Abstract

O zinco protoporfirina (ZnPP) foi encontrado para ter atividade anticancerígena ambos

in vitro

e

in vivo

. Demonstrámos recentemente que a expressão da proteína diminui ZnPP β-catenina em células de cancro. O presente estudo examinou os mecanismos celulares que medeiam a supressão da expressão β-catenina de ZnPP. Nós demonstramos que ZnPP induz uma rápida degradação da proteína β-catenina em células de cancro, que é acompanhado por uma inibição significativa da actividade de proteassoma, sugerindo que a degradação de proteassoma não leva em conta directamente para a supressão. A possibilidade de que induz ZnPP β-catenina exportação foi rejeitado pela observação de que não houve proteína β-catenina detectável no meio condicionado após o tratamento ZnPP de células cancerosas. Outras experiências demonstraram que ZnPP induz a permeabilização da membrana lisossoma, que foi revertida por pré-tratamento com um cocktail inibidor de transporte de proteínas contendo Brefeldina A (BFA) e monensina. Mais significativamente, o pré-tratamento de células cancerosas com BFA e Monensina atenuou a supressão induzida ZnPP de expressão β-catenina de uma forma sua concentração e do tempo-dependente, indicando que a via de degradação da proteína lisossoma é provavelmente envolvidos na supressão induzida ZnPP de β expressão -catenina. Se há conversa cruzada entre o sistema ubiquitina-proteassoma e a via lisossoma que pode contribuir para a degradação da proteína β-catenina induzida ZnPP é actualmente desconhecido. Estes resultados fornecem um novo mecanismo de ação anticancerígena do ZnPP e revelar uma nova estratégia potencial para alvejar a via de sinalização Wnt β-catenina para a terapia do cancro

Citation:. Wang S, Hannafon BN, Lind SE, Ding WQ (2015 ) Zinco protoporfirina Suprime β-catenina expressão da proteína nas células cancerosas humanas: O potencial envolvimento de Degradação Lisossomo-Mediated. PLoS ONE 10 (5): e0127413. doi: 10.1371 /journal.pone.0127413

Editor do Academic: Ming Tan, University of South Alabama, United States |

Recebido: 17 de dezembro de 2014; Aceito: 15 de abril de 2015; Publicado em: 22 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Wang e col. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Sociedade americana do Câncer (CNE-117557) para WQD, Susan G. Komen para a fundação da cura (KG081083) para WQD, o programa NIH OK-INBRE ( 3P20RR016478-09S2) para WQD e do Centro de Oklahoma para o Avanço da Ciência e Tecnologia (HR14-147) para WQD. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

protoporfirina de zinco (ZnPP) pertence a um grupo de compostos químicos em que o ião central do heme livre é substituído por um ião de metal pesado, tal como zinco, estanho (SnPP) ou cobre (Cupp). Devido à semelhança estrutural do ZnPP ao de heme livre, um substrato de estabelecido o antioxidante enzima heme oxigenase-1 (HO-1), ZnPP actua como um inibidor competitivo para a actividade enzimática de HO-1 [1]. ZnPP foi encontrado para ter atividade anticancerígena ambos

in vitro

e

in vivo

[2-5] e, geralmente, acredita-se que a atividade anticancerígena de ZnPP é atribuída a HO-1 inibição. No entanto, não foi fornecida evidência experimental para apoiar esta suposição. Pelo contrário, alguns estudos sugeriram que a acção anti-cancro do ZnPP pode ser independente de HO-1 [5,6]. No nosso relatório recente, demonstrou-se que nem a sobre-expressão ou knockdown de HO-1 em sistemas modelo de cancro afecta a citotoxicidade do ZnPP, indicando fortemente uma acção de HO-1-independente de ZnPP contra as células cancerosas. Nossos estudos sobre os mecanismos revelou ainda que ZnPP é capaz de rápida e dramaticamente suprimir a expressão da proteína β-catenina e a atividade em células cancerosas [7].

