaco original e para ser eficaz também em linhas de células resistentes 4-HPR-. Além disso, o mecanismo de acção dupla pode permitir 4-oxo-4-HPR para alvejar de forma eficiente do tumor e, eventualmente, para contrariar o desenvolvimento da resistência aos medicamentos
citação:. Tiberio P, Cavadini E, Abolafio G, F Formelli , Appierto V (2010) 4-oxo-N- (4-hidroxifenil) retinamida: Duas maneiras independentes para matar células cancerosas. PLoS ONE 5 (10): e13362. doi: 10.1371 /journal.pone.0013362
editor: Andrei L. Gartel, Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América
Recebido: 9 de julho de 2010; Aceito: 20 de setembro de 2010; Publicação: 14 de outubro de 2010
Direitos de autor: © 2010 Tiberio et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O estudo foi apoiado por subsídios da Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (https://www.airc.it), Milão, Itália, através de subsídios e uma bolsa (P. Tiberio). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Os retinóides são uma classe de compostos químicos estruturalmente relacionados com a vitamina a que modulam processos celulares fundamentais, incluindo a proliferação celular, a diferenciação e a apoptose [1]. O retinóide sintético ou fenretinida retinamida N- (4-hidroxifenil) (4-HPR) é um análogo não tóxico de ácido all-trans retinóico [2] que já mostrou resultados promissores em pré-neoplásicas [3] – [5] e condições neoplásicas [6], [7]. Em células em cultura, 4-HPR tem sido demonstrado que induzem a inibição do crescimento e apoptose em várias linhas celulares de cancro e diferentes mecanismos de acção têm sido propostos, incluindo a geração de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e o stress oxidativo consequente [8], [9 ]. Temos recentemente relatado que em células de cancro do ovário, a apoptose induzida por 4-HPR é mediada pela pró-apoptótica proteína morfogenética placentária osso (PLAB) e que a sua regulação positiva por 4-HPR ocorre através da activação de uma cascata de sinalização a partir de aumento de geração de ROS , conduzindo à indução de retículo endoplasmático (ER) resposta ao stress e activação de Jun N-terminal quinase (JNK) [9], [10]. A partir da análise de amostras de plasma de pacientes de 4-HPR-tratados, identificámos um novo metabolito polar 4-HPR, 4-oxo-N- (4-hidroxifenil) retinamida (4-oxo-4-HPR) [11], que é dotado de propriedades biológicas promissoras [12]. 4-oxo-4-HPR provoca efeitos apoptóticos e anti-proliferativa em várias linhas celulares de cancro do ovário (isto é, linhas, e de células do tumor da mama do neuroblastoma) e é duas a quatro vezes mais eficaz do que o 4-HPR na inibição do crescimento de células [12]. Curiosamente, 4-oxo-4-HPR também é eficaz em células resistentes 4-HPR-e, em combinação com 4-HPR, tem um efeito sinérgico [12]. Do mesmo modo a 4-HPR, os efeitos inibidores do crescimento de tumor de 4-oxo-4-HPR são independentes de receptores de retinóides nucleares (RAR). Além disso, 4-HPR e 4-oxo-4-HPR partilham vários intermediários de sinalização, tais como a produção de ROS, aumento dos níveis intracelulares de ceramida e activação da caspase-3 e caspase-9 [12]. Despites estas semelhanças, 4-oxo-4-HPR parece ter mecanismos adicionais de acção em comparação com o fármaco parental, também sugerido pela sua capacidade de ser eficaz em 4-HPR células resistentes a [12]. Na verdade, ao contrário de 4-HPR, 4-oxo-4-HPR provoca uma acumulação acentuada de células em fase de mitose, especificamente no pré-anafase, juntamente com a activação do posto de controle do fuso [13]. O 4-oxo-4-HPR-induzida prisão na mitose está associada com a formação do fuso aberrantes (ou seja, organização multipolar, sem perda da integridade do centrossoma), devido à capacidade de 4-oxo-4-HPR para segmentar os microtúbulos e inibe a polimerização da tubulina através de uma interação molecular direta com a tubulina [13] .O presente estudo foi planejado para dissecar ainda mais os mecanismos de 4-oxo-4-HPR de ação subjacente seu efeito anti-proliferativo, investigando se a actividade anti-cancerígena do retinóide pode surgir também da sua capacidade de aumentar a produção de ROS e se a actividade antimitótica do retinóide está relacionada com o stress oxidativo. Temos aqui demonstrado que, tal como 4-HPR, 4-oxo-4-HPR provoca um aumento de geração de ROS, seguida por indução de resposta ER estresse, a activação de JNK e PLAB regulação positiva e que esta cascata de sinalização é parcialmente envolvido no efeito antiproliferativo do retinóide. Além disso, o efeito anti-mitótico 4-oxo-4-HPR é funcionalmente independente da cascata apoptótica acima referido, indicando assim que a 4-oxo-4-HPR efeito antitumoral é devido a, pelo menos, dois mecanismos independentes de acção.
