Abstract
modelagem estatística adjacente, em combinação com técnicas de expressão profiling genome-wide, tem demonstraram que o estado molecular do tumor é suficiente para inferir o estado patológico. Estes estudos têm sido extremamente importante no diagnóstico e têm contribuído para melhorar a nossa compreensão da biologia do tumor. No entanto, a sua importância na compreensão profunda de câncer fisiopatologia pode ser limitado, uma vez que não têm explicitamente em consideração o papel fundamental do microambiente do tecido na especificação fisiologia tumor. Por causa da importância das células normais na formação do microambiente tecido que formular a hipótese de que os componentes moleculares do perfil das células epiteliais normais adjacentes ao tumor são preditivos da fisiologia do tumor. Abordámos esta hipótese através do desenvolvimento de modelos estatísticos que apontam perfis de expressão de genes que representam o estado molecular das células epiteliais normais adjacentes às características do tumor no câncer de próstata. Além disso, a análise de redes mostrou que genes preditivos estão ligados à atividade de fatores secretados importantes, que têm o potencial de influenciar a biologia do tumor, como IL1, IGF1, PDGF BB, AGT e TGF
Citation:. Trevino V, Tadesse MG, Vannucci M, al-F Shahrour, Antczak P, S Durant, et ai. (2011) Análise do Normal tumor-Tissue Interação em tumores: Previsão do câncer de próstata Características do perfil molecular das células normais adjacentes. PLoS ONE 6 (3): e16492. doi: 10.1371 /journal.pone.0016492
editor: Diego Di Bernardo, Fondazione Telethon, Itália |
Recebido: 04 de agosto de 2010; Aceito: 03 de janeiro de 2011; Publicado: 30 Março 2011 |
Direitos de autor: © 2011 Trevino et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Victor Trevino foi um destinatário de um Darwin Confiança Fellowship e CONACyT. Este trabalho é em parte financiado por doações do CRUK (C8504 /A9488), Ministério da Ciência espanhol e Inovação (BIO2008-04212), GVA-FEDER (PROMETEO /2010/001). Os autores também agradecer o apoio do Instituto Nacional de Bioinformática (www.inab.org) eo RTICC (RD06 concessão /0020/1019) ambas as iniciativas do Instituto de Salud Carlos III (MICINN). Marina Vannucci é parcialmente financiado pelo NIH-NHGRI R01-HG003319. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
a aplicação de tecnologias de genómica funcional, particularmente expressão gênica profiling, tem proporcionado a comunidade científica com as ferramentas para caracterizar o estado molecular de células e tecidos em um nível genoma. Estas tecnologias, juntamente com a capacidade para dissecar os tipos específicos de células a partir de um tecido complexo criaram uma oportunidade única para caracterizar a identidade molecular de tipos de células específicas no contexto de um tecido complexo [1]. Seguindo esta abordagem, a expressão do gene perfilamento ter sido aplicada para gerar o perfil de transcrição de células tumorais que são preditivos de ambas as características de tumor e os resultados clínicos de uma variedade de cancros humanos [2]. Muitos estudos do genoma, porém, são muitas vezes analisadas não tendo expressamente em consideração que os componentes da matriz extra-celular (ECM) (proteínas de matriz, solúvel crescer factores e quimiocinas) secretado por células normais, adjacentes ao local do tumor, influenciam fortemente a biologia do tumor. Recentemente, células estromais surgiram como candidatos principais para jogar um papel na interação célula-tumoral normais [3]. Estas células segregam a maioria das enzimas envolvidas na degradação de ECM, por exemplo, que produzem factores de crescimento que têm um papel no controlo da proliferação de células de tumor, apoptose, e a migração. Eles também secretam citoquinas pró-inflamatórios envolvidos na quimiotaxia e activação de leucócitos específicos e, por conseguinte, desempenham um papel na determinação de respostas inflamatórias [4]. Os factores de crescimento e citocinas também estão envolvidos na transformação neoplásica de células de tumor, angiogénese, crescimento e expansão clonal, a passagem através da ECM, intravasamento em sangue ou vasos linfáticos e o homing não-aleatória de metástase de tumor para locais específicos. Muitos destes factores também são segregadas pelas células epiteliais normais, células do sistema imune e células endoteliais em proximidade da massa tumoral. Também tem sido mostrado que o estroma pode ter impacto sobre a resposta à terapia anti-tumoral. Com efeito, a presença de leucócitos CD11b + confere resistência à terapia anti-angiogénese [5].