Porque β-catenina é um jogador-chave na via de sinalização Wnt canônica, que é uma via-alvo bem apreciado para a terapia do cancro [8], a supressão significativa da expressão β-catenina e a actividade revela um importante mecanismo de actividade anti-cancro do ZnPP. Uma melhor compreensão de como ZnPP suprime a expressão β-catenina em células de cancro pode não só ajudar a elucidar os mecanismos celulares da acção anticancerígena do ZnPP, mas também fornecem novas estratégias terapêuticas do cancro para o direccionamento a via de sinalização Wnt β-catenina.

no presente estudo, exploramos os mecanismos celulares de supressão induzida ZnPP de expressão β-catenina em células cancerosas humanas. A natureza rápida e dramática da supressão induzida ZnPP da expressão da proteína-catenina β sugerem fortemente que este supressão é devido principalmente a p-catenina a degradação da proteína. β-catenina os níveis da proteína são bem controlada pelo complexo de destruição β-catenina que está firmemente acoplado ao sistema ubiquitina-proteassoma [9]. Por conseguinte, é provável que o sistema ubiquitina-proteassoma medeia a degradação da proteína β-catenina induzida ZnPP. No entanto, outras vias de degradação de proteínas, tais como a via de degradação de proteínas mediado por lisossoma [10], também pode estar envolvida neste processo. Além disso, a possibilidade de que ZnPP induz rápida exportação de β-catenina de células cancerígenas não podem ser excluídos. O presente estudo examinou esses três mecanismos potenciais de supressão induzida ZnPP de expressão β-catenina. Para nossa surpresa, supressão induzida ZnPP de expressão β-catenina não é devida à actividade de proteassoma reforçada nem é mediada por exportação de β-catenina. Os resultados suportam o envolvimento da via de degradação mediada por lisossoma na supressão induzida ZnPP de expressão β-catenina.

Material e Métodos

Materiais

A β-catenina , fosfo-β-catenina (Ser33 /37 /Thr41) e K48 (lisina 48) -linkage poliubiquitina anticorpos específicos foram de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA). MG132 e cocktail Brefeldina A /A monensina foram de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). Suc-LLVY-AMC foi de Anaspec (Fremont, CA). Z-ARR-AMC e Z-LLE-AMC eram da Millipore (Billerica, MA). Outras sondas fluorescentes foram em Life Technologies (Grand Island, NY). Os concentradores Corning Spin-X (6 mL) e sal de sódio de monensina era da VWR International LLC (Radnor, PA). O anticorpo β-actina e outros reagentes químicos eram de grau analítico e obtidos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

cultura celular

A linha de células A2780 (cancro do ovário humano) foi uma simpática oferta do Dr. Stephen Howell (Universidade da Califórnia, San Diego). A linha celular DU145 (cancro da próstata humana) e a linha celular MDA-MB-231 (cancro da mama humano) foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). As células A2780 foram cultivadas em meio RPMI 1640, e DU145 e células MDA-MB-231 foram cultivadas em meio DMEM. Ambos os RPMI 1640 e DMEM meios foram suplementados com soro fetal bovino a 10%, 100 IU /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina. As células foram rotineiramente cultivadas num frasco de 75 mm a 37 ° C, num ambiente humidif içado contendo 5% de CO

2. Todas as células foram sub-cultivadas duas vezes por semana e aplicadas às várias experiências descritas na secção de resultados.

Preparação e aplicação de ZnPP e SnPP

ZnPP SnPP e foram adquiridos a partir de Frontier Scientific, Inc. (Logan, UT). O conselho do fabricante e um relatório anterior [11] foram acompanhados por manipulação apropriada destes compostos. Um estoque de trabalho de ZnPP e SnPP foi recém-preparados para cada experiência individual. Todos os tubos utilizados para preparar a solução de estoque foram cobertos por uma folha de alumínio para evitar a reacção com os compostos de luz. Os compostos foram inicialmente dissolvidos em DMSO completa, e em seguida diluído com 50% de DMSO em tampão 1X PBS antes da adição ao meio de cultura celular. A concentração final de DMSO no meio de cultura celular foi inferior a 0,5% em todas as experiências realizadas. Os veículos foram incluídos como controlos. As células foram tratadas com os compostos em condições de pouca luz indireta e incubadas no escuro durante vários períodos de tempo antes dos ensaios individuais, semelhantes aos relatórios anteriores [5,11].