resultados
geração de ROS participa na apoptose 4-oxo-4-HPR-induzida em células A2780
Temos recentemente relatado que o 4-HPR desencadeia a apoptose através da activação de uma cascata de sinalização que começa a partir de ROS geração e que envolve as respostas ao estresse ER, activação JNK e PLAB regulação positiva [9]. Para investigar se a cascata de sinalização responsáveis pela apoptose induzida por 4-HPR também estava envolvida na apoptose induzida por 4-oxo-4-HPR, analisou-se primeiro o envolvimento de geração de ROS na apoptose induzida por 4-oxo-4-HPR em A2780, uma linha de células de carcinoma do ovário humano, escolhido porque ele já é conhecido por ser sensível ao retinóide (IC
50 = 0,6 uM num ensaio de 72 horas) e para gerar ROS em resposta a 4-oxo-4- tratamento HPR [12]. O envolvimento de produção de ROS foi determinada por avaliação do efeito do anti-oxidante da vitamina C, em 4-oxo-4-HPR induzida por apoptose. Cinco tratamento uM 4-oxo-4-HPR durante 4 horas provocou um aumento da produção de ROS, que foi evitada através da adição de 100 ^ M de vitamina C (Figura 1A). Revogação de geração de ROS por vitamina C causou uma redução (1,7 vezes) sobre a apoptose 4-oxo-4-HPR-induzida, avaliada como a fragmentação de ADN por um ensaio de ELISA (Figura 1B). Uma redução de apoptose semelhante foi observado através da determinação de sub-G
1 população por coloração com iodeto de propídio seguido por citometria de fluxo (ver Figura 5 e n.º resultado relativo). Estes dados sugerem que a produção de ROS induzidas por 4-oxo-4-HPR estava envolvida na apoptose induzida por 4-oxo-4 HPR.
(A) Análise da produção de ROS em células A2780 tratada durante 4 horas com 5 uM 4-oxo-4-HPR, com ou sem 100 uM vitamina C. a análise foi realizada por citometria de fluxo após a adição do corante sensível a redox CM-H
2DCFDA. O gráfico mostra o fluxo de citometria representante perfis de fluorescência em diferentes condições de tratamento (uma experiência representativa de três). A mudança para a direita do controle indica aumento níveis de ROS. (B) As células A2780 foram tratadas durante 24 horas com 5 uM 4-oxo-4-HPR, com ou sem 100 uM vitamina C e apoptose, avaliada como a fragmentação de ADN, foi medida por um ensaio ELISA. Os dados são médias de três experiências independentes; barras verticais são desvios-padrão. Asterisco indica diferença significativa (P 0,05).
