Sumário

O cancro da bexiga é diagnosticada por cistoscopia, um processo dispendioso e invasivo, que está associada com o desconforto do paciente. Análise de marcadores específicos de tumor a partir de ADN em sedimentos de urina vertida tem o potencial para a detecção não invasiva de cancro da bexiga; No entanto, a sensibilidade é limitada pela baixa fracções e um pequeno número de células tumorais na urina esfoliadas a partir de tumores de baixo grau. O objectivo deste estudo foi o de melhorar a sensibilidade para a detecção não invasiva de cancro da bexiga por captura e enriquecimento de células tumorais na urina baseada em tamanho. Em uma fração de amostra de set-up, a urina de uma série consecutiva de pacientes com tumores de bexiga primárias ou recorrentes (N = 189) foi processado por microfiltração usando um filtro de membrana com poros de tamanho definido, e sedimentação por centrifugação, respectivamente. O ADN das amostras foi analisada para sete marcadores de metilação associados a tumores da bexiga usando MethyLight e pirossequenciao ensaios. A fracção de DNA derivado de tumor foi mais elevada nas amostras de filtro de sedimentos nas correspondentes para todos os marcadores (

P

0,000001). Em todas as fases de tumor, o número de casos positivos para um ou mais marcadores foi de 87% nas amostras de filtro em comparação com 80% nos sedimentos correspondentes. O maior aumento de sensibilidade foi obtida em tumores de baixo grau Ta, com 82 de 98 casos positivos nas amostras de filtro (84%) versus 74 de 98 nos sedimentos (75%). Nossos resultados mostram que o tratamento pré-analítico de urina anulado por filtração à base de tamanho pode aumentar a sensibilidade para a detecção baseada em DNA de câncer de bexiga

Citation:. Andersson E, Steven K, Guldberg P (2014) Size- Enriquecimento base de células tumorais esfoliativas na urina aumenta a sensibilidade para a DNA-Based detecção de cancro da bexiga. PLoS ONE 9 (4): e94023. doi: 10.1371 /journal.pone.0094023

editor: Ludmila Prokunina-Olsson, do National Cancer Institute, National Institutes of Health, dos Estados Unidos da América

Recebido: 23 de outubro de 2013; Aceito: 12 de março de 2014; Publicação: 14 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Andersson et al. . Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento: Conceder um apoio : A Fundação Candy. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de bexiga é o sétimo tipo de câncer mais comum em todo o mundo e é responsável por mais de 150.000 mortes por ano [1]. Mais de 90% dos tumores da bexiga são carcinomas de células transicionais (também chamado de carcinoma urotelial) que derivam a partir das células que revestem o uroteliais de bexiga. Os sintomas típicos de cancro da bexiga são hematúria microscópica e macroscópica, dor ao urinar e poliúria. No entanto, nenhum desses sintomas é específico para a doença e pode ser causada por uma variedade de outras condições, incluindo cistite, pedras nos rins e a doença da próstata. O padrão ouro para o diagnóstico de cancro da bexiga é a ressecção transuretral do tumor da bexiga (TURBT). A maioria dos pacientes são diagnosticados com câncer de bexiga não-invasiva (estádio Ta), que tem uma taxa de sobrevivência de cinco anos de 90%. No entanto, a taxa de recorrência é alta (50-70%) e 10-25% evoluem para cancro da bexiga invasivo, garantindo a longo prazo de seguimento por cistoscopia em pacientes com tumores não invasivos [2] – [4]. Cistoscopia é um método invasivo que é desconfortável para os pacientes e exige grandes recursos técnicos e financeiros. É, portanto, importante desenvolver métodos não-invasivos que são simples e de baixo custo para o diagnóstico e acompanhamento de câncer de bexiga.

amostras de urina anulados de pacientes com tumores de bexiga geralmente contêm células tumorais esfoliada que pode ser detectado por análise citológica. Urina citologia é um método não-invasivo, que tem uma elevada especificidade mas baixa sensibilidade ( 40%), especialmente em pacientes com tumores de baixo grau [5], [6]. Um método não invasivo mais sensível para a detecção de cancro da bexiga é baseada na análise de alterações específicas do tumor em ADN isolado a partir de sedimentos de urina. perdas cromossômicas e mutações somáticas em genes específicos, tais como