análise de Western blot

a expressão proteica foi analisada por Western blot como descrito anteriormente [12,13]. As células foram semeadas em placas de cultura de 100 mm e atingiu 80% de confluência antes do tratamento com SnPP ZnPP ou nas concentrações indicadas e durações. Para lisado de células inteiras, as células foram lisadas e sonicada em gelo durante 3 pancadas (10 segundos cada com 10 segundos de intervalo entre eles). Os materiais insolúveis foram removidos por centrifugação a 15.000 x g durante 15 min. Os sobrenadantes foram recolhidos para a determinação da concentração de proteína. Para o isolamento da proteína extracelular, as células foram tratadas, em solução salina equilibrada de Hanks (HBSS) durante 1,5 horas. Após o tratamento, HBSS foi recolhida e concentrada com Corning concentradores Spin-X. 25 a 40 ug de proteína foram carregadas em cada poço de um gel SDS-PAGE 10%, transferidos para uma membrana de PVDF, e colocados a hibridar com anticorpos específicos contra β-catenina, fosforilado β-catenina, proteínas e polyubiquitinated β-actina.

co-imunoprecipitação

co-imunoprecipitação (co-IP) utilizando anticorpo β-catenina foi realizada como descrito anteriormente [13]. Em resumo, as células que crescem em placas de 100 mm foram lavadas com PBS e colhidas por adição de 150 ul de tampão IP (Tris-HCl a 10, pH 7,4, NaCl 50 mM, EDTA 0,5 mM, PMSF 1 mM e 1% de Triton X -100). As células foram sonicadas durante 1 minuto em gelo, e o material insolúvel foi removido por centrifugação. Os sobrenadantes foram recolhidos e as concentrações de proteína determinado. Os sobrenadantes foram pré-apuradas pela proteína acoplada de agarose-A, e as esferas de agarose foram removidos por centrifugação. anticorpos β-catenina foram adicionados aos sobrenadantes (1: 100 ratio), e a reacção foi incubada a 4 ° C durante a noite com uma rotação suave. 50 ul de proteína acoplada de agarose-A foi adicionada para capturar os complexos de anticorpo-proteína por rotação durante 2 horas a 4 ° C. Os grânulos (IPS) foram então recolhidas por centrifugação a 2000 × g durante 5 minutos. Os IPs foram solubilizadas com 50 ul de 2 x tampão de SDS-PAGE através da mistura e incubação durante 1 hora à temperatura ambiente. O sobrenadante foi recolhido por centrifugação a 2000 × g durante 5 minutos. A imunoprecipitação em paralelo com IgG de coelho foi realizada como controlo. Ambas as entradas de IPs e foram fervidas durante 5 minutos e de Western blot foi efectuada utilizando anticorpos contra K-48 de ligação de proteínas específicas e polyubiquitinated β-catenina. Foram também foi determinada expressão β-actina nas entradas.

fluorescência de detecção microscópica de ZnPP intracelular e lisossoma permeabilidade

Lisossomo permeabilidade foi analisada por microscopia de fluorescência usando o Sistema de Imagem conteúdo Opereta alta da PerkinElmer ( Waltham, MA). As células A2780 foram semeadas em Cell-portador 96 placa da PerkinElmer (Waltham, MA) a uma densidade de 10.000 células por poço. Quarenta e oito horas após o plaqueamento, as células foram tratadas com ZnPP ou SnPP ou pré-tratados com Brefeldina A /Monensina (21.1 uM /4 uM) cocktail durante 4 horas, seguido de tratamento com ZnPP. O meio foi então substituído com meio fresco contendo 2,5 mM de laranja de acridina (AO, Invitrogen, Carlsbad, CA). Após 30 minutos de incubação, as células foram lavadas três vezes com HBSS e visualizaram sob a Opereta. Lisossoma permeabilidade foi medida utilizando a coloração AO [14]. AO foi detectada por excitação a 500 nm, emissão a 526 nm para o vermelho, e excitação a 460 nm, emissão a 650 nm para o verde.

