Abstract

Um peptídeo rica em prolina salivar de 1932 Da mostrou uma relação dose-dependente antagônica efeito sobre a Ca citosólico

2+ mobilização induzida por progesterona em uma linha de células de carcinoma escamoso da língua. Estudos de estrutura-actividade demonstraram que a actividade do péptido reside na região C-terminal caracterizado por um estiramento prolina flanqueada por resíduos básicos. Além disso, a falta de actividade do análogo de péptido retro-inverso sugerido o envolvimento de reconhecimento estereoespecífico. análise espingarda de massa à base de espectrometria, combinado com ensaios de Western blotting e os dados bioquímicos obtidos com o AG205 inibidor da progesterona receptor de membrana Componente 1 (PGRMC1), mostrou uma forte evidência de que p1932 executa a sua acção moduladora através de uma interacção com o PGRMC1 receptor de progesterona, que é predominantemente expresso nesta linha de células e, claramente, desempenha um papel importante na progesterona induzido Ca

2+ resposta. Assim, nossos resultados apontam para p1932 como um modulador da via de transdução de sinal mediada por esta proteína e, dado um envolvimento bem estabelecida de PGRMC1 na tumorigênese, realce um possível potencial terapêutico de p1932 para o tratamento de câncer oral.

Citation: Palmerini CA, Mazzoni M, Radicioni G, Marzano V, Granieri L, Iavarone F, et al. (2016) antagônico Efeito de um salivar Proline-Rich Peptide no Ca citosólico

2 + mobilização induzida por progesterona em Oral Cancer Cells escamosas. PLoS ONE 11 (1): e0147925. doi: 10.1371 /journal.pone.0147925

editor: Alessandro Datti, Instituto de Pesquisa Lunenfeld-Tanenbaum, Canadá |

Recebido: 27 Abril 2015; Aceito: 11 de janeiro de 2016; Publicação: 27 de janeiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Palmerini et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel. Os arquivos referentes aos resultados de espectrometria de massa elaborados relatadas no manuscrito são conservados em nossos instrumentos gravações

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por Nando Peretti Foundation, Universidade Católica de Roma, Universidade Cagliari, MIUR e Regione Sardegna de acordo com seus programas de divulgação científica. O trabalho também foi apoiado por FaReBio dQ 2012 projeto CNR. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a saliva é um líquido misturado, que é segregada pelas maiores e menores glândulas salivares localizadas na cavidade oral [1], e que exerce várias funções de protecção e digestivos [2]. Estas funções estão ligados à saliva composição dinâmica [3, 4], e por esta razão, os esforços significativos têm sido dedicados à definição do proteoma salivar [5] com mais de 2500 proteínas diferentes já foram identificadas [6]. Estes podem ser divididos em proteínas segregadas a partir de glândulas salivares, que incluem componentes de 400-500 correspondente a aproximadamente 90% de todo o proteoma, peso salivar e proteínas provenientes de outras fontes (mais de 2000), que representam menos de 10%.

proteínas e péptidos derivados a partir de secreções da glândula salivar incluem mucinas, a-amilases, histatinas, statherin, péptido Pb, S-cistatinas, lipases, transportador lipídico (lipocalina), e proteínas ricas em prolina (PPR), dividido em ácido (aPRPs), básicos (bPRPs) e glicosilada de base (gPRPs) [4]. A atribuição de funções específicas para as diversas componentes e famílias é exigente, provavelmente porque cada família exerce funções múltiplas e integradas, e porque as proteínas salivares são dispersos aleatoriamente em solução [7-11].

bPRPs, o produto de expressão de quatro loci multi-alélicas nomeados PRB1-4, são uma família muito heterogéneo de peptídeos devido a polimorfismos extensas, splicing alternativo e modificações pós-traducionais. Após secreção, bPRPs é parcialmente clivada em péptidos mais pequenos que variam de 8 a 25 resíduos de aminoácidos de diferentes proteases exógenas [12]. Esses peptídeos têm sequências primárias peculiares que muitas vezes se sobrepõem uns aos outros ascensão dando a um vasto conjunto de moléculas semelhantes, em alguns casos, apenas diferindo por um resíduo.