FGFR3

e

TP53

têm sido utilizadas com sucesso como biomarcadores para a detecção de vários estágios do câncer de bexiga [7] – [9]. Nos últimos anos, a hipermetilação aberrante de ilhas de CpG promotor foi demonstrado que ocorrem frequentemente e cedo no desenvolvimento do cancro e pode mesmo preceder alterações genéticas, tais como mutações e rearranjo genómico em cancerogenesis [10]. Vários estudos têm relatado a hipermetilação do promotor de ilhas CpG em tumores da bexiga (revisto em Refs [11] -. [13]) e estas alterações podem ser detectadas no sedimento de urina de pacientes de cancro da bexiga [14], [15]. Não existe um único marcador de DNA-metilação que define todos os tipos de tumor de bexiga, ea maioria dos estudos têm utilizado um painel de marcadores para detectar cancro da bexiga em amostras clínicas. A sensibilidade e especificidade da detecção do tumor da bexiga com base em DNA variam consideravelmente entre os estudos, o que pode ser atribuído à escolha de marcadores e métodos para avaliação destes marcadores, bem como diferenças na representação das diversas fases de tumor em coortes de pacientes [16] – [23].

em estudos em que as amostras de tumor emparelhados e sedimentos de urina foram analisadas em paralelo para o mesmo painel de marcadores de ADN, a sensibilidade de detecção é consistentemente mais baixa na urina [15], [17], [20]. A esfoliação de células tumorais na urina depende das características do tumor, tais como o tamanho, grau e estágio e também mostra uma grande variação intra-individual [24]. Especialmente tumores não invasivos pequenos têm menos probabilidade de verter células suficientes para a urina a ser detectada na análise subsequente. Além disso, a urina de pacientes com cancro da bexiga pode conter um maior número de outros tipos de células, incluindo as células brancas do sangue, o que pode afetar a sensibilidade da análise do sedimento. Por isso, um método que permite um enriquecimento de células tumorais em amostras de urina podem aumentar a robustez e sensibilidade para a detecção não invasiva de cancro da bexiga.

Células tumorais derivadas de células epiteliais são geralmente maiores do que as células brancas do sangue, e esta diferença de tamanho pode potencialmente ser explorada para enriquecer em células tumorais em amostras biológicas heterogéneas, tais como urina. Estudos anteriores têm utilizado para filtros de isolamento à base de tamanho de células tumorais circulantes (CTCs) raras no sangue periférico [25], [26]. A ideia de capturar as células na urina num filtro foi introduzida há mais de trinta anos atrás, [27], e depois estudos utilizaram filtros de membrana para a preparação de células epiteliais a partir de urina para a detecção de carcinoma urotelial por citologia ou hibridação in situ fluorescente (FISH) análise [28] – [30]. No presente estudo, nós testamos um procedimento simples e de custo eficaz para a filtração de urina pré-analítico para aumentar a fracção de células de tumor e, assim, a sensibilidade para a detecção baseada em DNA sobre sedimentos não filtrados. Em uma fração de amostra de set-up, amostras de urina de pacientes com câncer de bexiga foram avaliados para a presença de DNA do tumor com um painel de marcadores de metilação frequentemente detectados no cancro da bexiga. As fracções de alelos metilados foram quantificados em amostras sedimentadas e filtrados através de ensaios e MethyLight pyrosequencing. Descobrimos que este método de filtragem aumentou a fração de DNA derivado de tumores e também melhorou a sensibilidade e robustez da detecção de tumores de bexiga de amostras de urina.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Copenhagen, e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes e controles na inclusão.

coleta de urina

amostras de urina da manhã anulados foram coletados a partir da bexiga pacientes com câncer internados por TURBT no Hospital Universitário de Copenhagen, Herlev, na Dinamarca, entre junho de 2010 e outubro de 2011, e de voluntários saudáveis ​​sem doenças malignas urológicas conhecidos. As amostras foram enviadas para o dinamarquês Cancer Society e processados ​​dentro de 4-6 horas após a micção.