actividade de proteassoma ensaio

actividades proteassoma foram medidas como anteriormente relatada [15]. Em resumo, as células A2780 foram tratados com ZnPP, SnPP MG132 ou em diferentes concentrações e durações. Após o tratamento, as células foram lavadas com PBS e recolhidas em PBS. As pelotas de células foram lisadas com 250 ul de tampão de lise (HEPES 50 mM, pH 7,5, EDTA 5 mM, NaCl 150 mM e 1% de Triton X-100) por 5 × 10

6 células por incubação à temperatura ambiente durante 30 minutos e vórtex a cada 10 minutos. Os lisados ​​foram então centrifugadas e o sobrenadante recolhido. Um total de 10 ug de proteína para cada amostra foi incubada com 20 uM do substrato fluorogénico (Suc-LLVY-AMC, Z-ARR-AMC ou Z-LLE-AMC) em 100 de tampão de ensaio ul (Tris-HCl a 20, pH 7,5 ) a 37 ° C durante 2 horas. Após a incubação, a fluorescência foi lida a 380 nm de excitação e a 460 nm de emissão usando Molecular Devices Fmax leitor fluorescente de microplacas (Sunnyvale, CA):

Resultados

A supressão induzida ZnPP de β-catenina expressão é acompanhada por uma inibição da actividade de proteassoma. Descrevemos previamente que a expressão da proteína ZnPP suprime β-catenina em células de cancro humanas [7]. Isto também foi confirmado no presente estudo (Fig 1). O tratamento com 5 uM ZnPP durante 30 minutos a 1 hora a expressão da proteína β-catenina dramaticamente suprimida em células A2780, indicando que a degradação da proteína está envolvida. β-catenina níveis de proteína são firmemente reguladas pelo sistema ubiquitina-proteassoma. Na ausência de Wnt ligandos, a proteína β-catenina pode ser fosforilada por CK1 em Ser 45, seguida por uma fosforilação secundário em Ser 33, Ser 37, Tre 41 e pela GSK-3β. Fosforilada β-catenina irá então ser poli-ubiquitinada e alvo para degradação pelo proteassoma [9]. Para determinar se a activação da actividade de proteassoma é o principal mecanismo para a degradação β-catenina induzida ZnPP, medimos o nível de fosforiladas β-catenina após o tratamento ZnPP em células A2780. Figura 2A mostra que o nível de fosforiladas β-catenina (Ser 33, Ser 37 e Thr 41) foi diminuída após o tratamento com 5 uM ZnPP durante 15, 30 ou 60 minutos, indicando que ZnPP não aumenta a fosforilação de β-catenina pela GSK -3β. Co-imunoprecipitação com um anticorpo contra β-catenina (IgG de coelho utilizado como controlo para a precipitação) mostrou ainda que, enquanto os níveis de todo β-catenina foi suprimida, K48 ligação específica ubiquitinadas-poli β-catenina acumulado no β-catenina precipitado amostras após o tratamento ZnPP durante 30 minutos e 4 horas (Figura 2B). Em seguida, mediram os níveis de K48 (lisina 48) -linkage proteínas específicas ubiquitinada-poli para continuar a determinar os efeitos de ZnPP nas proteínas ubiquitinada-poli. A cadeia de poli-ubiquitina K48-ligada é conhecido para proteínas alvo para a degradação do proteossoma [16]. Como mostrado na Fig 2C, o tratamento com 10 uM ZnPP durante 4 ou 21 horas a acumulação de proteínas específicas de poli-ubiquitinada K48 induzidas, indicando que, em vez de activar a actividade de proteassoma, ZnPP efectivamente suprime a actividade de proteassoma no nosso sistema modelo. Note-se que os compostos de ligação de zinco foram previamente descritos para inibir a actividade do proteassoma [17,18].

A2780 células foram tratadas com 5 uM ZnPP durante 0,5 ou 1 hora. lisados ​​celulares foram preparados e western blot foi realizada utilizando anticorpos contra β-catenina e β-actina.

A

. As células A2780 foram tratadas com 5 uM ZnPP durante 15, 30 ou 60 minutos. Os lisados ​​celulares foram preparados e Western blot foi efectuada utilizando anticorpos contra fosforilada β-catenina (Ser 33, Ser e Thr 37 41) e β-actina.