Um destes péptidos (1932 Da, p1932) foi patenteado pela sua actividade anti-viral forte [PCT /IB2012 /050415] e recentemente foi encontrado para ser internalizado no interior das células da mucosa oral [13]. Diversas experiências realizadas a fim de avaliar os efeitos biológicos do péptido evidenciado a sua influência sobre a homeostase do cálcio no interior das células. A modulação do Ca citosólico

2 + concentração ([Ca

2 +]

c) é um importante evento que ocorre em uma célula desde Ca

2 + concentração medeia muitos eventos biológicos, tais como a proliferação celular , a diferenciação, o metabolismo, a contração do músculo, apoptose e resposta imune [14], bem como a exocitose de vesículas sinápticas na libertação de neurotransmissores [15].

homeostase do cálcio em células de mamífero é um fenómeno complexo e resultados do equilíbrio entre as lojas de cálcio do retículo endoplasmático e trocas de íons com o meio extracelular. A progesterona, através de efeitos genómicos e não genómicos, desempenha um importante papel no desenvolvimento, crescimento e manutenção dos tecidos reprodutivos femininos. Além disso, a hormona pode ter impacto na fisiologia do cérebro e do sistema nervoso, com base na sua função como um neuroesteróide que afectam a sobrevivência das células e o crescimento [16, 17]. A modulação da homeostase do cálcio promovido pela progesterona é geralmente regulada através de mecanismos não genômicos que envolvem diferentes tipos de receptores de progesterona [18, 19]. Curiosamente, deve notar-se que a hormona está presente na saliva numa forma livre [20].

Aqui, nós descrevemos que p1932 tem um efeito antagonista sobre o Ca citosólico

2+ mobilização induzida por progesterona em uma linha humana escamosas de língua pilha de células de carcinoma (PE /CA-PJ15). Além disso, nós fornecemos uma forte evidência de que o papel modulador de p1932 é activada através do receptor PGRMC1, como mostrado por estudos de expressão de proteínas e estudos comparativos bioquímicos realizados na presença de AG-205, um inibidor específico da PGRMC1 usados ​​isoladamente e em combinação com p1932 . Estes resultados, realce novas perspectivas sobre as implicações funcionais de peptídeos ricos em prolina salivares em sistemas de células de câncer expostos aos hormônios sexuais específicos.

Materiais e Métodos

Chemicals

tampão fosfato Salino (PBS) e tripsina-EDTA são produtos de Euroclone (Pádua, Itália). de soro de vitelo fetal (FCS), antibióticos (penicilina e estreptomicina), L-glutamina, Salina Equilibrada de Hanks Solution (HBSS), Meio de Dulbecco Modificado (IMDM), Fura 2-AM (Fura 2-acetoxi-metil-éster), dimetilsulfóxido Iscove (DMSO), KCl, MgCl

2, glucose, Hepes, NaCl, CaCl

2, EGTA (etileno-glicol-bis (éter 2-amino-etil) -N, N, N ‘, N’-tetra -acético), progesterona (P4), ácido desoxicólico, Nonidet P-40 (NP-40), EDTA (2 – ({2 [bis (carboximetil) amino] etil} (carboximetil) amino) acético), Tween- 20 e AG-205, foram adquiridos de Sigma (Milão, Itália) |

Peptídeos síntese |

p1932, RI-p1932 e fragmentos F (MER 1-8), C (MER 1-. 17des Pro), e (MER 1-11), B (MER 1-17) e D (MER 12-20) foram reunidos sobre um sintetizador de péptidos Applied Biosystem 433A (Foster City, CA, EUA) em uma prolina-2 pré-carregado resina -chlorotrityl (Novabiochem, Laufelfingen, CH) seguindo o protocolo para a síntese de péptidos em fase sólida por passos [21] Fmoc- (Na–9-fluorenilmetiloxicarbonilo). ácidos Fmoc-aminoácidos foram em Novabiochem

