Abstract

O câncer de próstata ESI-Tandem Mass Spectrometryas (PCA) é um entre os mais comuns cancersin homens ocidentais. taxa de incidência ofPCa está em ascensão em todo o mundo. O presente estudo aborda theserum profiling lipidome dos pacientes diagnosticados com CaP para identificar potenciais novos biomarcadores. Utilizou-ESI-MS /MS e GC-MS para a identificação de lípidos no soro significativamente alterados do doente de cancro em comparação com os controlos. dados lipidomas revelou 24 lipídeos são significativamente alterada no soro do patinet câncer (n = 18) em relação ao normal (n = 18), sem histórico de CaP. Usando o agrupamento hierárquico e análise de componentes principais (PCA) que podíamos pacientes com câncer claramente separados do grupo controle. Correlação e análise de partição juntamente com Análise Formal Concept (FCA) identificaram que PC (39: 6) e FA (22: 3) poderia classificar amostras com maior certeza. Ambos os lípidos, PC (39: 6) e FA (22: 3) poderia influenciar a catalogação de pacientes com sensibilidade de 100% (todas as 18 amostras de controlo são classificados correctamente) e% de especificidade de 77,7 (de 18 amostras de tumor de 4 amostras são classificadas erroneamente) com

p

-valor de 1.612 × 10

-6 em teste exato de Fischer. Além disso, foi realizada por GC-MS para denotar ácidos gordos alterados em pacientes com CaP e descobriu que os níveis de ácido alfa-linolénico (ALA) são alteradas em CaP. Também realizamos um

in vitro

ensaio de proliferação para determinar o efeito de ALA na sobrevivência de linhas celulares de CaP humanos clássicos LNCaP e PC3. Vimos por este meio informar que o PC lipídios alterada (39: 6) e FA (22: 3) oferecer um novo conjunto de biomarcadores para além dos testes de diagnóstico existentes que poderiam melhorar significativamente a sensibilidade e especificidade no diagnóstico CaP

. citação: Duscharla D, Bhumireddy SR, Lakshetti S, Pospisil H, Murthy PVLN, Walther R, et al. (2016) Prostate Cancer Associated Lipid assinaturas em soro Estudado por ESI-Tandem Mass Spectrometryas potenciais novos biomarcadores. PLoS ONE 11 (3): e0150253. doi: 10.1371 /journal.pone.0150253

editor: Mohammad Saleem, Instituto Hormel da Universidade de Minnesota, Estados Unidos

Recebido: 10 de junho de 2015; Aceito: 11 de fevereiro de 2016; Publicação: 09 de março de 2016

Direitos de autor: © 2016 Duscharla et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. o projeto é apoiado pelo Departamento de Biotecnologia (DBT), Ministério da Ciência e Tecnologia, na Índia. Grant No: 6242-P-54 /RGCB /PMD /DBT /Rhûn /2015. DD Reconhece Conselho de Pesquisa Científica e Industrial (CSIR), Índia para CSIR-JRF companheirismo e AcSIR para registrar-se como estudante de graduação

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Abreviaturas: APC, câncer de próstata; ALA, Alpha ácido linolénico; ESI-MS, espectrometria de massa de ionização Electrospary; GC-EIMS, cromatografia de gás com ionização de elétrons espectrometria de massa

Introdução

Apesar dos significativos avanços obtidos no diagnóstico e tratamento da APC, ainda é a segunda maior causa de mortes relacionadas ao câncer, ao lado ao câncer de pulmão entre os homens [1]. investigações da autópsia revelaram que 30% dos homens acima de 50 anos e 80% dos homens acima de 70 anos têm evidências para a ocorrência CaP [2]. O diagnóstico precoce eo tratamento agressivo é a única opção para curar CaP. Biomarcadores desempenham um papel importante e decisivo no diagnóstico precoce do CaP. Até à data, o rastreio por CaP envolve o exame retal digital (DRE) e do exame de sangue Antígeno Prostático Específico (PSA). No entanto, estes dois testes atualmente em uso para o diagnóstico CaP são sub-óptima, porque PSA é produzido abundantemente por epitélio prostático e também secretado pelo epitélio das glândulas periuretral. expressão de PSA não é específico de tecido ou do género, que vai ser secretado por ambas as células benignas e de cancro da próstata [3]. tecnologias avançadas “ômicas” identificaram alterada genoma, transcriptoma e proteoma relacionadas com CaP. Esses estudos têm fornecido um número de potenciais biomarcadores de genômica e proteômica para fins de diagnóstico. No entanto, nenhum destes marcadores são traduzidos em aplicações de diagnóstico e /ou prognóstico de rotina. Consequentemente, há inúmeras chances para ambos os mais de diagnóstico de pacientes com potencial limitado para o câncer ou em diagnóstico de pacientes que já sofrem da doença. Assim, a falta de métodos atuais de diagnóstico para doenças da próstata ressalta a necessidade de melhorias nesta área.