Além disso, o pré-tratamento do estroma com moléculas anti-angiogénese antes da implantação do tumor em modelos de tumor de rato pode, paradoxalmente, aumentar o desenvolvimento do tumor [6], [7]. Isto ilustra que a qualidade do estroma tumoral pode influenciar significativamente o desenvolvimento do tumor.
A importância do micro-ambiente para determinar o aparecimento e progressão do cancro surge a questão de saber se é possível prever a fisiopatologia e o resultado clínico do tumor a partir de componentes específicos do estado molecular de células normais. Se possível, seria de esperar estas assinaturas moleculares para representar componentes importantes de cross-talk-célula envolvida em especificando o desenvolvimento de câncer.
Nós abordou esta questão através do desenvolvimento de modelos estatísticos com base em um genoma de largura de perfil do normal tecidos adjacentes ao tumor e identificar aspectos que são preditivos de características cancerígenas.
Analisamos dois diferentes conjuntos de dados de microarranjos de câncer de próstata disponíveis no domínio público [8], [9]. Mostra-se que em ambos os conjuntos de dados do estado molecular de células adjacentes ao tumor é preditiva de características de cancro clinicamente relevantes. Estas vias são assinaturas moleculares informativos e representam vias envolvidas na produção e resposta a fatores secretados.
Estes resultados suportam a relevância potencial de biópsias em tecidos normais no diagnóstico e prognóstico de câncer de próstata. Esta abordagem também fornece uma estratégia de análise geralmente aplicável para identificar vias principais envolvidos na célula para célula comunicação.
Resultados
Modelação estatística estabelece uma ligação entre o estado molecular das células normais e tumorais histo-patológicas características
o objetivo inicial da nossa análise foi testar se o perfil molecular das células normais é preditiva de características cancerígenas. Nós inicialmente considerados dois aspectos importantes da fisiologia do tumor de próstata: o grau de organização das células tumorais definidos por um sistema de pontuação histo-patológica chamada pontuação de Gleason, e a capacidade das células tumorais de penetrar a cápsula órgão resumidos por uma contagem binária histo-patológica chamada penetração capsular. O nível de diferenciação de células de tumor mede a tendência das células para se agregar em estruturas glandulares do tipo que são reminiscentes da organização do tecido normal. A classificação de Gleason pode ser utilizado para definir duas classes principais. O primeiro caracteriza-se por tumores de baixo grau que exibem uma estrutura altamente organizada (correspondente a uma pontuação inferior ou igual a 6), enquanto que uma segunda classe é caracterizado por células de tumores de grau elevado, que são dispersos na matriz e não apresentam uma tendência para formar estruturas glandulares-like (correspondente a uma pontuação superior ou igual a 7). Em contraste penetração capsular descrever a medida em que as células tenham evadido da cápsula que envolve a próstata.
A nossa análise teve como objetivo vincular o perfil molecular das células normais a nível de diferenciação (baixa contra alta diferenciação) e penetração capsular (positivo contra o negativo). Isto foi conseguido através do desenvolvimento de modelos estatísticos que foram com base no perfil molecular das células normais e preditiva das classes de amostra, especificamente Gleason score e penetração capsular.