Todos os acoplamentos foram realizados com 5 vezes em excesso de aminoácidos activados na presença de 10 equivalentes de amina N-etildiisopropil, utilizando N -. [(dimetilamino) -1-H- 1, 2, 3-triazole- [4, 5-β] piridina-1-il-metileno] N-óxido de N-metilmetanam�io hexafluorofosfato (HATU, PE Biosystems, Inc., Warrington, UK) como agente activador para o grupo carboxilo. No final da montagem da cadeia peptídica, o péptido foi clivado a partir da resina por tratamento com uma mistura de ácido 80% trif luoroacético, 5% de água, 5% de fenol, 5% de tioanisole, 2,5% etanditiol e 2,5% de triisopropilsilano durante 3 horas (quarto temperatura), com a desprotecção concomitante da cadeia lateral. Após filtração da resina, o péptido foi precipitado em éter terc-butilmetílico frio. Após a centrifugação e a lavagem com éter terc-butilmetílico o péptido foi suspenso em ácido acético aquoso a 5% e liofilizado. Analítica e semipreparativa invertida Cromatografia em Fase Líquida de Alto Desempenho (RP-HPLC) foi realizada em um sistema tri Rotar-VI de HPLC equipado com um detector multicanal MD-910 para fins analíticos ou com um detector de UV variável Uvidec-100-VI para a finalidade preparativa (todos da JASCO, Tóquio, Japão). RP-HPLC analítica foi realizada num Júpiter C18 5 um, 300  coluna (150 x 4,6 mm, Phenomenex, Torrance CA, EUA). Semi-preparativa de RP-HPLC foi realizada uma Júpiter C18 de 10 um 300-A (250 x 21,2 milímetros, Phenomenex, Torrance CA, EUA). Os gradientes lineares de acetonitrilo em TFA aquoso a 0,1% (v /v) foram usados ​​para eluir o péptido ligado. A análise por espectrometria de massa MALDI-TOF foram efectuadas numa estação de trabalho Autoflex (Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha) confirmando a massa teórica do péptido.

A linha celular humana PE /CA-PJ15

PE /células CA-PJ15 (ECACC, 96121230, Porton Down, Reino Unido) [22] foram cultivadas (37 ° C, 5% de CO

2) em meio IMDM, contendo glutamina 2 mM e penicilina /estreptomicina (100 U /mL de cada vez ), suplementado com 10% de FCS inactivado. As células foram sub-cultivadas a cada quatro dias antes de se tornar totalmente confluente.

Determinação da concentração citosólica de Ca

2+

Fura-2 AM (2 mL de uma solução 2 mM em DMSO) foi adicionado a 1 ml de suspensões de PE /CA-PJ15 (cerca de 10 x 10

6 células) obtidos após tratamento com tripsina 0,05% e incubados durante 60 min a 37 ° C, no escuro. As células foram então colhidas por centrifugação a 800 gx 10 min e finalmente suspensas em HBSS tampão a pH 7,4 (NaCl 140 mM, KCl 5,3 mM, MgCl 1 mM de

2,

2, glicose mM CaCl 1 mM de 5, 25 mM Hepes, ajustado a pH 7,4) a uma concentração celular final de 1 x 10

6 células /ml.

uma alíquota desta suspensão (1 mL) foi então centrifugado a 800 g x 5 min, após o que foram colhidas e suspensas em 3 mL de HBSS, pH 7,4 isento de cálcio (NaCl 140 mM, KCl 5 mM, MgCl 1 mM de

2, glucose 5 mM, HEPES 25 mM, EGTA 0,1 mM) antes das medições fluorimétricas. A fluorescência foi medida com um Perkin-Elmer LS 50 B spectrophotofluorimeter equipado com um sistema de excitação dupla (ex. 360 e 380 nm, em. 510 nm). larguras de fenda foram fixados em 1,5 nm para excitação e 3 nm de emissão. as concentrações de cálcio citosólico ([Ca

2 +] c foram calculados conforme relatado [23].

Análise proteômica de receptores de progesterona em células PJ15

Os extractos de proteína foram obtidos por lise celular com 50 Tris-HCl pH 8, 150 mM de NaCl, 0,5% de ácido desoxicólico, 0,1% de SDS, 1% de NP-40, 1 mM de EDTA pH 8 suplementado com inibidores da protease (tampão de RIPA). As proteínas foram separadas em gel de SDS-poliacrilamida e, após coloração com Coomassie coloidal azul brilhante, bandas de gel de interesse foram excisadas, descorados com NH 25 mM

4HCO

3 /ACN 1: 1 (v /v), desidratou-se com 100% de ACN, reduzida com DTT 10 mM em NH 25 mM