Diagnóstico de cancros com base no perfil do soro é um conceito atraente. Um número de estudos empregaram proteomic análise genómica e de amostras de soro de doentes com cancro. Somente a informação escassa é acessível em alterações metaboloma composição particularmente lipídico no soro /plasma associada com PCA. metabolismo anormal de lipidos tem sido mostrado para ser associada a diversas doenças, tais como falhas de inflamação, diabetes, renal e cardíaca, bem como muitos cancros; indicando assim que os metabolitos lipídicos poderia ser usado como biomarcadores de doenças [4]. Infelizmente, com o melhor de nosso conhecimento, a poucos relatórios foram encontrados análise lipídios de pacientes CaP associados à progressão da doença. Um estudo relatou que apolipoproteína e colesterol em conjunto diagnosticado cancro do ovário com uma precisão de 97% [5]. No cancro colorectal, ácido linoleico alterada (LA), ácido alfa-linolénico (ALA), ácidos araquidónico e oleico foram mostrados para ser associado com a progressão do cancro [6]. No entanto, nestes estudos, apenas algumas classes de lipidswere analisada, devido às limitações técnicas. Dois estudos recentes relataram que thephospholipidalterations está associada com o APC [7,8]. Particularmente progressão do cancro depende da proliferação e invasão de células tumorais em órgãos distantes. As células tumorais sofrer alterações funcionais e morfológicas, muitos dos quais começam com membrana celular liberando seus componentes na corrente sanguínea. Lipidomicsapproach foi aplicado para identificar biomarcadores e estudar o papel dos lípidos na progressão da doença de muitos distúrbios metabólicos, tais asobesity [9], aterosclerose [10], hipertensão [11], a diabetes [12], fibrose cística [13] e cancros [14] . Recentemente Patel et al. relataram que uma assinatura de lípidos três (fosfolípidos) pode distinguir pacientes com CaP de indivíduos normais [8]. Por isso, procurou-se investigar o perfil lipídico completo que abrange várias classes de lípidos, incluindo os ácidos gordos, TGs, DG e fosfolipídios no soro de pacientes APC. Estas assinaturas de lipídios pode ser usado para triagem de pacientes CaP juntamente com testes de diagnóstico existentes com melhor especificidade e sensibilidade. Além disso, acreditamos que lipidomicapproach irá identificar lípidos e suas vias associadas, que podem desempenhar um papel na CaP initiationand progressão.

Materiais e Métodos

Chemicals

normas internas (heptadeconoic e ácido heptadecanoato de metilo), bem como ácidos gordos saturados e insaturados utilizados no estudo foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). solventes de qualidade analítica foram usadas para preparar as soluções concentradas de ácidos gordos. O etanol foi adquirido a partir de álcoois comerciais, Canadá. O metanol utilizado nas análises ESI-MS foi adquirido da Merck, Mumbai, índia. Diazometano em éter é usado para a esterificação (metilação) de ácidos graxos pelo método conhecido.

amostras clínicas e Ética Declaração

As amostras de soro e dados patológicos subsequentes foram coletados após obtenção do consentimento do paciente através do preenchimento do formulários de consentimento, que foram elaborados e aprovados pelo comitê de ética institucional. O comitê de ética institucionais e biossegurança do Instituto da Nizam de Ciências Médicas (NIMS) Hospital, Hyderabad, Índia aprovou o presente estudo. Para lipidomics, amostras de sangue foram coletadas de pacientes com valores de PSA elevados níveis séricos e exame patológico antes de qualquer cirurgia ou quimioterapia. As amostras de soro separadas do sangue total foram armazenadas a -80 ° C até os lípidos totais foram isoladas utilizando um processo de extracção com solvente.