4-oxo-4-HPR induz resposta ER estresse em células A2780
Nós analisamos se 4-oxo-4-HPR, como 4-HPR [9], activado, a jusante da geração de ROS, uma resposta ER stress, através da avaliação de sinais específicos do ER-stress: a splicing pós-transcricional do factor de transcrição de ligação proteína-1 (a XBP-1) X-box, a expressão das proteínas chaperon proteína regulada por glucose de 78 kD (GRP-78) /proteína de ligação a imunoglobulina (BIP) e a proteína de choque térmico 70 (HSP70), e o estado de fosforilação da subunidade alfa de eucariota fator de iniciação 2 ( eIF2α) [14]. Em células A2780, 5 tratamento uM 4-oxo-4-HPR durante 24 horas induziu o splicing de um intrão de 25 pb a partir do ARNm precursor da XBP-1, causou a regulação positiva de GRP78 /Bip e HSP70 e fosforilação de eIF2α (Figura 2A). A activação destes eventos associados ao stress ER foi revogada (XBP-1, GRP78 /Bip e HSP70) ou fortemente reduzida (eIF2α) pela adição de vitamina C (Figura 2A). células A2780 Os resultados indicaram que a 4-oxo-4-HPR causada indução da resposta ao estresse ER, como um evento a jusante da geração de ROS.
(A) tratadas durante 24 horas com 5 uM 4-oxo-4-HPR , com ou sem 100 uM vitamina C, foram submetidos a ensaio de RT-PCR para analisar o splicing do intrão de 25 pb a partir da XBP-1 de transcrição e análise de western blot para a expressão de GRP-78 /Bip, peIF2α, eIF2α. Para a transcrição reversa-PCR, β-actina foi amplificada como controlo interno. Para a análise de Western Blot, como um controlo para a carga, a mancha foi incubada com o anticorpo actina. (B) As células tratadas como em (A) foram sujeitos a análise de Western blot para a expressão de JNK e pJNK.
4-oxo-4-HPR induz a activação da JNK nas células A2780
Nós analisamos se 4-oxo-4-HPR, como 4-HPR [9], induziu a ativação de JNK. A análise de Western blot, em células A2780, mostraram que o tratamento 5 uM 4-oxo-4-HPR durante 24 horas provocou fosforilação de JNK e que a adição de vitamina C reduziu fortemente a activação da cinase (Figura 2B). Os dados indicaram que o 4-oxo-4-HPR induziu a activação de JNK e que esse evento ocorreu por meio de um mecanismo de ROS-dependente.
upregulation PLAB é funcionalmente envolvidos na apoptose induzida por 4-oxo-4-HPR
relataram anteriormente que é regulada positivamente pela PLAB 4-HPR de um modo dependente ROS [9], e que desempenha um papel funcional na apoptose induzida pelo retinóide em células A2780 [10]. Nós, portanto, avaliamos se a expressão PLAB também 4-oxo-4-HPR modulada. A análise de transferência de Western mostrou que o tratamento 5 uM 4-oxo-4-HPR durante 24 horas induzidas PLAB regulação positiva e que este efeito foi fortemente reduzida pela adição de vitamina C (Figura 3A). Para investigar se PLAB upregulation desempenhou um papel funcional na apoptose induzida pela 4-oxo-4-HPR, aproveitamos silenciamento PLAB em células A2780, previamente gerado por transfecção estável [10]. Como esperado, PLAB upmodulation induzida por 4-oxo-4-HPR foi fortemente reduzida em células transfectadas com o plasmídeo PLAB siARN em comparação com células transfectadas com um plasmídeo mexidos utilizado como controlo (Figura 3B). Como mostrado na Figura 3C, a apoptose induzida por 4-oxo-4-HPR em células transfectadas com ARNsi PLAB foi de aproximadamente duas vezes reduzida em relação às células transfectadas com o plasmídeo codificado. A redução da apoptose induzida por 4-oxo-4-HPR em células PLAB silenciados também foi confirmada pela avaliação dos sub-L
uma população, após coloração com iodeto de propídio (dados não mostrados). Os resultados demonstraram que o 4-oxo-4-HPR induzida PLAB regulação positiva como um evento a jusante da produção de ROS e que contribuiu para PLAB 4-oxo-4-HPR induzida por apoptose. Todos os dados acima sugerem que 4-oxo-4-HPR causou a activação da cascata de sinalização relacionados com ROS já mostrada para ser activado pelo 4-HPR (ROS → ER estresse → JNK → PLAB) [9].