Processamento de amostras de urina

Cinquenta mililitros de cada amostra de urina foram sedimentadas por centrifugação a 2.000 g por 10 min . O sedimento foi lavado em solução salina tamponada com fosfato (PBS), seguido por outra centrifugação de 10 min. O sobrenadante foi rejeitado e o sedimento foi ressuspenso em cerca de 200 ul de PBS. Em paralelo, a urina a partir da mesma amostra foi retirada para uma seringa descartável e passada através de um filtro de policarbonato Nuclepore de membrana Whatman faixa gravado-hidrofílico (25 mm de diâmetro) montado no suporte do filtro correspondente (Whatman, Maidstone, Reino Unido). A amostra de urina foi passado através do filtro de força positiva, até uma resistência foi sentida (saturação), com um máximo de 125 ml. Todos os filtros foram lavados com PBS antes da remoção do suporte do filtro. sedimentos de urina e filtros com teor de filtro foram armazenadas a -80 ° C até posterior processamento.

Isolamento de ADN e bissulfito de Conversão

O ADN foi isolado a partir de amostras de sedimento de urina e de filtro, utilizando o kit Qiagen Mini Prep (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Filtrar e sedimentos amostras foram incubadas com tampão de ATL e proteinase K a 56 ° C durante, pelo menos, uma 1 hora ou durante a noite. O processamento subsequente foi feito de acordo com o protocolo para a purificação de ADN a partir de tecidos. DNA de filtros e sedimentos foi eluída em 50 ul e 100 ul de tampão AE, respectivamente, e armazenadas a -80 ° C. A concentração de ADN foi medida utilizando um espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE, EUA).

conversão de bissulfito foi feito utilizando o kit EZ-DNA Metilação de ouro (Zymo Research Corp, Orange, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. O ADN convertido pelo bissulfito foi eluído em 2 × 10 ul de H-Tampão de eluição e armazenado a -80 ° C. Para amostras emparelhadas (sedimento e filtro), foi usada a mesma quantidade de ADN, com um máximo de 500 ng. Nos casos em que a concentração do ADN era demasiado baixa para ser determinada com precisão utilizando o espectrofotómetro NanoDrop, utilizou-se o volume de amostra máximo (20 ul). Normal epitélio da bexiga humana derivada de um 66 anos do sexo masculino de idade foi comprado de Capital Biociências (Rockville, MD, EUA).

Cultura de Células

A linha de células T24 (DSMZ, Braunschweig, Alemanha) foi cultivadas em meio DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10%. Os linfócitos foram isolados a partir de sangue de um dador saudável, essencialmente como descrito [31] e armazenadas a -80 ° C até à sua utilização. As células em suspensão de uma única célula foram contados e medidos utilizando um contador celular condessa Automatizado (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Os dois tipos de células foram misturados nas proporções indicadas e processada por centrifugação e filtração como anteriormente descrito para amostras de urina.

desnaturação Gradiente Electroforese em Gel

A análise da mutação de

HRAS

exão 2 por electroforese em gel desnaturante (DGGE) foi feito essencialmente como descrito [32]. As sequências dos iniciadores e condições de PCR estão listadas na Tabela S1. Os produtos de PCR foram carregadas num gel de gradiente duplo 0% desnaturante /6% de poliacrilamida-90% desnaturante /9% de poliacrilamida [33]. Os géis foram corridos a 170 V durante 4,5 horas em tampão TAE mantido a uma temperatura constante de 58 ° C, corado com brometo de etídio e fotografados num transiluminador UV.