Selecção de pacientes e de recolha de amostras

Para as amostras de soro apresentam estudo foram recolhidos a partir de 18 pacientes com níveis elevados de PSA diagnosticados com CaP de NIMS arquivo de amostra hospitalar para fins de pesquisa. Todos os pacientes selecionados para este estudo não foi submetido a qualquer tratamento e /ou cirurgia antes de coletar as amostras de sangue. Para confirmação da APC, o diagnóstico de cada paciente foi estabelecido pela histopatologia de biópsias de próstata. informações de cada paciente incluindo a sua idade, valor de PSA no soro e diagnóstico patológico tal como o grau do tumor e Gleason scoreis apresentados na Tabela 1. Para o grupo controle, 18 amostras de soro de controles masculinos foram obtidos a partir dispensário instituto onde os pacientes tiveram sua verificação de rotina para o bem-estar ou para o diagnóstico de outras doenças. Nós tínhamos definir um critério incluindo correspondência idade sem história de diagnóstico de PCA para recolher estas amostras de controlo. As amostras de soro foram recolhidos a partir de ambos os indivíduos do grupo de controlo de tumores e em da mesma maneira. A partir de cada indivíduo, 5 ml de sangue total foi recolhido num tubo Vacutainer contendo citrato trissódico. Os tubos foram deixados em repouso durante 10 minutos para a coagulação e, em seguida, centrifugadas a 3000 rpm para recolher soro. O sobrenadante claro a partir da superfície foi recolhido e armazenado como alíquotas separadas a -80 ° C até o uso.

Os parâmetros clínicos de tumores Gleason e os valores de PSA são fornecidos.

Isolamento /extracção dos lípidos totais de amostras de soro

total de lípidos de cancro da próstata e as amostras de soro normais foram extraídos como relatado anteriormente por modificações menores Bligh e Dyerwith [15]. Resumidamente, os lípidos foram extraídos de amostras de soro por substituição de clorofórmio com diclorometano (DCM) [16,17]. Uma alíquota de 30 ul de soro foi cravado withan padrão interno (1,5 ul de 50 uM heptadecanoato de metilo para análise de ião positivo ESI-MS ou ácido heptadeconoic para a análise de ião negativo ESI-MS), e adicionou-se 190 uL de MeOH. Os mixturewasvortexed durante 30 segundos e, em seguida, 380 ul de DCM foi adicionado à mistura e novamente agitada em vórtice durante 30 seg. Finalmente, para aumentar a eficiência de separação de duas fases, foi adicionado e misturado 120 uL de água em vortex durante 15 seg. Em seguida, a mistura foi deixada a equilibrar à temperatura ambiente durante 10 minutos e submetido a centrifugação a 8000g durante 10 min a 10 ° C durante a separação de fases. A camada superior foi cuidadosamente removido. A camada de DCM inferior rica em lípido foi recolhido em 1,5 ml de uma separada micro tubeandthe solvente foi evaporado in CentriVap sob vácuo a 4 ° C. Por fim, os extractos de lípidos secas foram reconstituídas em 100 ul de tampão (ACN /IPA /H

2O em 65: 30: 5 v /v /v) antes de se submeter a análise dirigir ESI-MS. Para a análise por GC-MS do extracto de lípidos secas foram ainda submetidos a metilação usando diazometano.

Ionização por Electrospray Espectrometria de massa (ESI-MS) análise

As experiências foram realizadas utilizando um quadrupolo tempo-de- espectrômetro de massa de voo (Qstar XL, Applied Biosystems /MDS Sciex, Foster City, CA, EUA), equipado com uma fonte ESI, a aquisição de dados usando software QS analistas (Applied Biosystems). Todas as amostras foram introduzidas na fonte por injecção de fluxo (malha 10 ul) usando metanol como fase móvel a um caudal de 0,03 ml /min. As amostras foram analisadas sob condições ESI positivos e negativos. As condições típicas ESI de ião positivo foram: tensão capilar, 5 kV; declustering potenciais (DP1), 60 V; DP2, 10 V; concentrando potencial, 250 V. As condições típicas ESI de ião negativo foram: tensão capilar, -4,5 kV; DP1, 60 V; DP2, 10 V; potencial de focagem, 250 V. completa espectros de massa de digitalização foram registrados sobre a faixa de massa de