(a) análise de transferência de Western para a expressão em células A2780 PLAB tratadas durante 24 horas com 5 uM 4-oxo-4-HPR, com ou sem 100 uM vitamina C. Como um controlo para o carregamento, a mancha foi incubada com o anticorpo actina . (B) Análise de transferência de Western para a expressão em células A2780 PLAB estavelmente transfectadas com um plasmídeo contendo um siARN ou PLAB um mexidos nonsilencing siARN a seguir à adição de 5 uM 4-oxo-4-HPR durante 24 horas. Como um controlo para o carregamento, a mancha foi incubada com o anticorpo actina. apoptose (C) Detecção de 4-oxo-4-induzida HPR em A2780 transfectadas de forma estável com um plasmídeo contendo um PLAB siRNA (colunas pretas) ou um ARNsi nonsilencing mexidos (colunas cinzentas). As células transfectadas foram tratadas durante 24 horas com 5 uM 4-oxo-4-HPR e apoptose, avaliada como a fragmentação de ADN, foi medida por um ensaio ELISA. Os dados são médias de quatro experiências independentes; barras verticais são desvios-padrão. Asterisco indica diferença significativa (P 0,01).
4-oxo-4-HPR induz Bcl-2 e Mcl-1 downregulation em um
forma ROS-independente
Uma vez que tem foi relatado que o 4-HPR podem induzir apoptose através da regulação dos membros da família Bcl-2, como um evento a jusante da geração de ROS [15] – [17], analisou-se o efeito de 4-oxo-4-HPR sobre as proteínas anti-apoptóticas gene 2-linfoma de células B (Bcl-2) e células mielóides leucemia-1 (Mcl-1) e a proteína X na proteína pró-apoptótica de Bcl-2-associado (Bax). Em células A2780, 5 uM de tratamento 4-oxo-4-HPR durante 24 horas provocou um decréscimo do nível de expressão de Bcl-2 e de Mcl-1 de proteína, ao passo que não tinha efeito na expressão do Bax (Figura S1). A infra-regulação de ambos Bcl-2 e de Mcl-1 não foi evitada através da adição de vitamina C (Figura S1), sugerindo assim que a 4-oxo-4-HPR causou uma tal diminuição de um modo ROS-independente.
mitótico prisão e a formação de fusos multipolares são independentes relacionados com ROS cascata de sinalização em células A2780
Contrariamente ao 4-HPR, que afecta apenas ligeiramente o G
uma fase do ciclo celular, 4- oxo-4-HPR provoca uma acumulação acentuada de células em fases L
2-M [12]. Nós relataram recentemente que induzida por 4-oxo-4 HPR perturbação do ciclo celular foi devido à capacidade de o retinóide para inibir a polimerização da tubulina, células prender na mitose [13]. Além disso, foi demonstrado o efeito antimitótico do retinóide a ser acoplado com a formação de fusos em forma aberrante (i.e. multipolars) devido aos seus efeitos sobre a polimerização da tubulina [13]. Para investigar se a paragem da mitose induzida 4-oxo-4-HPR ea formação de fusos multipolares foram relacionados com a cascata de sinalização induzida ROS nós primeira realizada uma análise tempo-curso de ambos geração e ciclo celular perturbação ROS induzidos por 4- oxo-4-HPR. geração de ROS foi observado tão cedo quanto 30 minutos após o tratamento retinóide (Figura 4A) e permaneceu durante todo o tempo de curso de 24 horas. Em contraste, uma ligeira L
acumulação de células 2-M foi observada apenas em 2 horas e o aumento da percentagem de G
2-M foi preso células até 16-24 horas dependente do tempo (Figura 4B) . A análise tempo-curso assim revelado que o stress oxidativo induzido por 4-oxo-4-HPR ocorreu mais cedo do que a paragem do ciclo celular e que os dois eventos apresentaram diferentes cinéticas. Para investigar se a geração de ROS induzida por 4-oxo-4 HPR desempenhado um papel na paragem da mitose, foram analisados os efeitos da vitamina C na perturbação do ciclo celular e formação de fusos anormais induzidos pelo retinóide. Em células A2780 expostas durante 24 horas a 5 uM 4-oxo-4-HPR, a adição de 100 uM de vitamina C não impedir a acumulação de L
2-H população de células (Figura 5 e S2) ou a formação de fusos multipolares (Figura 5). resultados consistentes na distribuição do ciclo celular e a formação de fusos multipolares foram obtidos por inibição da cascata de sinalização relacionados com ROS a um nível a jusante por meio de silenciamento PLAB: transfecção com PLAB siRNA não impediu a paragem da mitose induzida por 4-oxo-4-HPR e formação de fusos multipolares (dados não mostrados). Análise Os resultados indicaram que em células A2780, a paragem da mitose induzida por 4-oxo-4-HPR foi nem um evento a jusante da geração de ROS, nem um passo da cascata de sinalização relacionados com ROS.