B

. As células A2780 foram tratadas com 5 uM ZnPP para 0,5 e 4 horas. Os lisados ​​celulares foram preparados e co-PI foi realizado utilizando o anticorpo β-catenina seguido por análise de Western blot de proteínas de ligação específicas K48, β-catenina (IPS) ou β-actina (entradas). Mostram-se imagens representativas de três experiências individuais.

C

. As células A2780 foram tratadas com 10? M ZnPP durante 4 e 21 horas, ou 10 uM MG132 durante 21 horas. Os lisados ​​celulares foram preparados e Western blot foi efectuada utilizando anticorpos contra as proteínas de ligação-K48 específicos polyubiquitinated e β-actina.

de inibição da actividade de proteassoma do ZnPP foi ainda confirmada através da medição directa do proteassoma 20S actividade chymotryptic, o qual foi analisado utilizando o fluoróforo ligado péptido Suc-LLVY-AMC [19]. O eucariótica proteassoma 20S é conhecido por ter actividades atribuídas aos seus diferentes subunidades proteicas que são referidos como actividade de caspase-like (cliva após a glutamina e aspártico resíduos de ácido), actividade do tipo tripsina (cliva após os aminoácidos básicos lisina e arginina) e semelhante a quimotripsina actividade (cliva após aminoácidos hidrofóbicos) [20]. Tal como mostrado na Fig 3, o tratamento de células A2780 (Figura 3A e 3C) e MDA-MB-231 (Figura 3B e 3C) ou células com ZnPP MG132, mas não SnPP, suprimiu a actividade chymotryptic no tempo e um modo dependente da concentração. A IC

50 para a inibição da actividade de proteassoma do ZnPP foi determinada como sendo de 6,2 uM em células A2780 e 4,2 uM em células MDA-MB-231 (Figura 3D). ZnPP, mas não SnPP, também suprimiu a actividade do proteassoma tríptica e semelhante à caspase em células A2780 tal como analisado utilizando o fluoróforo ligado péptidos Z-ARR-AMC ou Z-LLE-AMC, respectivamente, [19] (Figura 4). Note-se que MG132 foi mais eficaz na supressão da atividade chymotryptic, ao invés da atividade da caspase-like e não afetou a atividade tríptica, resultados que são consistentes com relatórios anteriores [21,22].

A2780

(a)

ou MDA-MB-231

(B)

células foram tratadas com 10? M ZnPP, SnPP ou MG132 durante 4 ou 21 horas. Os lisados ​​celulares totais foram preparados e incubados com Suc-LLVY-AMC, durante 2 horas a 37 ° C e a fluorescência foi registada a 380 nm de excitação e 460 nm de emissão.

C

,

D

. células A2780 e MDA-MB-231 foram tratadas com várias concentrações de ZnPP como indicado, durante 21 horas. Os lisados ​​celulares totais foram preparados e incubados com Suc-LLVY-AMC, durante 2 horas a 37 ° C e a fluorescência foi registada a 380 nm de excitação e 460 nm de emissão. A IC

50 foi calculado com uma curva de regressão não linear (equação dosagem-resposta sigmoidal). Os dados (média ± EP, n = 3) são expressos como percentagens de controlo não tratado. **,

P Art 0,01, em comparação com células de controlo não tratadas, utilizando ANOVA de uma via seguido por análise de Bonferroni.

A2780 células foram tratadas com 10? M ZnPP, SnPP ou MG132 durante 4 ou 21 horas. Os lisados ​​celulares totais foram preparados e incubados com Z-ARR-AMC (actividade tríptica)

(A)

ou Z-LLE-AMC (actividade chymotryptic)

(B) Compra de 2 horas a 37 ° C e a fluorescência foi registada a 380 nm de excitação e 460 nm de emissão. Os dados (média ± EP, n = 3) são expressos como percentagens de controlo não tratado. *,

P Art 0,05, **,

P Art 0,01, em comparação com controlos não tratados utilizando ANOVA de uma via seguido por análise de Bonferroni.

Estes resultados indicam que a degradação da proteína β-catenina induzida ZnPP é acompanhada por uma supressão significativa da actividade de ubiquitina-proteassoma, sugerindo que a degradação do proteassoma não diretamente responsáveis ​​por supressão induzida ZnPP de expressão β-catenina.