m /z

50-2000 utilizando um tempo de voo analisador (TOF) com uma resolução de 10.000 Largura Total a Meia máxima. Utilizou-se azoto como gás de cortina e o gás de colisão, enquanto o ar foi utilizado como nebulizador. Para identificação da estrutura, a dissociação induzida por colisão (CID) os espectros foram registados seleccionando o ião precursor de interesse utilizando o quadrupolo, permitindo-lhes fragmento na célula de colisão, e separando os iões dos produtos pelo analisador TOF. As energias de colisão utilizados foram entre 5 a 25 eV. As condições experimentais utilizadas para amostras são as mesmas que para os padrões de referência. Todos os espectros foram relatados médias de 25 a 30 varreduras. composições elementares de todos os iões de precursor, bem como iões de produto foram obtidos a partir dos valores de massa precisas usando o software analista.

GC-EIMS análise

GC-EIMS análises foram realizadas com um Agilent 6890 cromatógrafo de gás (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) equipado com um detector de massa selectivo 5973N (MSD). coluna HP-5MS capilar (30 m x 250 mm, I.D: 0,25 um de espessura da película) foi utilizado para a separação cromatográfica do éster metílico de ácidos gordos (FAME) derivados. 1 mL da alíquota de amostra foi injectada no instrumento de GC-MS no modo de splitless tipo injecção. O forno do GC foi programada para aumentar de 50 ° C a 280 ° C a uma velocidade de 10 ° C min rampa /e temperaturas iniciais e finais foram realizadas durante 2 minutos e 5 minutos, respectivamente. tempo total de execução foi de 30 min. Hélio foi utilizado como gás transportador, a um caudal constante de 1 ml /min. A entrada e a temperatura de interface de GC-MS foram mantidos a 250 ° C e 280 ° C, respectivamente. analisador quadrupolar e fonte EI foram mantidos a 230 ° C e 150 ° C, respectivamente. O processamento de dados foi feito utilizando software MSD ChemStation (Agilent Technologies, EUA). O espectrómetro de massa foi operado em ambos varredura completa e monitoramento de íons selecionados modos (SIM). O espectrómetro de massa foi digitalizada a partir de

m /z

29-600 no modo de varredura completa da análise.

A metilação de ácidos graxos para a análise GC-EIMS

Método de extração do total lípidos de amostra de soro foi o mesmo que discutidos acima, excepto o último passo de reconstituição. Para a análise por CG-MS, extractos de lípidos séricos foram secas directamente submetido a metilação usando reagente diazometano, pelo que os ácidos gordos não-voláteis presentes nas amostras de soro foram convertidos em FAMEs voláteis. Os frascos de amostra contendo extractos de lípidos secas foram adicionados com 1 ml de diazometano recentemente preparado em solução de éter. Os frascos foram rapidamente agitada em vórtice durante 10 seg e deixada à temperatura ambiente durante 10 min. As amostras foram concentrados para 50 ul usando ScanVac. Os ácidos gordos padrão em etanol (0,3 mL de 5 uM), submetido a metilação usando o procedimento acima mencionado, após evaporação do etanol. Para a identificação de compostos, foram mantidas as mesmas condições experimentais para as amostras e padrões de referência.

Base de pesquisa

Dados

Os valores de massa precisas de todos os picos detectados (

m /z

) em ambos os modos positivos e negativos da análise de ESI-MS de extractos foram tidos em conta, e que foram pesquisados ​​nas bases de dados de metabolitos, com uma tolerância de massa de 5-10 ppm. As bases de dados incluem lipídicas Maps, Metlin (https://metlin.scripps.edu/index.php) eo Banco de Dados Metaboloma Humano (HMDB) (https://www.hmdb.ca./spectra/ms/search) [18 ]. As visitas de banco de dados (com valores menos ppm) em conjunto com os padrões de distribuição de isótopos foram utilizados para a identificação de pico. Alguns dos metabolitos críticos foram ainda confirmada por análise de MS /MS. O espectro MS /MS foram comparados com os dados disponíveis na literatura, bem como a biblioteca de lípidos americana Oil Chemists Society (AOCS) (https://lipidlibrary.aocs.org/ms/ms16/index.htm) [7]. Alguns lípidos também foram confirmados a partir de dados de GC-MS, comparando tanto os tempos de retenção dos padrões ou os espectros de massa EI disponíveis na biblioteca lipídico AOCS.