(A) de produção de ROS em células A2780 tratadas com 5 uM 4-oxo-4-HPR durante 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 16 horas e 24 horas. A análise foi realizada por citometria de fluxo após a adição do corante sensível a redox CM-H
2DCFDA. Os gráficos mostram o fluxo de citometria representante perfis de fluorescência em diferentes condições de tratamento (uma experiência representativa de três). A mudança para a direita do controle indica aumento níveis de ROS. (B) análise de citometria de fluxo de células A2780-coradas com iodeto de propídio tratados veículo ou 5 uM 4-oxo-4-HPR durante 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 16 horas e 24 horas. Os números na figura indicam a percentagem de células na fase do ciclo celular, de acordo com a análise realizada com o software ModFit LT. representante Um experimento de três é mostrado.
citometria de fluxo e células A2780 manchado de iodeto de propídio tratadas durante 24 horas com 5 � 4-oxo-4-HPR com ou sem 100 mM de vitamina C. Números na figura indicam a percentagem de células na fase do ciclo celular, de acordo com a análise realizada com o software ModFit LT. Um representante experimento de três é mostrado. À direita está representado imagem de células mitóticas um representante para cada tratamento, obtido por imunocoloração com anticorpo α-tubulina (
verde) e coloração nuclear com Hoechst 33342 (
azul e). Barra de escala = 5 mm.
4-oxo-4-HPR atua através de um duplo mecanismo de ação também em linhas celulares de cancro de histotipos diferente
Para determinar se o envolvimento do dois mecanismos independentes da actividade-4-HPR 4-oxo foi restrita a células A2780 ou representado o modo distinto de acção do retinóide, estendemos a análise de 4-oxo-4-HPR efeitos para outros três linhas de células de cancro humano responsivo a o retinóide: células SK-N-BE (neuroblastoma) (Figura 6A) T47D (adenocarcinoma mamário), HeLa (adenocarcinoma cervical epitelial) e. O primeiro avaliada a geração intracelular de ROS induzidas por 4-oxo-4-HPR mostrando que, nas linhas celulares de três cancerosas, 5 uM 4-oxo-4-HPR durante 4 horas aumentou a produção de ROS em relação aos controlos e que a adição de 100 uM vitamina C inibiu a geração de ROS induzidos por retinóide (Figura 6B). Nas três linhas celulares testadas, 4-oxo-4-HPR tratamento induziu upregulation PLAB e este efeito foi reduzido pela adição de vitamina C (Figura 6C). Em seguida, realizada a análise do ciclo celular mostra que o tratamento com 4-oxo-4-HPR induziu um L
2-H paragem do ciclo celular marcada em todas as linhas celulares tumorais testadas (Figura 7 e S2). De modo semelhante ao que observado em células A2780, nestas linhas celulares a inibição da geração de ROS com vitamina C causou uma redução acentuada da sub-L
uma população, mas não reduziu a percentagem de células paradas em G
2- fase M (Figura 7 e S2). formação Além disso, 4-oxo-4-HPR tratamento causou de fusos multipolares em T47D, HeLa e SK-N-BE células (Figura 7), e em todos eles a adição de vitamina C não impedir a formação de fusos aberrantes induzidas por o retinóide (Figura 7). Os resultados sugerem que, também em T47D, HeLa e SK-N-BE células, a cascata de sinalização dependente de ROS foi envolvidas em apoptose-4-oxo-4 induzida HPR. paragem do ciclo celular Além disso, induzida por 4-oxo-4H-HPR e a formação de fusos multipolares eram independentes da cascata de sinalização de ROS-associado, não só em mas também em cancro da mama, as linhas celulares do colo do útero e cancro do neuroblastoma, revelando a característica distintiva do ovário de 4-oxo-4-HPR ter um duplo mecanismo de acção.