ZnPP não promove a exportação de proteína β-catenina. Um relatório recente mostrou que a proteína β-catenina é secretada em exossomas a partir de células HEK293, o que leva a uma supressão significativa da via de sinalização Wnt canónica [23]. Para determinar se ZnPP-induz a secreção de proteínas β-catenina, as células A2780 foram cultivadas em HBSS e tratadas com 5 uM ou 10 uM de ZnPP durante 1,5 horas. Os lisados ​​de células inteiras e de proteínas extracelulares concentrados foram preparados. Aproximadamente 20-30 ug de lisado de células totais e proteínas extracelulares foram carregadas num gel de SDS-poliacrilamida. A análise Western blot (Figura 5 superior) mostra que a expressão da proteína β-catenina foi suprimida por ZnPP no lisado celular e não detectável na fracção de proteína extracelular, indicando que ZnPP não induz secreção de proteínas β-catenina. Algumas bandas de baixo peso molecular foram detectadas apenas em proteínas extracelulares, não em lisados ​​de células inteiras, o que sugere que estes são não-específica. Esta conclusão foi ainda apoiada por azul de Coomassie de gel-mancha (Figura 5 inferior), mostrando que o tratamento não alterou ZnPP os perfis de proteínas extracelulares. Nós também trataram células A2780 com 5 mM ZnPP durante 72 horas e exosomes isolados do meio. β-catenina foi indetectável nos extractos de proteínas de exossoma (dados não mostrados), excluindo ainda mais a possibilidade de que a proteína β-catenina é secretada em exossomas mediante tratamento ZnPP.

células A2780 foram cultivadas em HBSS e tratadas com a ZnPP as concentrações indicadas, durante 1,5 horas. O HBSS condicionado foi recolhido e as proteínas foram concentradas. Western blot foi realizada utilizando anticorpos contra β-catenina

(Top)

. Os lisados ​​celulares e amostras de proteína concentrada, também foram separadas por SDS-PAGE e corados com coloração com azul de Coomassie

(inferior)

. São mostradas imagens representativas de três experiências individuais.

A via lisossoma é provável envolvido na degradação de proteínas β-catenina-induzida ZnPP. Foi anteriormente demonstrado que as enzimas lisossomais pode ser libertado após a permeabilidade da membrana de lisossomas aumentada, levando a clivagem de proteínas celulares [14]. Para determinar se a via de degradação da proteína lisossoma está envolvida na supressão induzida ZnPP da expressão da proteína β-catenina, examinámos a permeabilidade da membrana após o tratamento ZnPP lisossoma. AO foi utilizado para estudar a permeabilidade da membrana lisossoma [14,24]. AO acumula preferencialmente nos lisossomas e emite fluorescência vermelha quando excitados em condições ácidas. Quando o lisossoma é permeabilizadas, AO vai se mudar para o citosol, onde ele emite uma fluorescência verde em cima de excitação. A mudança de vermelho a fluorescência verde indica um aumento na permeabilidade da membrana lisossoma [25]. Como mostrado na Fig 6A, o tratamento com 5 uM ZnPP para 1, 4 ou 21 horas induzido um deslocamento dependente do tempo na coloração AO de vermelho para verde, indicando que aumenta a permeabilidade da membrana ZnPP lisossoma em células A2780. Em contraste, o tratamento com SnPP não resultou em alterações significativas na permeabilidade da membrana (Figura 6C), consistente com a observação prévia de que SnPP não induzir a supressão da expressão da proteína β-catenina.

células A2780 foram tratados com 5? M ZnPP (

a

) ou 5? M SnPP (

B

) durante 1, 4 ou 21 horas. As células foram então incubadas com 2,5 uM AO durante 30 minutos a 37 ° C. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes com HBSS. As imagens foram capturadas usando um microscópio de fluorescência (60X) com excitação a 500 nm, emissão a 526 nm para AO verde, excitação a 460 nm, emissão a 650 nm para AO vermelho.