Estatística e análise bioinformática

O t-teste foi realizado para comparar as concentrações de espécies de lipídios identificados entre paciente e controle do câncer (sem PCA) grupos. As assinaturas de lipídios mostrando diferenças com mais de 1,5 vezes de aumento ou diminuir com o observado

p

valor 0.05were considerado como lipídios regulados diferencialmente entre os pacientes APC. Além disso uma análise não-supervisionada foi realizada para identificar as melhores assinaturas lipídicas que poderiam discriminar grupos de amostras normais e tumorais. A análise hierárquica de agrupamento (HCA), análise de componentes principais (PCA), as curvas de correlação e análise de partição foram aplicadas para os dados de quantificação obtidos. Além disso, com base na abundância de lípidos individualmente e /ou em combinações, foi utilizada a análise conceito formal (FCA) para prever a classificação das amostras. Método FCA é apropriado para descobrir relações significativas entre lipídios alterados e dados clínicos dos pacientes matematicamente pela ilustração gráfica [19]. Estas ilustrações couldenvisagetheoretical hierarquia através das amostras e dados assim produzidos podem ser usados ​​para descobrir dependência de dados entre os atributos de amostras (dados clínicos e lipídeos séricos alterados). Recentemente, FCA é comumente usado para o agrupamento teórico para identificar biomarcadores combinatória e co-regulação dos genes, proteínas e metabolitos [20,21]. No presente estudo, o método FCA foi aplicado para identificar qualquer correlação entre a abundância de lipídeos séricos ea classificação (grupos de tumor e controle) das amostras. Na análise FCA reticulados teóricas foram construídas com base em baixa ou alta abundância de lipídios para entender a dependência dos lipídeos séricos abundância com PCA e amostras normais. As treliças foram tiradas em combinações ou espécies de lípidos individuais classificados grupos de amostras com diferentes especificidades.

A proliferação celular ensaio

As linhas de células CaP humanos LNCaP (células dependentes de andrógenos) e PC3 (células independentes de andrógenos) foram obtidas da ATCC e mantidas em meio de crescimento normal (RPMI-1640 (Sigma) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), juntamente com 100 unidades /ml de penicilina e estreptomicina). Ambas as linhas celulares foram cultivadas em incubadora humidificada a 37 ° C, com um fornecimento constante de 5% de CO

2. contaminação por micoplasma em cultura de células foi controlada através de testes regulares, utilizando iniciadores específicos em RT-PCR. Para determinar o efeito do ácido alfa-linolénico na proliferação de linhas de células APC, as células LNCaP e PC3 foram semeadas em placas de 12 poços (1,0 x 10

6 células por poço) em meio completo. As células foram deixadas crescer durante 24 h, permitindo-lhes atribuem na superfície bem. Em seguida, as células foram tratadas com as concentrações indicadas de ALA (0-25 | iM) ou controlo de veículo (solvente em que o ALA é preparado). Para medir a contagem de células, as células foram colhidas em intervalos de tempo indicados e a viabilidade celular foi estimada usando condessa (Invitrogen) no analisador de viabilidade celular (Invitrogen). Ambos dependente do tempo, bem como o efeito dependente da concentração de ALA na viabilidade das células foi determinada em ensaios de proliferação. O efeito da ALA na morfologia celular foi determinado pela imagem das células ao microscópio (Olympus Xi72, Japão).