MethyLight

quantitativa em tempo real metilação específicas de PCR (MethyLight; Ref. [34]) foi realizada essencialmente como descrito [20]. As sequências dos iniciadores e das sondas estão listadas na Tabela S1. As reacções foram realizadas sobre a plataforma 480 do LightCycler utilizando o LightCycler 480 Sondas mestre Kit (Roche, Mannheim, Alemanha) e 1 uL de ADN tratado com bissulfito-por reacção. A especificidade de cada ensaio foi estabelecida utilizando

in vitro

metilado DNA (IVM; CpGenomeTM Universal metilado de DNA, Chemicon /Millipore, Billerica, MA) e de DNA de linhas celulares de cancro selecionados como controles positivos e negativos para a metilação, respectivamente , e água e não-tratado com bisulfito o ADN genómico como controlos negativos para a amplificação. Um ensaio para MethyLight

ALUC4

e uma série de diluição de IVM foram usadas para determinar a concentração de DNA da amostra após o tratamento com bissulfito [20], [35]. Os casos foram descartados se uma das amostras de sedimentos ou filtro emparelhado tinha uma concentração inferior ao equivalente de DNA de 0,25 ng /mL não tratado pelo bissulfito. níveis de metilação foram calculadas como uma percentagem de referência metilado (PMR; Ref. [35]), normalizando valores de reação específica do marcador para

ALUC4

valores relativos aos mesmos valores para controle totalmente metilado (IVM). As pequenas quantidades de ADN a partir de muitas das amostras limitam o número de marcadores que podem ser testadas, e todas as análises foram realizadas como se reacções individuais. O nível de metilação do fundo para cada marcador foi determinado utilizando o ADN a partir de amostras de urina sedimentadas e filtrados a partir de 11 controlos saudáveis, bem como ADN genómico humano (Roche, Mannheim, Alemanha). Os valores PMR de corte foram de 3 para

HOXA9

, 2 para

POU4F2

, 0,5 para

SALL3

e 2 para

VIM2.

pirossequencia�o

pyrosequencing ensaios para a

HRAS

p.G12V (c.35G T) mutação e

BCL2

metilação do promotor foram projetados usando o software de desenho ensaio PyroMark (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha). As sequências dos iniciadores e condições de PCR estão listadas na Tabela S1. A PCR foi realizada num volume final de 25 ul contendo tampão de PCR (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha), 200 uM de cada dNTP, 0,4 uM de cada iniciador e 1 U de Taq polimerase HotStarTaq ADN (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha). Pirossequenciao foi executada em uma plataforma PyroMark Q24, Q24 utilizando PyroMark ouro Reagentes (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha). A análise dos resultados foi realizada com o software PyroMark Q24 (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha). Os níveis médios de metilação para

BCL2

foram calculadas para os sete locais CpG incluídos no ensaio. O sinal de fundo para o

BCL2

ensaio de metilação foi fixado em 5% com base na análise de ADN tratado com bissulfito-genómico humano (Roche, Mannheim, Alemanha). Para o

BCL2

análise de metilação, apenas amostras clínicas com uma concentração equivalente a 5 ng /DNA tratado pelo bissulfito não ul ou mais foram incluídos.

Resultados

Captura e Enriquecimento as células de tumor da bexiga sobre uma membrana de filtro

para testar a capacidade de filtros de membrana para capturar as células de tumor da bexiga, foi utilizado pela primeira vez um sistema de modelo concebido para assemelhar-se amostras de urina contendo baixas fracções de células tumorais. Uma experiência é apresentado na Figura 1. Os linfócitos do sangue periférico purificadas cultivadas (diâmetro 7-8 um) foram misturados com as células cancerosas da bexiga T24 0,5% (diâmetro 16-17 uM). Parte desta mistura celular foi sedimentado por centrifugação, enquanto que o restante foi passado através de um filtro de membrana com um tamanho de poro de 8 um (Figura 1A). O flowthrough do filtro também foi recolhido e sedimentados por centrifugação. Para avaliar se a filtração aumenta a fracção de células de tumor na amostra, o DNA foi isolado e analisado por duas alterações específicas do tumor presentes em células T24;

HRAS

p.G12V mutações e hipermetilação do

BCL2

promotor. A Figura 1B mostra a resolução física de tipo selvagem e mutante

HRAS

alelos utilizando DGGE, que tem um nível de detecção de aproximadamente 2% [36]. O mutante

HRAS

alelo foi claramente detectável como homo e heteroduplexes na amostra filtro, mas não nas amostras de sedimento ou flowthrough (Figura 1B). A análise quantitativa das mesmas amostras utilizando pyrosequencing mostrou um aumento na razão de mutante (T) ao longo de tipo selvagem (L)

HRAS

alelos de 3-4% no sedimento e amostras flowthrough a 19% na amostra filtro (Figura 1C e dados não mostrados). pyrosequencing bissulfito mostrou um aumento similar na fração

BCL2

hipermetilado alelos, específico para células T24, mediante filtração (Figura 1D).