4HCO

3 e alquilado com IAA 55 mM em NH 25 mM

4HCO

3. Após desidratação completa, uma solução de 0,02 g /tripsina mL em NH 25 mM

4HCO foi adicionado

3, e as proteínas foram digeridas a 37 ° C durante a noite. a reacção foi parada pela adição de TFA a uma concentração final de 0,1%. os sobrenadantes contendo os péptidos trípticos foram recolhidos juntamente com fragmentos de péptidos extraídos do gel com 100% de ACN /0.1% TFA em água 3: 2 (v /v). peptídeos trípticos foram analisados ​​por espectrometria de massa de cromatografia de ionização por electrospray-tandem líquida (LC-ESI-MS /MS) numa 3,000 aparelho final micro HPLC (Dionex, Sunnyvale, CA, EUA) equipado com um módulo de gestor FLM-3000-Flow directamente acoplado a um LTQ Orbitrap XL híbrido FT espectrómetro de massa (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). De fase inversa de cromatografia foi realizada num Júpiter C18, 5 um, 300 Á, 150 × 1,0 mm coluna (Phenomenex, Torrance, CA, EUA) e um 95 min prazo (gradiente de acetonitrilo de 1,6-44% em água com 0,1% de ácido fórmico mais de 60 min) a um caudal de 80 mL /min. medições de espectrometria de massa foram realizadas no modo de ião positivo com uma temperatura capilar de 250 ° C, um fluxo de gás de bainha 40 unidades arbitrárias, uma fonte de tensão de 3,6 kV e uma tensão capilar de 48 V. Os espectros de massa foram recolhidos no FT-IT modo de digitalização dependem de dados (MS digitalizar em 60000 de resolução na Orbitrap e MS /MS varredura nos três mais intensos picos no ion trap). identificações de proteína foram obtidas com o algoritmo de contabilização de iões incorporado (Sequest HT) do software proteoma Discoverer (versão 1.4, Thermo) e procura uma base de dados humano (UniProtKB /Swiss-Prot Base de Conhecimento proteína, libertar 2013_09 de 18-Set-13 contendo 540958 sequência cadastros; restrições taxonômicos: Homo sapiens, 20271 entradas sequência). Os parâmetros da pesquisa foram 10 tolerância ppm de íons precursores e 0,8 Da para íons de produtos, 1 perdeu clivagem, carbamydomethylation de cisteína como a modificação fixa, a oxidação da metionina como modificação variável e taxa de falsos positivos inferior a 5%, calculado sobre uma pesquisa de banco de dados engodo.

receptor de progestina western blotting

a concentração de proteína de lisado de células foi determinada pela proteína Bio-Rad Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA). membranas de plasma foram preparadas como descrito anteriormente [24], com modificações menores. As células foram homogeneizadas em tampão de homogeneização arrefecido em gelo (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 0,1 M, EDTA 1 mM) contendo 1% de mistura de inibidores de protease (Sigma-Aldrich) pelo homogeneizador de Dounce (30 golpes). O homogenato foi centrifugado durante 10 min a 2000 g e 4 ° C, seguido de centrifugação do sobrenadante a 100.000 g durante 1 hora a 4 ° C para sedimentar as membranas de plasma, que foram ressuspensas em tampão de lise (Tris-HCl 50 mM pH 8,0 , 1 mM de EDTA, 1% de SDS, 1 mM de DTT, e cocktail de inibidor de protease). A quantificação da proteína foi realizada utilizando um kit de ensaio de proteína de 2-D Quant Kit (GE Healthcare, Uppsala, Suécia). As proteínas foram carregados e separados em géis de SDS-poliacrilamida e transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas em solução de bloqueio (PBS, 0,1% de Tween-20, 5% (w /v) de leite em pó magro) e incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários monoclonais seguinte ratinho: anti-PGRMC1 (clone C-3 , Santa Cruz, CA, EUA), anti-nPR (clone 2C11F11, Santa Cruz), anti-mPRα (clone H-76, Santa Cruz) e anti-β-Actina (clone AC-15, Sigma). As membranas foram lavadas extensivamente e após incubação com peroxidase de rábano (HRP) marcado com anti-rato de cabra ou um anticorpo anti-coelho (Santa Cruz), desenvolvido com o sistema ECL mais quimioluminescência detecção (GE Healthcare, Reino Unido).