Para este efeito, foi aplicado duas diferentes abordagens de modelagem multivariada ( métodos BVS) para dois conjuntos de dados independentes desenvolvido por Singh et al GA-MLHD e. [9] e por Lapointe et ai. [8]. As duas abordagens de modelagem estatística são projetados para procurar marcadores multi-gene que maximizam a distinção entre as classes de amostra. Usando estes métodos, que foram desenvolvidos modelos representativos que foram preditivo de características do tumor por meio do perfil das células normais a expressão do gene. precisão e tamanho desses modelos de classificação foram comparáveis para os desenvolvidos usando o estado molecular de células de tumor (Tabela 1). modelos representativos desenvolvidas com os métodos BVS e GA-MLHD representam subconjuntos preditivos que estão baseados num número de genes muito semelhantes e possuem um elevado grau de sobreposição ao nível do gene, o que sugere que os nossos resultados são independentes do método usado (Figura 1 e As Figuras S1, S2 e S3). Consistente com a relativamente pequeno grau de sobreposição entre as plataformas de microarray ( = 8%, consulte a secção de Processamento de Dados no Texto S1 para detalhes), os modelos representativos desenvolvidos a partir dos dois conjuntos de dados independentes não têm genes em comum
.
a figura mostra os mapas de calor representando o perfil de genes seleccionados pelos modelos GA e BVS em ambos os conjuntos de dados Lapointe e Singh a partir dos dados de tecidos normais expressão. Cada quadrante da figura representa uma combinação de uma abordagem de modelagem e um conjunto de dados específico. Genes presentes em GA-MLHD e BVS para o mesmo conjunto de dados são destacadas em vermelho. Precisão é relatado abaixo de cada heatmap. número de acesso GeneBank e símbolo do gene são mostradas no lado esquerdo do mapa de calor. Brilhantes cores verde ou vermelho em heatmaps representam expressão relativa inferior ou superior, respectivamente. t-teste p-valor é mostrado para comparação com os critérios de expressão diferencial normalmente usados em abordagens de seleção de variáveis univariadas.
Uma análise mais aprofundada da contribuição relativa dos genes individuais para a separação da amostra foi realizada utilizando uma análise de componentes principais (Figura 2). Esta abordagem revelou que os genes envolvidos em vias de comunicação celular são preditivos de penetração da cápsula. Dentro do conjunto de genes selecionados pelo GA no conjunto de dados tecido normal, uma combinação de maior expressão do gene
PRELP
e uma menor expressão dos genes
UBE4A
,
ZNF146
nas células normais foi preditiva de penetração capsular tumor. No conjunto gene desenvolvido pela aplicação do procedimento BVS no conjunto de dados tecido normal, uma alta expressão de
PPP2R4
,
PRELP
,
CALLA
,
ISG20L2
foi preditiva de penetração capsular tumor. Os modelos desenvolvidos a partir do conjunto de dados Lapointe revelou que menor expressão de
OAT Comprar e maior expressão de
PCGF5
e
MYCN
no modelo GA e menor expressão de
IGF1 Comprar e
PRAC Comprar e maior expressão de
PCGF5
e
CPSF7 Quais são preditivos de penetração capsular.
a figura mostra o resultado de um PCA representando a separação da amostra em função da expressão no tecido normal de genes seleccionados pelos procedimentos de modelação. Cada quadrante da figura representa uma combinação de uma abordagem de modelagem e um conjunto de dados específico. Cada quadrante contém uma trama 2D representando a separação de negativo penetração capsular (círculos pretos próximos) e (círculos próximos vermelho) positivos amostras (lotes B, D, F e H) e um gráfico de barras (lotes A, C, E e G) representando as cargas de PC (eixo x) para cada componente do gene (eixo y). Note-se que as cargas de PC representam a contribuição de cada gene para a separação de classes. As linhas tracejadas delimitada genes com maior contribuição que são discutidos no manuscrito. Genes presentes em GA-MLHD e BVS para o mesmo conjunto de dados são destacadas em vermelho.
A ligação entre normal e tumor mostrado nesta análise também é apoiado por uma análise univariada que temos realizado utilizando uma ampla espectro de metodologias disponíveis (Figura S4).