(A) Desenho esquemático do split-amostra conjunto experimental -acima. Amostra de urina ou de suspensão de células é dividida em duas e submetido a centrifugação e filtração, respectivamente. ADN a partir de células no sedimento ou capturado no filtro é então isolado e analisado para os marcadores específicos de tumor. (B) Detecção do

HRAS

p.G12V mutação por DGGE. A linha de células T24 é homozigótico para o alelo mutante. Sedimentos e amostras flowthrough exibir apenas o alelo tipo selvagem, enquanto a amostra filtro mostra ambos os alelos mutantes e de tipo selvagem. Heteroduplexes são moléculas híbridas formadas por um fio mutante e um fio do tipo selvagem. (C) Pyrographs mostrando a distribuição entre tipo selvagem (G) e mutante (T)

HRAS

alelos nas amostras de sedimentos e de filtro. (D) Pyrographs de

BCL2

promotor CpG análise ilha metilação nas amostras de sedimento e de filtro. Os locais de CpG individuais na região alvo são indicadas pelo sombreado cinzento escuro, e a percentagem de alelos metilados (C) é indicado em cada local.

Para testar o método de filtração em um ambiente clínico, urina As amostras foram obtidas de 15 pacientes com câncer de bexiga admitidos para TURBT. Nesta série de amostras, que também avaliado se o tamanho de poro pode impactar a proporção de células tumorais para células normais. A partir de cada amostra de urina, de 50 ml foram preparadas por centrifugação, enquanto que o volume restante foi dividido em partes iguais e passados ​​através de dois filtros com tamanhos de poro de 8 um e 10 uM, respectivamente. O ADN foi isolado a partir de todo o sedimento de urina e amostras de filtro e examinados para

BCL2

metilação utilizando um ensaio MethyLight altamente específicos e sensíveis. Sete das amostras de urina de 15 foram positivas para este marcador, consistente com relatórios anteriores mostrando

BCL2

hipermetilação em uma grande percentagem de tumores de bexiga [16], [22]. Para estimar a fração de DNA derivado de tumor, foram calculados os níveis de metilação para a

BCL2

amostras -positivas usando valores normalizados (PMR). Houve apenas uma pequena diferença entre os níveis de metilação entre os 8 e os 10 uM filtros, com níveis ligeiramente superiores no filtro de 8 um (Tabela S2). A análise quantitativa de

BCL2

metilação por pyrosequencing confirmou os resultados da análise MethyLight (Figura 2). Nomeadamente, todas as amostras (tanto de filtro de 8 um e 10 um) apresentou maior

níveis BCL2

metilação do que as correspondentes amostras de sedimentos, indicando uma maior fracção das células tumorais.

Os níveis médios de metilação do

BCL2

promotor ilha CpG em amostras de urina de sete pacientes com câncer de bexiga, conforme determinado pelo pyrosequencing. Sedimento e duas amostras de filtro (tamanho de poro 8 e 10 uM, respectivamente) foram preparados a partir de cada amostra de urina. A amostra de sedimento de paciente 2 está em falta devido à extração de DNA falhou.

Urina Filtration Aumenta a fração de DNA do tumor em amostras clínicas

Tendo prova obtida do princípio que os filtros de membrana pode capturar e enriquecer para células tumorais de bexiga em amostras de urina, foi realizado um estudo clínico de 220 pacientes com tumor de bexiga consecutivos. As características demográficas e clínico-patológico desses pacientes estão listadas na Tabela S3. Houve um número igual de pacientes com tumores primários e recorrentes nesta coorte. amostras de urina da manhã foram coletadas e processadas de acordo com o projeto da separação amostra ilustrada na Figura 1A, utilizando um filtro de 8 mm. O ADN foi isolado a partir de todo o sedimento de urina e amostras de filtro e tratou-se com bissulfito de sódio. A concentração de ADN tratado com bissulfito-em cada amostra foi determinada utilizando um ensaio para MethyLight

ALUC4

. Trinta e um amostras pareadas foram descartados por causa do baixo rendimento DNA (Tabela S3).