Estatística analisa

Todos os valores são expressos em média ± SEM (n) e os níveis significativas entre os grupos foram avaliados por análise de variância e teste post-hoc Scheffé. Os valores de P inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados e Discussão

Efeito antagônico de peptídeo p1932 em P4 efeito

Os p1932 peptídeos patenteados (NH

2

1GPPPQGGNK

10PQGPPPPGKPQ-PCT /IB2012 /050415) é um fragmento decorrente do processamento proteolítico do proteínas ricas em prolina PRB1-L (UniProt /Swiss-Prot, P0428), PRB-2 (P02812), PRB1- H (Q86YA1) e PRB2 (Q7M4Q5) [4]. A sequência de p1932 é repetido quatro vezes em PRP1-L e PRB2, e três vezes em PRB1-H, trazendo a sua concentração média no saliva humana cerca de 5-10 uM. No entanto, como para muitos outros péptidos salivares, o papel exacto de p1932 em fisiologia e patologia oral, é actualmente desconhecido. Num documento recente que não revelaram a capacidade de p1932 para ser internalizado em células da mucosa oral em um lapso de tempo de alguns minutos, por outro lado que demonstraram a ausência de citotoxicidade, mesmo em concentrações muito superiores às encontradas na saliva para este péptido [13] .

neste trabalho mostram pela primeira vez que o efeito dependente da dose de p1932 na modulação da libertação de cálcio citosólico promovido pela progesterona na linha celular PE /CA-PJ15.

Estes células, o que pode ser considerado um modelo de células de carcinoma oral humana [25], foram propositadamente escolhidos para investigar o possível impacto de p1932 na presença de receptores de progesterona previamente associados com significado prognóstico sobre a cabeça e pescoço cancro [26].

o efeito de P4 nas células PE /CA-PJ15 foi estudada, empregando a hormona sob duas concentrações diferentes (5 e 10 mM), a fim de investigar possíveis efeitos relacionados com a dose. Progesterona (P4) tratamento das células foi levada a cabo na ausência de cálcio extracelular que foi previamente removida com 0,1 mM de EGTA 0,1 mM. Depois de alguns segundos após tratamento P4, um aumento de [Ca

2 +]

c podia ser observada em ambas as concentrações (Fig 1). Um tal aumento rápido sugere um efeito não-genómica rápida de P4 [27], que podem ser mediados por diferentes classes de receptores de progesterona, tal como o receptor de progesterona nuclear clássica (NPR) na sua forma monomérica (NPR-A), a progesterona receptor de membrana Componentes 1 (PGRMC1), e a membrana receptor de progesterona MPR [28].

a figura ilustra o resultado de uma experiência típica. As células foram suspensas em tampão HBSS sem cálcio. Após 250 segundos de cálcio foi adicionado para atingir uma concentração de 1 mM. O experimento foi repetido 10 vezes e um comportamento semelhante foi sempre observado. Inserção: aumento máximo de [Ca

2+ C], classificado como Δ [Ca

2+] C, após a adição de quantidades crescentes de progesterona. Os resultados apresentados correspondem às médias ± SEM de 10 experiências. ANOVA. Os efeitos devidos a progesterona na ausência de cálcio: p 0,0001, e na presença de cálcio 1 mM: não significativo (não mostradas) na inserção. Post-hoc: o teste de Scheffé quando p nível de 0,05. Os asteriscos mostrado significância estatística.

O [Ca

2 +]

aumento c era dependente de concentração de progesterona, e na inserção da figura 1 os efeitos da P4 na [Ca

2 +]

c são relatados como Δ [Ca

2 +]

c (nM). A análise estatística confirmou o efeito de doses crescentes de progesterona em [Ca

2 +]

C em condições isentas de cálcio (p 0,0001). Quando Ca 1 mM de

2+ foi adicionado ao meio, um novo aumento de [Ca

2 +]

C foi observado (Figura 1), tanto na ausência e na presença de progesterona, em direcção de 42 ± 3 nM (média de 10 determinações ± SEM). Este resultado indica que [Ca

2 +]

c mudanças sobre P4 estímulo são principalmente dependentes da liberação de Ca

2 + das lojas intracelulares, de acordo com os achados anteriores [29]. A este respeito, a relação linear observada entre [Ca

2 +]

aumento c ea dose P4, é provável indicativo de um impacto direto, afastando assim os efeitos inespecíficos de P4 nas membranas celulares que, em última análise, seria levar a um aumento de cálcio intracelular [30]. Nas experiências seguintes p1932 péptido foi utilizado a uma concentração mais baixa (1700 nM) em relação à encontrada na saliva (5-10 uM), levando-se em conta que, em condições fisiológicas, nem toda a fracção de péptido salivar p1932 está em contacto com células da mucosa ao mesmo tempo.