Resultados

As amostras de soro de normal (controle) e pacientes com câncer foram processados ​​de forma idêntica como descrito na secção experimental. As alíquotas de amostras foram então submetidos em alta resolução análise ESI-MS direta em modos de íons positivos e negativos.

ião positivo ESI-MS análise

A massa positiva espectros de iões ESI íons exibidos na faixa de

m /z

100-1000 devido a vários metabolitos (Fig 1A). À medida que as alíquotas de amostras foram analisados ​​por ESI-MS método directo, o que evita etapas de cromatografia e dessalinização, de Na

+ e K

+ iões presentes no soro permanecem nas alíquotas de amostra. Assim, os iões detectados pode ser protonado, sodiated e /ou moléculas, ou seja, [M + H]

+, [M + Na]

+ /[M + K]

+ iões e ou potassiated , respectivamente. Assim, os iões detectados no modo de iões positivos foram pesquisados ​​nas bases de dados para todas as espécies de íon de possíveis mencionados acima.

O banco de dados de resultados de pesquisa mostram que os picos thedetected no espectro de massa ESI incluem [M + H]

+ íons de fosfatidilcolinas (PCs), esfingomielinas (SMS), e fosfatidiletanolamina (PEs); [M + K]

+ íons de ácidos gordos (FAS), diglicéridos (DG), triglicerídeos (TGs) e ácido fosfatídico (PA); [M + Na]

+ íons de DG. Alguns dos metabolitos-chave foram confirmados por comparação dos seus dados MS /MS com a de normas correspondentes disponíveis nos bancos de dados. O valor da energia de colisão usado para os experimentos MS /MS foi de 28 eV para PEs, 30 eV para PCs e 20 eV para SMS. Quando as intensidades de iões precursor foram menores, cerca de 100-150 exames foram combinadas (em modo de MCA) para se obter os seus espectros MS /MS. O espectro MS /MS do [M + H]

+ iões de PC e PE e [M-H] – ião de FA são apresentados na figura 2A-2C. O espectro MS /MS de [M + H]

+ iões de moléculas fosfatidileolino gerar o ião do produto na

m /z 184

correspondente ao seu grupo de cabeça polar [22]. O espectro ESI-MS /MS de PC (37: 3) é mostrado na Figura 2A como um exemplo. O espectro mostrou o ião a

m /z 184

, o ião característico do PC, e o ião a

m /z 615

que fornece a informação sobre as porções acilo ligada ao glicerol . O ião a m /z 104 na região de massa baixa corresponde ao grupo colina. O espectro MS /MS de PE (42: 4) é mostrado na Figura 2B, que mostrou o ião do produto característico, devido à perda de 141 Da (ethanolaminephosphate) do [M + H]

+ ião, e este ião conhecido por ser específico para PE [23,24]. O outro produto de ião no espectro apareceu a

m /z 279

fornece a informação sobre um do radical acilo de PE como FA (18: 3). O espectro MS /MS de [M-H]

– ião de FA (20: 4) é apresentada na Figura 2C. Este espectro bem adaptado com o espectro MS /MS da FA padrão (20: 4) disponíveis no banco Metline

ESI-MS de iões negativos análise

O ESI de ião negativo. Os espectros de massa de extractos de lípidos mostrou [MH]

– iões de diferentes classes de espécies de lípidos (Figura 1B). Semelhante aos dados de iões ESI positivos, os valores de massa precisas dos picos detectados foram pesquisados ​​em bancos de dados para as identificações de pico. Com base nos resultados de pesquisa do banco de dados, os picos detectados no espectro foram encontrados para ser a [M-H]

– iões de ácidos gordos (FAS), DG e ácido fosfatídico (PA). Alguns dos ácidos gordos foram confirmados pelas experiências de EM /EM sobre a [M-H] –

iões. As energias de colisão utilizados foram de 25-30 eV para FAs. O espectro MS /MS de FA 20: 4 é mostrada na Figura 2D, como um exemplo típico e o espectro mostrou iões dos produtos característicos devido à perda de H

2O (18 Da) e CO

2 (44 Da) a partir de [MH]