Triagem de todos os 189 amostras pareadas para

BCL2

metilação por análise MethyLight identificados 121 casos positivos para este marcador (exemplos são mostrados na Figura 3A). Em 60 destes casos, ambas as amostras de sedimentos de filtros e continha uma quantidade suficiente de ADN para análise quantitativa fiável por pirossequenciao (Figura 3B). Em 18 dos 60 casos, o

BCL2

nível médio de metilação estava abaixo do sinal de fundo para pyrosequencing em ambas as amostras de sedimentos e de filtro. Dos restantes 42 casos, 29 (69%) apresentaram níveis de metilação mais elevados na amostra filtro em comparação com a amostra de sedimento, cinco casos (12%) apresentaram níveis iguais de metilação ( 2 pontos percentuais de diferença), e oito casos (19% ) mostraram níveis mais elevados de metilação nos sedimentos do que nos filtros correspondentes (Figura 3C). O nível médio de metilação foi de 28% nas amostras de filtro em comparação com 21% em sedimentos (

P

0,001, teste t emparelhado). O aumento nos níveis de metilação de sedimentos para filtrar variou de 3 a 35 pontos percentuais, com um valor médio de 10 pontos percentuais. análise quantitativa de todos os 121 casos positivos para

BCL2

metilação usando valores normalizados (PMR) a partir da análise MethyLight mostrou um nível médio de metilação de 10,0% nas amostras de sedimento e 14,4% nas amostras de filtro, com o nível médio aumento de 1,6% para 4,0% (Figura 4;

p Art 0,001, teste t pareado)

(a) Exemplos de análise MethyLight de

promotor BCL2

. CpG metilação ilha. No paciente A, a amplificação é visto na amostra de filtro, mas não na amostra de sedimento. No paciente B, a amplificação é visto em ambas as amostras; No entanto, com um valor de Ct mais elevada para a amostra de sedimento. (B) Exemplos de

BCL2

análise de metilação do promotor CpG ilha de pyrosequencing em amostras pareadas. nível médio de metilação é calculada para as sete locais CpG individuais ensaiadas (indicados pelo sombreamento cinza escuro). O nível médio de metilação na amostra de sedimento de doente B foi inferior ao sinal de fundo para pyrosequencing, em contraste com o ensaio de MethyLight (A), que mostra a diferença de sensibilidade analítica entre os dois ensaios. (C) Os níveis médios de metilação para amostras pareadas, conforme determinado pelo pyrosequencing. São mostrados os resultados para os casos em que, pelo menos, uma das amostras emparelhadas apresentaram sinais acima do fundo para pirossequenciao (N = 42).

É mostrada a mediana de valores normalizados (referência metilado por cento, PMR) a partir da análise de sete marcadores MethyLight metilação. Para cada marcador, os níveis de metilação variou de 1% a 100% (não mostrado). *, P 0,05; ** P . 0,01

Para analisar amostras negativas para

BCL2

metilação, ampliamos a análise baseada em MethyLight por seis promotoras ilhas adicionais CpG anteriormente relatados de ser frequentemente hipermetilado em cancro da bexiga, incluindo

CCNA1

,

EOMES

,

HOXA9

,

POU4F2

,

SALL3

e

VIM2

[16], [18], [23]. Temos validado esses marcadores juntamente com

BCL2

em um painel de 51 tumores de bexiga que representam vários estágios tumorais (tumores Ta 22 de baixo grau, os tumores Ta 2 alto grau, 8 tumores T1, 17≥T2 tumores, e 2 Tis ). Cada um destes marcadores foi positivo em 45% dos tumores neste painel, e 48 dos tumores (94%) foram positivos para pelo menos um marcador. especificidade tumoral dos marcadores foi confirmada por análise de tecido de bexiga normal,

A análise quantitativa de todos os sete marcadores de metilação do DNA mostrou um aumento nos níveis de metilação em amostras de filtro em comparação com os sedimentos (Figura 4;.

p

0.000001, teste t pareado). Esta diferença também foi estatisticamente significativa para alguns marcadores individuais, incluindo

BCL2

,

HOXA9

e

VIM2

(Figura 4).