salivares p1932 peptídeo sozinho (1700 nm) não teve efeitos na [Ca

2 +]

c em células PE /CA-PJ15, quer na ausência ou na presença de Ca

2+ no meio. No entanto, quando adicionado 2 minutos antes do tratamento P4 em condições isentas de cálcio, p1932 extinguiu completamente o efeito dos efeitos da progesterona (ambos a 5 e 10 uM (Fig concentrações) 2, inserção). Além disso, observou-se um efeito dependente da dose quando o péptido p1932 salivar foi testado em várias concentrações na gama de 17-1700 nm (Fig 3). Em particular, o efeito inibitório sobre mediada por progesterona (5-10 uM) foram eficazmente linear até à concentração mais elevada (1700 nM) de péptido utilizado.

A figura ilustra o resultado de uma experiência típica. As células foram suspensas em tampão HBSS sem cálcio. Péptido (1700 nM) foi adicionado dois minutos antes de progesterona (10 uM). Após 250 s o cálcio foi adicionado para atingir uma concentração de 1 mM. Inserção: aumento máximo de [Ca

2 +]

C, classificado como Δ [Ca

2 +]

C, após a adição de quantidades crescentes de progesterona. Os resultados apresentados correspondem às médias ± SEM de 10 experiências ANOVA. Os efeitos devidos a progesterona na ausência de cálcio: p 0,0001 e na presença de cálcio 1 mM: não significativo (não representada na inserção).

Post-hoc

: teste de Scheffé quando p nível de 0,05. Os asteriscos mostrado significância estatística.

Depois de 120 segundos após a adição do péptido (17-1700 nM), progesterona (10 uM [quadrados pretos] ou [5 uM quadrados brancos]) foi também dispensada . Dados (relatados como Δ [Ca

2 +] c) informar os meios ± SEM de 10 experiências ANOVA. Efeitos da progesterona: p 0,001 e de concentração de peptídeo:. P 0,001

A fim de estabelecer os requisitos estruturais mínimos para expressar o efeito antagônico, sintetizamos diferentes fragmentos de p1932, e realizou experimentos em 1700 nM para investigar a relação entre sequências de fragmentos e atividade biológica. Os fragmentos C (MER 1-17 des Pro), E (MER 1-11), e F (MER 1-8) mostraram uma considerável actividade antagonizante inferior em comparação com o péptido intacto (Fig 4). Por outro lado, o fragmento B (MER 1-17) e fragmento D (MER 12-20), resultou tão ativo quanto peptídeo p1932. Curiosamente, a 1-17 des Pro fragmento MER, que carece de um resuo de prolina, não teve qualquer efeito inibidor, indicando um elevado grau de especificidade com o alvo molecular putativa de p1932 [31]. Finalmente, a forma retro-inverso (R. I.) de p1932 quando testados ao longo da gama 17-1700 nM de concentrações, não mostrou nenhum efeito antagonista (dados não mostrados), sugerindo o envolvimento de um mecanismo de estereo-especifica de reconhecimento. Estes resultados salientam a associação da parte C-terminal do péptido, que contém o-GPPPPGKPQ-20 12 sequência rica em prolina, com efeito inibidor completo em [Ca

2 +]

C aumento.

Após a adição de qualquer um dos péptidos ou dos seus fragmentos em diferentes concentrações (17-1700 nM), 5 uM de progesterona foi também adicionada ao meio de cultura de tecido isento de cálcio. Dados (relatados como Δ [Ca

2 +] c), relatam as médias ± SEM de 10 experimentos. ANOVA: Efeitos de péptido: p 0,001 e de concentração: p 0,001. Post-hoc: (Scheffeé p = 0,05). subconjuntos de peptídeos homogêneas: 1. A (p1932), B (MER 1-17) e D (MER 12-20); 2. C (MER 1-17 des Pro), E (MER 1-11) e F (MER 1-8).