Especificidade de assinaturas genéticas preditivas de características histopatológicas câncer
adjacentes tecidos normais e tumorais são morfologicamente distintas. No entanto, eles mostram um grau de similaridade molecular que é em parte uma consequência de compartilhar a mesma micro-ambiente [10]. Por isso, se perguntou se os modelos preditivos temos desenvolvido a partir de células epiteliais normais representam uma assinatura molecular que é específico para o tecido normal, ou se a expressão dos genes preditivos em células tumorais pode também ser preditivo de características de tumor. A fim de abordar esta hipótese, tomamos genes selecionados por nossas estratégias de modelagem desenvolvidos a partir de conjuntos de dados de tecido normal e testaram se a sua expressão na edição de tumor foi preditiva de características cancerígenas.
Nós também desafiou a precisão da previsão de modelos desenvolvido a partir dos dados de tumor efectuando a comparação correspondente no conjunto de dados normal. Em ambos os casos, a precisão de previsão dos modelos é cerca de 50% (o que corresponde ao esperado precisão de uma suposição aleatório) (Figura 3). Por conseguinte, esta análise mostra que as assinaturas moleculares que identificamos são específicos para os tecidos (normal ou tumor) foram selecionados para representar.
A precisão da previsão dos modelos desenvolvidos usando tecido normal (Painel A, círculos preenchidos ) é comparável aos modelos desenvolvidos usando tecido tumoral (painel B, diamantes cheios). Quando os modelos desenvolvidos usando tecido normal são treinados e testados utilizando dados do tecido tumoral, o poder de predição é diminuído consideravelmente (círculos vazios). Da mesma forma, modelos de tumor treinado e testado com dados de tecido normal também são preditivos (diamantes vazias) não.
redes funcionais ligadas ao assinaturas preditivos representam perfis de expressão células epiteliais normais incluem importantes sinais de citocinas e fatores de crescimento
a fim de facilitar a interpretação biológica dos genes representados em nossos modelos estatísticos utilizou-se o software de análise de IPA para executar uma análise em profundidade ao nível da rede. Para garantir a nossa análise cobriu a gama de soluções possíveis, foram utilizados como entrada para o software de IPA a lista de genes representados na colecção de modelos preditivos identificados a partir do tecido normal, o procedimento de GA. Estes abrange um espectro mais amplo da relação espaço solução para os modelos representativos descritos acima (Figura 1 e 2) e representam 239 e 259 genes para Singh e Lapointe conjuntos de dados, respectivamente. Nesta análise, focada na penetração capsular por causa de sua importância clínica e prognóstico. A análise da rede foi realizada de forma independente nos dois conjuntos de dados e as redes mais importantes (estatisticamente significativos e com genes-alvo de 50% representados na rede). Foram selecionados para análise posterior
Em ambos os conjuntos de dados, genes preditivos foram parte de redes que ligam moléculas extracelulares, tais como a citocina pró-inflamatória
IL1β
, as quimiocinas pró-metastáticos
CX3CL1
e
CCL20
e os fatores de crescimento
IGF1
,
TGF
e
PDGF BB
com a atividade da transcrição nuclear fatores
NFkB
,
HF4A
,
TP53
e
MYC
.
Figura 4 descreve as redes mais significativas identificadas pelo representante aplicação IPA dos modelos com base no estado molecular das células normais e preditiva da penetração capsular na Lapointe et al . conjunto de dados (ver Tabela S2 para a lista completa de redes significativas identificadas pelo IPA). A Figura 4A mostra uma rede representada pela interacção entre a citocina pró-inflamatória
IL1β
e o factor de transcrição
NFkB. Figura 4B-D representam três sub-redes interconectadas que envolvem a interação entre vários fatores de crescimento genes e os fatores de transcrição P53 (
TP53
) e C-MYC (
MYC
). Mais especificamente, a Figura 4C representa uma rede, incluindo o crescimento factores
IGF1
, seu receptor
IGF1R
e
PDGF BB
. Figura 4B representa a interação entre a fatores extracelular angiotensina (
AGT
), o fator de crescimento
TGF Comprar e o ligando do receptor Notch Jagged (
JAG
). Figura 4D, por outro lado representam genes que estão directa ou indirectamente ligados ao factor de transcrição de c-myc (
MYC
).