Urina Filtration Aumenta a sensibilidade para a detecção de câncer de bexiga

Nós finalmente abordadas se o aumento das fracções de DNA derivado de tumor alcançada por filtração urina pode afetar a sensibilidade para a detecção de câncer de bexiga. Para determinar os níveis de metilação de fundo para cada um dos sete marcadores, examinámos ADN a partir de amostras de filtro e no sedimento urinário de 11 controlos saudáveis, bem como o ADN a partir de linfócitos de sangue periférico. amplificação de ciclo tardio foi ocasionalmente observado em quatro dos marcadores (

HOXA9

,

POU4F2

,

SALL3

e

VIM2

), alguns dos quais foram mantida a análise repetida. Com base nestes dados, um valor de corte foi definido para cada um destes marcadores acima do qual uma amostra foi considerada positiva.

BCL2, CCNA1

e

EOMES

não apresentaram metilação fundo.

Com positividade definida como hipermetilação de pelo menos um dos sete marcadores, a sensibilidade em todas as fases de tumor foi de 80% (152/189) nos sedimentos de urina, enquanto que foi de 87% (164/189) nas amostras de filtro. Este padrão foi também evidente para os marcadores individuais, que todos exibiam uma sensibilidade mais elevada nas amostras de filtro (Figura 5). O marcador que mostra a sensibilidade mais elevada foi

VIM2

, que foi positivo em 56% das amostras de sedimentos e 67% das amostras de filtro. Os outros seis marcadores tiveram sensibilidades de 35-53% nos sedimentos e 43-62% em filtros. A sensibilidade mais elevada para tumores de estádio (≥T1) foi geralmente elevada ( 90%) em sedimentos e foi apenas ligeiramente, embora de forma consistente, aumentada após filtração. Notavelmente, no entanto, um efeito dramático foi observado para tumores Ta de baixo grau, em que a sensibilidade aumentada de 75% (74/98) nos sedimentos para 84% (82/98) em filtros (Tabela 1). Entre os 95 tumores primários, 80 (84%) foi detectado no sedimento e 84 (88%) foram detectados no filtro. Entre os 94 tumores recorrentes, 73 (78%) foi detectado no sedimento e 80 (85%) foram detectados no filtro.

Mostram-se as amostras positivas para as percentagens sete marcadores de ADN-metilação. A última coluna ( “All”) mostra a percentagem de amostras positivas para um ou mais marcadores.

Discussão

ensaios não-invasivo que pode com precisão e confiabilidade detectar bexiga câncer terá um impacto substancial sobre os pacientes e do sistema de saúde, reduzindo a necessidade de cistoscopia freqüente, caro e desconfortável. Um progresso significativo foi alcançado na identificação de biomarcadores à base de urina que pode superar citologia urinária, e alguns destes marcadores foram desenvolvidos para testes comerciais. No entanto, os desafios permanecem em atingindo a sensibilidade de cistoscopia [37] – [39]. O objectivo deste estudo foi para aumentar a sensibilidade para a detecção baseada em ADN de cancro da bexiga em amostras de urina através de um processo de filtração simples, para enriquecer em células tumorais. Em uma grande coorte consecutiva de pacientes com tumor de bexiga, testámos um filtro de policarbonato comercial gravado-track com um tamanho de poro de 8 um e comparou-a com a análise de urina sedimentos padrão. A análise quantitativa através de um painel de sete marcadores de metilação do DNA mostraram um aumento significativamente os níveis de ADN de tumores em amostras de urina em comparação com os filtrados correspondentes de sedimentos, o que sugere que o filtro de captura de células de tumor da bexiga, preferencialmente em relação a outras células presentes na urina. Mais importante, o procedimento de filtração identificado um maior número de amostras de doentes com tumores da bexiga como positiva, resultando numa sensibilidade de diagnóstico global de 87% nas amostras de filtro em comparação com uma sensibilidade de 80% nos sedimentos correspondentes.