(a) efeito citotóxico de 4-oxo-4-HPR em T47D (□), HeLa (▵) e SK-N- o crescimento de células BE (○) foi estimada utilizando o ensaio de sulforrodamina B. A actividade antiproliferativa de 4-oxo-4-HPR em cada linha de células foi testada em três experiências independentes com quatro poços em replicado para cada análise; barras verticais são desvios-padrão. (B) Análise de produção de ROS em T47D, HeLa e SK-N-BE células tratadas durante 4 horas com 5 uM 4-oxo-4-HPR, com ou sem 100 uM vitamina C. A análise foi realizada por citometria de fluxo após a adição do corante sensível a redox CM-H
2DCFDA. Os gráficos mostram o fluxo de citometria representante perfis de fluorescência em diferentes condições de tratamento (uma experiência representativa de três). A mudança para a direita do controle indica aumento níveis de ROS. (C) para análises de Western blot expressão PLAB em T47D, HeLa e SK-N-BE células tratadas com 5 uM 4-oxo-4-HPR durante 24 horas, com ou sem 100 uM vitamina C. Como um controlo para a carga, a mancha foi incubada com o anticorpo actina.
citometria de fluxo e de iodeto de propídio T47D-corados (a), células HeLa (B) e SK-N-BE (C), as células tratadas durante 24 horas com 5 uM 4-oxo-4-HPR com ou sem 100 uM de vitamina C. os números na figura indicam a percentagem de células na fase do ciclo celular, de acordo com a análise realizada com o software ModFit LT. Um representante experimento de três é mostrado. Na parte inferior de cada histograma, análise de imunofluorescência com anticorpo α-tubulina (
verde) de células tratadas da mesma forma. morfologia nuclear foi visualizado por coloração com Hoechst 33342 (
azul e). Barra de escala = 10 uM.
Discussão
4-oxo-4-HPR é um metabolito polar do retinóide sintético 4-HPR que foi detectado em amostras de plasma de mulheres tratadas com 4-HPR participando de um teste de prevenção do câncer de mama Fase III [11]. Os nossos anteriores
in vitro
estudos realizados com 4-oxo-4-HPR têm mostrado que o retinóide é dotado de propriedades anti-cancro muito promissores, tais como os efeitos inibidores do crescimento do tumor superior a 4-HPR (sendo o seu IC
50 valores de duas a quatro vezes menor do que o fármaco original na maioria das linhas celulares testadas), a falta de resistência cruzada e interacção sinérgica com o fármaco original [12], sugerindo que poderia ser proposto como um novo agente para a terapia do cancro. Diferentemente de 4-HPR e outros retinóides, 4-oxo-4-HPR segmenta os microtúbulos e inibe a polimerização da tubulina, causando a paragem da mitose e a formação de fusos multipolares, sem perda da integridade do centrossoma [13]. Por outro lado, de forma semelhante à do fármaco original, 4-oxo-4-HPR induz o aumento da geração de ROS [12].