C

. Células A2780 foram pré-tratadas com 21,2 uM Brefeldina A e 4 uM monensina durante 4 horas. As células foram então tratadas com 5 uM ZnPP durante 1 hora seguida por incubação com 2,5 mM AO durante 30 minutos a 37 ° C. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes com HBSS. As imagens foram capturadas usando um microscópio de fluorescência (60X) com excitação a 500 nm, emissão a 526 nm para AO verde e excitação a 460 nm, emissão a 650 nm para AO vermelho. São mostradas imagens representativas de três experiências individuais.

BFA é conhecido por bloquear o transporte intracelular de enzimas lisossomais [26] e monensina pode bloquear a acidificação dos lisossomos [27,28]. Portanto, nós testamos se um cocktail BFA /monensina poderia reverter a permeabilidade da membrana lisossoma induzida por ZnPP. Após o pré-tratamento das células com um cocktail BFA /Monensina (concentração final de 21.2 uM BFA e 4 uM Monensina) durante a noite (Figura 6B), uma inversão da permeabilidade da membrana induzida por lysomal ZnPP foi observada. Estes resultados suportam o envolvimento da via de degradação do lisossoma na supressão induzida ZnPP da expressão da proteína β-catenina. Para confirmar esta hipótese, as células A2780 e DU145 foram tratados com o cocktail de BFA /monensina durante a noite e tratou-se com ZnPP nas concentrações e durações (Fig 7) indicadas. -supressão induzida ZnPP da expressão da proteína β-catenina foi significativamente atenuada por pré-tratamento com o cocktail de BFA /Monensina. O efeito de ZnPP em β-catenina tanto foi dramática e significativa e a reversão por BFA /A monensina foi apenas observada após 0,5 e 1 hora de tratamento ZnPP (dados não mostrados). No entanto, a atenuação correlacionada com a concentração e a duração do tratamento ZnPP. Estas observações demonstram ainda que a via de degradação do lisossoma está provavelmente envolvido na supressão induzida ZnPP da expressão da proteína β-catenina.

A2780

(A)

ou DU145

(B)

células foram pré-tratadas com ou sem BFA 21,2 uM e 4 uM Monensina dia para o outro, seguida por tratamento com 5 uM de ZnPP durante 0,5 ou 1 hora.

C

. Células A2780 foram pré-tratadas com BFA e 21,2 uM 4μM Monensina dia para o outro, seguida por tratamento com ZnPP durante 1 hora a concentrações indicadas. As células foram colhidas e lisadas. A análise Western blot foi efectuada utilizando anticorpos contra β-catenina e β-actina. São mostradas imagens representativas de três experiências individuais.

Discussão

supressão O presente estudo foi desenhado para explorar os potenciais mecanismos celulares que medeiam ZnPP induzida de expressão β-catenina usando células de câncer sistemas modelo. A descoberta mais interessante deste estudo é que a degradação da proteína β-catenina induzida ZnPP é acompanhada por uma inibição significativa da degradação da via da ubiquitina-proteassoma; e degradação de proteínas mediado por lisossoma parece mediar este evento. Estes resultados elucidar os mecanismos celulares de atividade anticancerígena de ZnPP e indicam uma potencial nova estratégia na segmentação da via de sinalização Wnt β-catenina para terapia de câncer.

β-catenina níveis de proteína estão bem controlados pela fosforilação e ubiquitina-proteassoma degradação [9]. Por isso, inicialmente acreditava que ZnPP ativaria a via de degradação do proteassoma, levando assim a rápida degradação da proteína β-catenina. No entanto, várias linhas de evidências experimentais indicam que a degradação de proteassoma não mediar directamente a degradação da proteína β-catenina induzida ZnPP. Em primeiro lugar, a fosforilação da proteína β-catenina, um acontecimento que conduz a ubiquitinação e subsequente degradação de proteassoma de β-catenina, não foi induzida por ZnPP em células cancerosas. Pelo contrário, o tratamento ZnPP reduzida rapidamente os níveis de proteína β-catenina fosforilada, provavelmente devido à rápida degradação da proteína total celular β-catenina. Segundo, a análise de Western blot de proteínas ubiquitinadas poli-ZnPP mostrou que induz a acumulação de proteínas ubiquitinadas-poli, sugerindo que ZnPP actua como um inibidor de proteassoma, em vez de um activador. Em terceiro lugar, a co-IP com um anticorpo β-catenina e a análise Western blot de proteínas específicas de poli-ubiquitinada-K48 de ligação demonstraram que ubiquitinadas poli-β-catenina acumulado após tratamento ZnPP, consistente com a sua inibição de actividade de proteassoma. Por último, uma medição directa do proteassoma chymotryptic, actividades tripticas e caspase-ZnPP como confirmado que suprime significativamente as actividades de proteassoma num tempo e modo dependente da concentração, em células cancerosas. Para o nosso conhecimento, esta é a primeira demonstração de que ZnPP é um inibidor do proteassoma. Note-se que a actividade inibidora de proteassoma do ZnPP é diferente dos inibidores de proteassoma previamente estabelecidos, tais como MG132 [21,22], em que ZnPP parece ter um espectro mais amplo de actividade inibidora de proteassoma (Figuras 3 e 4).