A figura representa os quatro redes mais significativos seleccionados pelo IPA Programas. Os genes representados por formas azuis estão presentes na colecção de modelos recolhida pelo procedimento GA-MLHD. Genes representados com formas vermelhas representam genes na coleção de modelos, mas também incluídos nos modelos mais preditivos representativas. Genes nas redes são organizadas por localização celular (extracelular, membrana, citoplasma e núcleo). Note-se que a pesquisa de software IPA para sub-redes estatisticamente significativos de um determinado tamanho máximo para simplificar a sua visualização. No entanto, neste caso os mesmos sejam interligados como indicado por tracejada vermelha setas que ligam os componentes de rede específicas.
Os quatro principais redes mais significativos identificados a partir do conjunto de dados Singh (Figura S5) representam genes ligados às mesmas citocinas e fatores de crescimento identificada no conjunto de dados Lapointe. Esta observação sugere que interessante, apesar da quantidade limitada de sobreposição ao nível do gene, modelos derivadas do conjunto de dados pode representar duas redes moleculares funcionalmente semelhantes.
A expressão de citocinas preditivos, factores de crescimento e seus receptores na progressão do cancro da próstata
a fim de melhorar a compreensão do significado biológico das redes IPA analisamos a expressão de genes em diferentes fases de progressão do câncer de próstata. Estamos focados na investigação sobre um pequeno subconjunto de 20 genes que representam os fatores secretados incluídas nas redes IPA e seus receptores (Tabela S3).
Com o objectivo de limitar a interferência de contaminantes de células do estroma, selecionamos um conjunto de dados representando um microarray de sete tipos de populações de células normais e epiteliais do tumor, purificada por laser de captura de micro-dissecção (LCM) relatados por Tomlins et al. [11]. Estes, células da próstata normais incluídos purificados a partir de próstatas saudáveis (NOR), células normais de hiperplasia benigna da próstata (BPH), as células normais adjacentes ao tumor (ADJ), células tumorais de neoplasia intra-epitelial prostática (PIN), células tumorais de carcinoma da próstata de baixa qualidade (L-PCA), as células tumorais de carcinoma da próstata de alto grau (H-PCA) e as células tumorais de metástases do câncer de próstata (Meta).
Nossa hipótese é que desde os 20 genes foram selecionados foram incluídos em modelos altamente preditivos tumor de penetração da cápsula, eles podem também ser expresso diferencialmente durante a progressão do cancro da próstata. Testamos esta hipótese comparando as sete populações de células LCM. Descobrimos que uma grande proporção surpreendente destes genes foram expressas diferencialmente (75%, p
0,001
e 95% a
P 0,05
) (Tabela S3, Figura 5, S7 e S8). Um apoio adicional para a relevância da assinatura de expressão gênica tínhamos identificado veio da observação de que os dois clusters dimensional análises realizadas utilizando a matriz de perfis de expressão gênica diferencial (expressão média de cada grupo), recapitulou a relação esperada entre as diferentes fases do o desenvolvimento de cancro da próstata (Figura 5A). Mais precisamente, as populações de células normais agrupados seguido por PIN e um conjunto de L-PCA e H-PCA. O grupo de células metastático agrupados de lado.
A figura representa os resultados da análise realizada com o conjunto de dados desenvolvido por Tomlins et al. [11]. populações celulares diferentes são identificados como se segue. As células normais (norm), células normais adjacentes ao tumor (ADJ), hiperplasia benigna da próstata (MPH), o carcinoma da próstata de grau baixo (L-PCA), o carcinoma da próstata de alto grau (H-PCA) e células metastáticas (meta). O painel A mostra uma análise bi-dimensional de cluster realizada sobre os genes diferencialmente expressos (
P 0,01
) entre as populações de células epiteliais normais e tumorais purificados sete LCM. O painel B representa o nível de expressão (eixo y) de genes expressos diferencialmente entre norma, adjacente e BPH (representada no eixo y). Níveis de genes individuais em todos os estágios são apresentados em painéis CF e na Figura S8.