Uma vez que a geração de ROS induzida 4-HPR foi mostrado para activar uma cascata apoptótica envolvendo ER resposta ao estresse, de activação de JNK e a regulação positiva da proteína pró-apoptótica PLAB [9], nós decidimos investigar se 4-oxo-4-HPR desencadeada apoptose também através da geração de ROS e se a sua actividade antimitótica estava relacionada com esta via ROS-dependente. produção de ROS induzida por 4-oxo-4 HPR contribuiu para a actividade apoptótica do retinóide, porque o tratamento com o anti-oxidante da vitamina C causou uma redução de apoptose induzida por 4-oxo-4 HPR. Em nosso estudo anterior, em 4-oxo-4-HPR caracterização [12], não fomos capazes de mostrar uma relação causal clara entre a geração de ROS e actividade inibidora do crescimento de células do retinóide. Uma possível explicação pode ser que o antioxidante utilizado na análise anterior (isto é,
N
-acetil-L-cisteína) não impedir totalmente o stress oxidativo induzido por 4-oxo-4-HPR, mas apenas provocou um a redução parcial da produção de ROS [12].
a jusante da geração de ROS, 4-oxo-4-HPR activado outros intermediários de sinalização da cascata apoptótica 4-HPR, tais como a resposta de stress ER (detectado pela XBP-1 splicing, GRP78 /Bip e HSP70 regulação positiva, e fosforilação eIF2α) e fosforilação de JNK, tanto impedida por adição de vitamina C. A expressão da proteína pró-apoptótica PLAB foi dramaticamente aumentada por 4-oxo-4-HPR e sua regulação positiva foi reduzida por adição de vitamina C, sugerindo que a modulação da expressão de proteína era um evento a jusante do estresse oxidativo induzido pelo retinóide. Além disso, foi demonstrado que PLAB desempenhou um papel funcional no 4-oxo-4-HPR actividade apoptótica, porque o seu silenciamento diminuiu a apoptose induzida pelo retinóide. Por conseguinte, os nossos resultados indicaram que a 4-oxo-4-HPR, além de actuar como um agente antimicrotúbulo, a apoptose induzida através da cascata de sinalização que já foi demonstrado para ser activado pelo 4-HPR (ROS → ER estresse → JNK → PLAB) [ ,,,0],9]
PLAB-apoptótica induzir actividade tem sido observado e relatado por outros autores em diversos contextos celulares e após o tratamento com diferentes agentes anticancerígenos [9], [18] – [21].. No entanto, os eventos a jusante específicos pelos quais PLAB medeia tais efeitos continuam a ser determinado. Dos resultados obtidos, o envolvimento das proteínas Bcl-2 e Mcl-1, um membro da família Bcl-2, em actividade apoptótica pode ser PLAB possivelmente excluídos. Na verdade, embora o tratamento de 4-oxo-4-HPR causou uma regulação negativa do nível das duas proteínas anti-apoptóticas expressão, uma tal diminuição não foi evitada pela inibição da cascata apoptótica ROS mediada envolvendo PLAB.
é interessante notar que o 4-oxo-4-HPR é uma forma oxidada de 4-HPR e que a modificação na posição 4 do anel ciclo-hexeno é provavelmente responsável pela actividade antimicrotúbulo-4-HPR 4-oxo, mas não afectar a capacidade de o retinóide para induzir a produção de ROS e activar a cascata de sinalização relacionados com ROS. Tal modificação química pode ser também responsável pelo metabolismo diferente esfingolipídios observada entre os dois retinóides. Ambos 4-HPR e 4-oxo-4-HPR foram mostrados para induzir um aumento drástico da produção dihidroceramida; No entanto, a contribuição de espécies moleculares distintas para o incremento total era relatado para ser marcadamente diferente, em termos de esfingosina /esfinganina e teor de ácidos gordos. Além disso, 4-oxo-4-HPR, contrariamente a partir do fármaco original, tem sido demonstrado que o aumento ligeiramente também a produção de ceramida [22].