a possibilidade de que ZnPP pode induzir a exportação de proteína β-catenina através exosomes [23] diminuindo assim a expressão da proteína β-catenina celular também não foi apoiada por nossos resultados experimentais. β-catenina proteína não foi detectável por análise por Western blot das proteínas extracelulares recolhidos a partir do meio condicionado de células tratadas com ZnPP. Além disso, os exossomos isoladas a partir da mídia não contêm proteínas beta-catenina. Estas observações indicam que ZnPP não induz a secreção de proteínas β-catenina de células cancerosas.

Temos informou recentemente que os ionóforos zinco melhorar a permeabilidade da membrana lisossoma levando à liberação de enzimas lisossomais e clivagem de proteínas celulares [14]. No presente estudo, o uso de AO nos permitiu demonstrar que aumenta a permeabilidade da membrana ZnPP lisossoma no nosso sistema de modelo de células de cancro, sugerindo que a expressão da proteína de supressão β-catenina de ZnPP é um resultado da digestão enzima lisossómica de proteínas celulares. Importante, induzida por ZnPP permeabilidade da membrana de lisossomas podem ser eficazmente atenuadas pelo pré-tratamento das células com o transporte da proteína de cocktail inibidor BFA /Monensina [29], que se sabe bloquear o transporte celular de enzimas lisossoma (BFA, [26]) e inibe lisossoma acidificação (monensina, [27]). Enquanto este cocktail inibidor não é específico para os lisossomas, a utilização de monensina e BFA para o lisossoma alterar a estrutura e a actividade tem sido bem documentada [30-32]. Estas observações suportam o conceito de que a via de degradação de proteínas mediado por lisossoma está envolvida na supressão induzida ZnPP de expressão β-catenina. O pré-tratamento de células cancerosas com o cocktail de BFA /Monensina atenuou significativamente a supressão da expressão da proteína β-catenina por ZnPP confirmando ainda mais o envolvimento da via de degradação da proteína lisossómica no presente processo. Permanece por determinar se enzimas lisossomais específicos são responsáveis ​​pela degradação da proteína β-catenina induzida ZnPP ou seja um grupo seleccionado de proteínas são degradadas por este processo em células cancerosas. A interacção potencial do sistema ubiquitina-proteassoma com a via de degradação do lisossoma [33,34], que pode ser responsável pela degradação de proteínas β-catenina induzida ZnPP está sob investigação activa. Dado que não há relatos anteriores sobre a supressão mediada por lisossoma de expressão β-catenina, os achados do presente estudo fornecem uma nova visão sobre a atividade anticancerígena de ZnPP e revelar novas estratégias potenciais na supressão da via de sinalização Wnt canônico.

em resumo, temos explorado mecanismos celulares que medeiam a supressão induzida ZnPP de expressão β-catenina em células de cancro. Os nossos resultados indicam que a via de degradação do lisossoma é provavelmente envolvidos na supressão da expressão β-catenina de ZnPP e que este processo é acompanhado por uma inibição da actividade de proteassoma. Estes resultados fornecem um novo mecanismo celular da atividade anticancerígena de ZnPP e implicam uma nova estratégia para a segmentação da via canônica de sinalização Wnt.