Análise dos receptores de progesterona

Análise proteômica de PJ15 células foi realizada para demonstrar a presença das três classes de receptores de progestina putativos descritos na literatura: nPR, PGRMC1, e mPRα. Após a lise das células, as proteínas foram separadas por SDS-PAGE, após o qual as proteínas e com massas nos 21, 40 e 100 kDa gamas foram analisadas por LC-ESI-MS /MS. Sob estas condições, nós identificada apenas PGRMC1 (Tabela 1) (21 kDa) em experiências em duplicado. PGRMC1, mPRα e expressão nPR também foi avaliada por análise de transferência de Western, que confirmou que PGRMC1 é o principal receptor de progesterona expresso em células PE PJ15 /CA. As transferências de Western também revelaram mPRα, embora em menor grau, a uma comparação com PGRMC1 (Figura 5), ​​confirmando assim a avaliação de co-imunoprecipitação anteriores que sugerem que, provavelmente, PGRMC1 e mPRα estão funcionalmente ligados [32]. Por outro lado, o receptor nPR não foi identificada, de acordo com os dados de Lukits e Coll. obtido com a mesma linha celular (Tabela 1 e Figura 5) [26]

na lista são os seguintes parâmetros: proteína. alfanumérico identificador de sequência única proteína (adesão) e caracteres de identificador com proteína-A (Nome da entrada) convenção de nomenclatura , do gene e proteína nome (descrição) fornecido pela base de conhecimento proteína UniProtKB; o peso calculado molecular da proteína em unidades quilo-Dalton (MW), o ponto isoeléctrico calculado teoricamente (CAL Pi.) e o número de proteínas de aminoácidos (AA) #; Pontuação SEQUEST HT da identificação de proteínas; percentual de sequência de proteína abrangida pela péptidos identificados (COV); número de péptidos únicos para a proteína (# original péptidos); número dos péptidos identificados correspondentes à proteína (peptídeos #); número total de sequências de péptidos identificados (espectro de peptídeo jogos) (# PSMs) obtidos por dois experiência diferente (Exp 1 e Exp 2). Na tabela estão listados os péptidos PGRMC1 seguintes parâmetros: o grupo amino identificado sequência peptídica ácida; Carregue estado do íon precursor; a massa monoisotópica péptido teórico protonada, em daltons (MH +); massa-carga razão (m /z) do ião precursor, em daltons; a diferença entre a massa teórica do péptido e a massa experimental do ião precursor em partes por milhão (Dm); tempo de retenção do ião precursor, em minutos (R.T.); a pontuação de correlação cruzada SEQUEST HT para todos os péptidos candidatos consultados a partir do banco de dados (Xcorr); número de clivagens perdidas.

PGRMC1, NPR e mPRα níveis de proteínas foram reveladas com anticorpos específicos em PE /CA PJ15 extractos celulares obtidos células a lise com tampão RIPA. Blot anti mPRα também foi realizado em preparação de membrana. Proteínas de extractos a partir de células HepG2 e MCF7 foram analisadas como controlos positivos (PGRMC1: 21,67 kDa, https://www.uniprot.org/uniprot/O00264; nPR: 82,29 kDa isoforma A, 98,98 kDa isoforma B, http: //www. uniprot.org/uniprot/P06401; mPRα: 39,72 kDa, https://www.uniprot.org/uniprot/Q86WK9). carregamento igual de proteína (50 pg) foi confirmada por expressão β-actina.

Devido à alta expressão de PGRMC1 em PJ15 células PE /CA, queríamos saber o seu papel na [Ca

2+] c aumentar após estímulo progesterona utilizando o inibidor específico AG-205 sozinho e em combinação com p1932. AG-205 é conhecido por se ligar ao local de ligação do heme desta proteína modificando assim as suas propriedades e funções [33] espectroscópicos. O AG inibidor PGRMC1 205 (0,01-1,0 ^ M) ou péptido p1932 (0,01-1,0 ^ M), foram introduzidos no meio de incubação de 50 segundos antes de progesterona (5 ou 10 uM). Na presença de AG-205 ou peptídeo p1932 o efeito de P4 (5-10 pM) em Δ [Ca

2+] c foi estatisticamente inibida de uma forma dependente da dose, mimetizando assim a acção de p1932 (Figura 6a) . Em seguida, AG-205 (0,01-1,0 ^ M) e péptido p1932 (0,01-1,0 uM) foram adicionados simultaneamente nas médias de 50 segundos antes da progesterona. A combinação dos dois agentes em doses idênticas, conduziu a um efeito inibitório mais elevado sobre a actividade de progesterona, que a observada para o péptido indivíduo AG-205 ou p1932 sozinho, indicando uma acção aditiva das duas moléculas (Figura 6B).