– iões em adição ao ião do produto na

m /z

59 correspondentes para o ião acetato (CH

3COO

-). [25]

análise Diferencial A quantificação de lípidos

As abundâncias relativas dos picos detectados em amostras de controlo e de doentes foram normalizados com base na intensidade de pico do padrão interno. Os valores normalizados foram sujeitos para determinar assinaturas lipídicas regulados diferencialmente com o mínimo de 1,5 vezes de aumento ou diminuição em pacientes com câncer, em comparação ao grupo controle. ANOVA foi realizada para significância estatística ( 0,05) de lípidos alterados através dos pacientes com CaP. HRMS dados relativos às espécies de lípidos diferencialmente regulados com diferenças de dobragem correspondentes encontram-se resumidos na Tabela 2. Todos os lípidos foram identificados classificados em sete classes diferentes de PC, PA, PE, TG, DG, SPL e FA. Excepto ácidos gordos, restantes seis classes de lípidos foram mais elevadas em amostras de soro de pacientes do que os das amostras de controlo. Entre as classes individuais, TGs foram elevados em pacientes CaP em comparação com indivíduos saudáveis ​​normais.

Os metabolitos identificados nos extratos de lípidos das amostras de soro

agrupamento hierárquico e análise de partição.

O agrupamento hierárquico de amostras com base em lipídeos séricos alterados é apresentado na Figura 3. no mapa de calor, as amostras com maior expressão são de cor vermelha, enquanto as amostras com menor expressão, são verdes. As colunas representam amostras e as linhas indicam lipídeos alteradas no soro pacientes com câncer em comparação com indivíduos saudáveis. As distâncias entre os clusters são medidos por dendrogramas entre os clusters. A partir do mapa de calor observou dois grupos distintos dividir as amostras de tumor e normal com apenas pequena excepção. No entanto, agrupamento hierárquico revelou que 17 de 18 amostras de tumores (vermelho) formaram um cluster discreta. Em caso de controles, 14 amostras (verde) aglomeraram-se junto ao passo que as outras quatro amostras tornou-se parte do cluster amostras de tumor. No agrupamento bidimensional, também fez uma tentativa para identificar qualquer classe de lípidos específica formando um cluster que está, principalmente, que determina os grupos de tumores e de controlo. Os dendrogramas observados confirmar que não cluster é formado com a classe de lípidos simples (FA, PE, PA, DG, PC e TG) (Fig 3). Com base nos grupos observados, foi realizada análise de PCA e partição auxiliar. A partir da abundância relativa obtida de lipídios, um gráfico de dispersão com três primeiros componentes principais mostra uma boa separação entre pacientes e controles (Fig 4A) cancerosas. A partir da análise PCA é claramente visível que todos os tumores formado um componente único (azul), apenas uma amostra de tumor tornou-se parte do componente de grupo controle (vermelho) com base em 24 lipídios identificados. No entanto, como relatado por Lukk et ai. apenas um biomarcador diferencial indivíduo entre o cancro e grupos normais não é satisfatória para classificar amostras clínicas com 100% de especificidade e sensibilidade [26]. Portanto, a análise de partição foi realizada para determinar as assinaturas lipídicas potenciais para a classificação das amostras em respectivo grupo marcado. análise de partição dos valores de abundância relativa destacou dois lípidos, FA (22: 3) e PC (39: 6), que pode classificar as amostras com maior especificidade (teste de Fisher com

p

-valor 1.612e-06). Sob esta função de partição se FA (22: 3) é ≥ 0,045 ppm e PC (39: 6) é ≥ 0,145 ppm, 100% de sensibilidade (18 amostras de controlo classificadas correctamente PCA) e 77,7% de especificidade (de 18 amostras de tumor de 4 amostras são classificados erroneamente) poderia ser alcançada na classificação de doentes com cancro do grupo normal correspondente (Fig 4B). os resultados da análise partição também indicaram que os outros lipídios identificados em combinações podem classificar todas as amostras de forma adequada. A partir destes resultados é evidente que mais de um lípido da mesma classe ou de classe diferente pode distinguir amostras de tumores e de controlo com maior especificidade e sensibilidade.

sobre o mapa de calor pacientes foram mostradas horizontalmente enquanto que os lípidos verticalmente. Na cor superior barrar os pacientes com câncer são marcadas em vermelho, os controles são mostrados em verde. Na barra de cor lado cada cor representa uma classe específica de lipídios. Os dendrogramas representam a distância entre os clusters

(A) Análise de Componentes Principais (PCA):. Gráfico de dispersão dos três principais componentes principais de PCA da abundância relativa dos dados de lipídios obtidos de câncer e normal indivíduos. As bolas azuis indicatePCa pacientes, enquanto bolas vermelhas mostram indivíduos não canceroso. (B) Análise conceito formal de visualizar a triagem de amostras com base na abundância relativa de PC (39: 6) e FC (22: 3) em PCA (quadrados vermelhos) em comparação com o controlo (quadrados pretos). Esta visualização dependente dos dados foi realizada para mostrar a eficiência partição de lipídios individualmente e /ou em combinação para identificar lípidos assinatura de potencial biomarcador.