Baixa -grade, tumores de bexiga de baixa estágio representa o maior desafio em abordagens de detecção baseados em urina, incluindo a citologia padrão e FISH, uma vez que estes tumores tendem a lançar menor número de células na urina [40], [41]. Esta limitação também ficou evidente na nossa abordagem baseada em DNA, onde a sensibilidade em sedimentos de urina foi próximo ou acima de 90% para estágio ≥T1 tumores, enquanto era apenas 75% para os tumores Ta baixo grau. Curiosamente, a filtração das amostras de urina aumentou a sensibilidade de tumores Ta de baixo grau para 84%, sugerindo que este processo pode aliviar algumas das dificuldades na detecção desses tumores. Do total de 189 pacientes investigados, 16 casos foram negativos para todos os marcadores de metilação em ambas as amostras de filtro e sedimento, e 13 deles tinham tumores de alto ou de baixo grau Ta. Nós [20] e outros [42] têm demonstrado anteriormente que um subconjunto de tumores superficiais de bexiga apresentar baixas taxas de eventos hipermetilação. Curiosamente, estes tumores não mostram taxas relativamente elevadas de activação

mutações FGFR3

[20] e, portanto, a combinação dos marcadores de metilação e

FGFR3

mutações podem aumentar a sensibilidade para a detecção de tumores superficiais uma configuração de diagnóstico [20], [43]. Restringimos nossa análise a um tipo de marcador (hipermetilação DNA) para fornecer uma medida quantitativa coerentes e comparáveis ​​para avaliar os dois procedimentos para a preparação de células de diagnóstico (filtração e sedimentação), que foi o principal objectivo do nosso estudo. Além disso, nós descartado um relativamente grande número de amostras (14%) devido ao rendimento baixo do ADN, o que poderia comprometer a análise quantitativa. No entanto, essas amostras poderiam muito bem ter sido qualitativamente testados para os marcadores de metilação do DNA em um cenário de diagnóstico.

Como até 70% dos pacientes com câncer de bexiga não invasivo experimentará recaída, testes de urina não-invasivas são altamente desejáveis para a vigilância recorrência. Metade dos pacientes em nossa coorte apresentados com um tumor recorrente, e neste grupo, que para os doentes com tumores primários, filtração urina fornecida uma sensibilidade mais elevada do que a sedimentação (85% vs 78%). Estes dados sugerem que a filtragem da urina pode também melhorar o diagnóstico de recorrência de cancro da bexiga, o que pode ser particularmente útil como tumores recorrentes, muitas vezes são menores e perdem menos células do que os tumores primários. No entanto, este procedimento não pode aliviar outras limitações de vigilância recorrência baseada-metilação do DNA, incluindo a alta taxa positiva entre os casos cistoscopia-negativo, que pode ser causada por alterações epigenética em urotélio aparentemente normal (epigenética defeito de campo) [44], [ ,,,0],45].

Um óbvio parâmetro crítico para o enriquecimento à base de tamanho de células de tumor em amostras biológicas é a dimensão dos poros do filtro. Idealmente, os poros devem ser suficientemente grande para excluir as células normais e suficientemente pequeno para reter células tumorais, tendo em conta a capacidade de deformação de células sob pressão. Estudos prévios com o objectivo de enriquecer CTC raras no sangue por filtração descobriram que uma poro do filtro de tamanho 8 uM amostras de 99,9% de leucócitos empobrecido, mantendo 85-100% de células de carcinoma de [25], [46]. Com um tamanho de poros maior (12-14 uM), menor número de leucócitos, mas também um número consideravelmente menor de células de carcinoma (até 18%) foram retidas no filtro [46]. Usando um filtro de policarbonato-gravadas faixa comercial com um tamanho de poro de 8 um, o que é semelhante aos filtros utilizados nestes estudos anteriores, nós fomos capazes de enriquecer a fracção de células tumorais em amostras de urina.