têm relatado anteriormente que a 4-oxo-4-HPR age atipicamente em comparação com 4-HPR e outros retinóides, devido à sua capacidade para inibir a polimerização da tubulina, levando à formação de fusos multipolares e paragem da mitose [13]. Neste estudo verificou-se que a paragem da mitose e a formação de fusos multipolares acoplado induzidas por 4-oxo-4-HPR foram independentes da cascata de sinalização relacionados com ROS. De facto, mostrámos que a geração de ROS induzida por 4-oxo-4 HPR ocorreu mais cedo do que a paragem da mitose, o que indica que a actividade antimitótica do retinóide não foi um acontecimento a montante do estresse oxidativo. Por outro lado, a inibição da via relacionada com a ROS por vitamina C ou por silenciamento PLAB não impedir a capacidade de 4-oxo-4-HPR para exercer a sua actividade antimicrotúbulo, sugerindo, assim, que a paragem da mitose não era um ROS- mecanismo dependente. A ocorrência de um duplo mecanismo de acção poderia plausivelmente ser uma característica distintiva de o modo de acção de 4-oxo-4-HPR, uma vez que estas duas vias independentes foram encontrados em linhas de células de cancro de diferentes histotipos (ovário, da mama, carcinoma do colo do útero e neuroblastoma).
embora o mecanismo exacto pelo qual a 4-oxo-4-HPR actividade antimicrotúbulo provoca a morte celular ainda não foi determinada, com base dos dados acima mencionados, pode-se especular que quer o ROS- cascata de sinalização associado e as actividades antimicrotúbulos contribuir de forma independente a 4-oxo-4-HPR efeito antiproliferativo e nós propomos que os actos de retinóides, tal como apresentado esquematicamente na Figura 8. no entanto, a análise de mecanismos de 4-oxo-4-HPR de acção terá mais estudos para investigar como as duas vias de chumbo molecularmente à morte celular. Ele é tentador especular que a regulação negativa ROS-independente da Bcl-2 e de Mcl-1, observada ao fim de 4-oxo-4-HPR tratamento, pode desempenhar um papel na apoptose induzida pela actividade antimicrotúbulo do retinóide, embora, actualmente nenhuma evidência suporta esta hipótese. De acordo com as nossas observações, foi relatado que o tratamento com outros agentes interferentes microtúbulos pode levar a uma diminuição da Bcl-2 e de Mcl-1 contribuem para quantidades intracelulares da apoptose [23] – [25].
4 -oxo-4-HPR induz a morte celular por meio de dois mecanismos independentes de acção: 1) uma cascata de sinalização relacionados com ROS envolvendo ER resposta ao estresse, de activação de JNK e a regulação positiva de proteínas pró-apoptóticas PLAB; e 2) as atividades antimicrotúbulos que consistem na inibição da polimerização da tubulina, paragem da mitose e formação de fusos multipolares.
É importante salientar que outros agentes direcionados-microtúbulos têm sido mostrados para promover a geração de ROS em células cancerosas, mas a relação entre a dinâmica de tubulina e estresse oxidativo ainda não estão claros [26] – [33]. Recentemente, a actividade anti-cancro de paclitaxel tem sido associado com a geração de intracelular e extracelular de ROS e tem sido sugerido que a perturbação do estado de microtúbulos de polimerização induzida por este agente, bem como por taxotere ou vincristina, pode melhorar a produção de ROS através de estabilização de NADPH-oxidase activa [31], [32]. geração de ROS contribuiu também para o efeito anti-proliferativo de patupilone, um membro dos agentes de estabilização de microtúbulos-epotilonas, e uma relação causal entre o stress oxidativo e as modificações da dinâmica dos microtúbulos tem sido sugerido [30]. Em contraste, a produção de ROS induzidos por 5c estilbeno, um inibidor de microtúbulos no local de colchicina, demonstrou não estar relacionado com a perturbação do ciclo celular induzida por drogas [29], de modo semelhante ao que descobrimos para 4-oxo-4- HPR.
a capacidade de 4-oxo-4-HPR para actuar através de pelo menos dois mecanismos independentes provavelmente pode permitir para neutralizar o desenvolvimento de resistência ao fármaco. De facto, mostrámos que se uma via é inibida (isto é, ROS-relacionada via de sinalização), o retinóide é capaz de actuar através de outro mecanismo (isto é, a paragem da mitose) para matar células cancerosas.