De relevância para a compreensão da base biológica do poder preditivo da assinatura células normais é a observação de que as células normais adjacentes ao tumor apresentaram diferenças significativas em relação às células normais e BPH (Figura 5B). Cinco genes (
IL1R, LOX
e
TGFBR, CX3CL1
e
Cyr61
) foram diferencialmente expressos entre as três populações de células normais. Mais especificamente, as células normais adjacentes ao tumor (Norma) foram caracterizados por uma menor expressão do gene supressor de tumores
LOX
, os receptores para a interleucina 1 (
IL1R) e
TGFp
(
TGFBR
) e por uma maior expressão dos genes pró-tumorais
Cyr61
e
CX3CL1
.
em seguida, examinaram a expressão de genes individuais nas diferentes fases da progressão do tumor em relação às redes identificadas pelo software IPA (Figura 4).
a citocina
IL1β
, identificado por análise de IPA como relacionado com o activação das quimiocinas pró-metastáticos
CX3CL1
e
CCL20 (Figura 4A), foi regulado para cima nas populações de células tumorais PIN e H-PCA (Figura 5A, 5C) e, enquanto a expressão de
IL1R1
, que mediou a actividade de
IL1β
, segue uma tendência oposta (Figura 5A, B e C). A quimiocina pró-metastático
CX3CL1
foi expresso em níveis mais elevados em relação adjacente população de células de PIN, L-PCA e H-PCA mas não em células Meta (Figura 5E). A expressão do
gene LOX
foi encontrado superior em todas as populações de células tumorais em relação a células adjacentes e normais (Figura 5F) consistente com o fato de que a maior expressão de
LOX
tem sido associada à hipóxia metástases induzida no peito, cabeça, cancros cervicais [12], [13].
A expressão de
AGT
,
TGFB
e
JAG1
foram ligados numa rede diferente IPA (Figura 4B). A expressão de Angiotensinogênio (
AGT
) é maior em células adjacentes em relação ao PIN, L-PCA e H-PCA enquanto
JAG1
segue uma tendência oposta (para baixo regulamentada em células adjacentes respeitar a L -PCA, H-PCA e Meta). Se o angiotensinogénio é produzida a níveis mais elevados em células adjacente a uma das enzimas de activação que convertem o produto da
AGT
gene em angiotensina II (
ACE
) é, em vez maior em PIN e L-PCA , sugerindo que o potencial para a utilização em células de tumor em estágios mais baixos de desenvolvimento do cancro da próstata. A constatação de que
AGT
e
JAG1
têm tendências opostas suporta a hipótese de que
AGT
pode reprimir a expressão de
JAG1
(Figura S8 painéis E e F). Esta ligação foi relatado pelo software IPA (Figura 4B), mas foi suportado por um modelo experimental de cultura de células endoteliais [14]. Estes resultados são consistentes com a hipótese de que esse mecanismo também podem ser relevantes no cancro da próstata.
A terceira rede IPA representa a interação entre os fatores promotores de tumor
IGF1, PDGF BB Comprar e
Cyr61
(Figura 4C). Embora a expressão de
PDGF
é constante em todas as populações de células, o seu receptor (
PDGFR
) é mais elevada em populações de células Meta H-PCA e em comparação com as células adjacentes. A expressão de
Cyr61
é maior em células adjacentes relação ao pino e populações de células Meta (Figura S8).
Discussão
Nós demonstramos que as assinaturas de células epiteliais normais são preditivos características de importantes de câncer de próstata. Esta descoberta tem implicações clínicas potenciais como for sugere que o estado molecular das células normais tem valor prognóstico. Ao nível molecular, análise de rede revelou que a nossa abordagem tem o potencial para identificar genes envolvidos na patogénese da doença. Estes incluem genes que codificam citocinas chave e factores de crescimento expressos por células epiteliais normais e que podem influenciar a biologia do tumor.
produção de citocinas induzida por quimiocinas pró-metastáticos
A rede mostrada na Figura 4A