Os experimentos foram realizados em PE /CA PJ15 marcado com Fura-2 AM. Depois de 50 segundos no meio de incubação, P4 (5 um, Fig 6A; 10? M, Fig 6B) foi adicionado e o aumento de cálcio citosólico como ô [Ca

2 +] c medido. O AG inibidor PGRMC1 205 (0,01-1,0 ^ M) e /ou péptido p1932 (0,01-1,0 ^ M), foi adicionado nas médias de 50 segundos antes de 5 ou 10 uM de progesterona. Na presença do péptido ou AG205 p1932, o efeito de P4 (5-10 pM) em Δ [Ca

2+] c foi estatisticamente inibida de um modo dependente da dose. Quando AG 205 (0,01-1,0 ^ M) e péptido p1932 (0,01-1,0 ^ M) foram adicionados em combinação, o efeito de inibição observada foi maior do que nas amostras tratadas com qualquer dos agentes isolados. Cada conjunto de dados correspondem à média ± SEM de seis medições independentes.

O receptor PGRMC1 contém um domínio N-terminal transmembranar (72-135 aa) e um domínio de ligação de B5-cit ou heme /esteróide [ ,,,0],34]; características semelhantes são compartilhadas com o seu homólogo PGRMC2. Ambas as proteínas são expressas em vários tecidos humanos, incluindo coração, fígado, placenta e [35], e são sobre-expressos em muitos tipos de células de cancro [36-38]. PGRMC1 P4 se liga com uma afinidade moderada e medeia P4 anti-mitótico e acção anti-apoptótica. É localizada nas membranas do plasma de membrana, citoplasma e nucleares, explicando, assim, o seu potencial envolvimento em sinais de progesterona rápidos não genómicos. Recentemente, PGRMC1 foi encontrado para ser estritamente correlacionada com a Sigma 2-receptores [39], apesar da existência de alguns resultados controversos [40].

A TPM (MW 40 kDa) foram primeiramente isolado em seatrout [41] e são representados por, pelo menos, cinco subtipos, ou seja, α, β, γ, δ e ε estritamente relacionada com progestina e adiponectina-Q-receptor (PAQR) da família [42]. A sua presença e natureza eficaz como receptores de progesterona foram estabelecidas depois de anos de debate [43]. Estes receptores possuem uma afinidade elevada para P4 (Kd 5 nM) e pode mediar as respostas rápidas como estando directamente acoplado a proteínas G [32, 44]. Ambos os receptores PGRMC1 e mPRα são capazes de responder rapidamente a um estímulo P4, e, consequentemente, determinar um aumento de [Ca

2 +]

c em lojas endoplasmático [45, 46]. Considerando como estas proteínas interagem [30], é possível que eles representam os alvos moleculares de p1932.

As características estruturais de p1932 sugerem fortemente esse peptídeo como um interagente potencial da domínios de reconhecimento de prolina-Rich (DRP) , e em particular dos domínios SH3 [46, 47]. Para conseguir a ligação entre uma sequência rica em prolina e um domínio SH3, um núcleo -PxxP- deve estar presente na sequência de ligando. Além disso, um resíduo básico que flanqueia o núcleo -PxxP- é importante na definição da especificidade interacção determinar dois tipos de sequências de consenso canónicos: a Classe I -PxxPxx (R /K) e a de Classe II – (R /K) xPxxP- [48 ]. A presença de três núcleos de consenso -PxxP-, para além da presença de um motivo de classe II na região C-terminal de p1932 (NH

2-

1GPPPQGGNKP

10QGPPPPGKPQ), no qual reside a atividade inibitória, apoiar fortemente a nossa hipótese de que p1932 pode ter como alvo domínios SH3. O nPR é conhecido por interagir com o domínio SH3 do c-SRC quinase por meio de sua região rica em prolina [49], mas a falta deste receptor em células PJ15, conforme resultante da proteômica e western-blot análises, regras-out este mecanismo. PGRMC1 receptor em vez disso é altamente expresso nesta linha de células, sugerindo que o receptor é real de responder a estímulos de P4 em células PJ15. A região transmembranar de PGRMC1 possui uma putativas sequências alvo de consenso SH3 para CRK /Grb2 /Abl e Src quinases enquanto que o domínio de ligação a heme contém uma sequência de consenso para tirosina-quinases do tipo Lck /Abl-P e para a ERK1 [47], como também previsto pela