Para entender melhor a variação dos lípidos que alterou em pacientes APC, um análise de correlação foi realizada de uma forma de pares de visualizar a dependência entre os níveis de abundância de lipídios identificados e amostras de soro. análise de correlação permite a identificação de lipídios co-regulação e identifica relações entre as amostras dentro de um estudo. Os mapas de calor correlação resultantes de níveis de abundância transformou-log de lipídios utilizando os coeficientes de correlação de Pearson claramente diferenciado grande número de pacientes com câncer com uma única exceção (Fig 5). Além de correlação amostra-amostra, correlação entre lipídios que fixem a sua co-regulação identificou um grande aglomerado de lípidos contendo 3 PEs, 2 PCs, 3 TGs e 1 DG. Em particular PCs e PEs agrupados mostrando boa co-regulação da sua abundância de soro (Fig 6).

Clustering em coeficientes de correlação demonstra claramente grupo amostras (tumor ou normal) com base nos níveis de abundância de lipídios diferenciais.

cromatografia gasosa com espectrometria de massa por ionização de elétrons (GC-EIMS) analisa

Os ácidos gordos podem ser analisados ​​por GC-MS após derivatização (por exemplo, esterificação, sililação etc. ). No presente trabalho, os ácidos gordos foram metilado por diazometano e os EMAGs foram submetidos a GC-MS analisa sob ionização de elétrons condições (EI). Os espectros de massa de FAMEs EI estão disponíveis na biblioteca lípido AOCS (https://lipidlibrary.aocs.org/ms/ms16/index.htm). Os espectros disponíveis incluem estrutura característica iões do fragmento indicativo. Os espectros também estão disponíveis em bibliotecas comerciais EI (Wiley e NIST), bem como nos relatórios publicados anteriormente [27]. Por isso, é fácil de identificar os FAMEs na análise por GC-MS, pesquisando o espectro alvo contra a biblioteca EI. Temos usado a biblioteca e /ou padrões de EI para identificar os ácidos graxos. No presente estudo, como esperado, os ácidos graxos saturados mostrou predominantemente dois iões fragmentados característicos no

m /z

74 e 87 enquanto que ácidos graxos poliinsaturados mostrou o ião fragmento a

m /z

79 na região de massa baixa do espectro. Os espectros EI de ésteres metílicos de ácido heptadecanóico (17: 0), ácido linolénico (18: 3) e ácido araquidónico (20: 4) são apresentados na S1A para S1B Fig. Poderíamos facilmente caracterizar ácidos graxos elevados abundantes de seus espectros de massa EI (análise de modo de varredura completa). No caso dos ácidos gordos de baixo abundantes, realizamos ensaios de GC-MS em modo de SIM, seleccionando iões fragmento específico de ácidos gordos alvo. Neste tipo de análise, dos parâmetros de retenção dos compostos alvo são cruciais. Por conseguinte, antes de experiências SIM, os tempos de retenção dos ácidos gordos alvo foram confirmadas utilizando os padrões. Ao aplicar o método GC-MS (SIM), que confirmaram a presença de ácido linolénico e ácido araquidónico em amostras de extracto lipídico. Os ésteres metílicos de ácido linolénico (18: 3) e ácido araquidónico (20: 4) foram eluidas nos tempos de retenção de 20,9 e 22,3 min, respectivamente (Fig 7). A presença destes dois ácidos gordos foram ainda confirmadas por cravação os padrões no extracto lipídico e executar análise de modo GC-SIM, após esterificação, onde estes dois ácidos gordos apareceu nas mesmas RTs como a da amostra (Figura 7).

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