Abstract

Fundo

Estudos anteriores demonstraram que as células T menos diferenciadas são ideais para terapia adoptiva de células T de transferência (ACT) e que CH296 fibronectina (FN-CH296), juntamente com anti-CD3 resultou em células cultivadas que contêm quantidades mais elevadas de células T menos diferenciadas. Nesta fase I de ensaios clínicos, construímos nesses resultados anteriores, avaliando a segurança ea eficácia do FN-CH296 estimulado a terapia com células T em pacientes com câncer avançado.

Métodos

Os pacientes foram submetidos a fibronectina CH296 terapia estimulada por células T até seis vezes a cada duas semanas e a actividade de segurança e anti-tumoral da ACT foram avaliados. A fim de determinar a função imunológica, os níveis de citocinas no sangue total e o número de células T reguladoras periféricos foram analisados ​​antes da ACT e durante o acompanhamento.

Resultados

células transferidas continha numerosos menos diferenciadas as células T grandemente representados por CD27 + CD45RA + ou CD28 + CD45RA + celular, que representaram cerca de 65% e 70% do total, respectivamente. Não foram observadas toxicidades relacionadas ACT graves ou inesperadas. A taxa de resposta entre os pacientes foi de 22,2% ea taxa de controlo da doença foi de 66,7%.

Conclusões

Os resultados obtidos neste estudo de fase I, indicam que a FN-CH296 estimulado a terapia com células T era muito bem tolerado com um nível de eficácia, que é muito promissor. Nós também supor que a expansão de células T utilizando CH296 é um método que pode ser aplicado a outras terapias à base de células T-

Registro de Estudos

umin UMIN000001835

Citation:. Ishikawa t, Kokura S, T Enoki, Sakamoto N, Okayama t, Ideno M, et al. (2014) Fase I de ensaios clínicos de fibronectina CH296-Stimulated T terapia celular em pacientes com câncer avançado. PLoS ONE 9 (1): e83786. doi: 10.1371 /journal.pone.0083786

editor: William C. S. Cho, a rainha Elizabeth Hospital, Hong Kong

Recebido: 14 Julho, 2013; Aceito: 05 de novembro de 2013; Publicação: 31 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Ishikawa et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi parcialmente apoiado pela JSPS KAKENHI Grant Número 23590891. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Sem financiamento externo adicional recebida para este estudo

Conflito de interesses:. Takeshi Ishikawa, Satoshi Kokura, Tetsuya Okayama, e Toshikazu Yoshikawa tem uma afiliação com um departamento financiados por doação do TAKARA BIO Inc. Isso não altera os autores “a adesão a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

a transferência adoptiva de células T (ACT) é atualmente um dos poucos imunoterapias que podem induzir respostas clínicas objetivas em uma significativa número de pacientes com tumores sólidos metastáticos [1]. As propriedades intrínsecas da população ACT, particularmente o seu estado de diferenciação, são referidos como sendo crucial para o sucesso de abordagens baseadas em ACT [2] – [5]. As células T menos diferenciadas têm um maior potencial proliferativo e são menos propensas a apoptose de células mais diferenciadas. Menos células T diferenciadas expressam receptores, tais como a cadeia α do receptor de IL-7 (IL-7Rα), por conseguinte, estas células têm o potencial para proliferam e se tornam totalmente activada em resposta a citoquinas tais como IL homeostáticos-7 [6]. Resultados de estudos clínicos prévios demonstraram uma correlação significativa entre a regressão do tumor e a percentagem de células transferidas ACT persistente no sangue periférico [3], [7]. Estas descobertas sugerem que a persistência e potencial proliferativo de células T transferidas desempenhar um papel na resposta clínica e que as células T menos diferenciadas são ideais para a terapia de transferência de ACT. Utilizando um protocolo de expansão rápida normal, as células T para ACT são normalmente expandido com uma dose elevada de anticorpo de IL-2 e específicos de CD3 durante cerca de 2 semanas. células T utilizando este protocolo induzir a diferenciação de células T progressiva para um estado efetoras tarde. No entanto, embora a IL-2 é essencial para o crescimento e a persistência de células T que também tem qualidades indesejáveis, tais como a sua capacidade para promover a diferenciação terminal de células T [8]. Como resultado, o procedimento resulta actualmente utilizados em fenotípicas e funcionais alterações de células T que torná-los menos óptimo para mediar as respostas anti-tumorais in vivo. À luz disto, o desenvolvimento de novos métodos para a obtenção de células T menos diferenciadas é crucial para melhorar a T-cell-based terapias actuais, de modo que os pacientes podem desenvolver uma resposta de longa duração positiva imune.

Tem sido relatado que a fibronectina (FN), a principal proteína matriz extracelular, as funções não só como uma molécula de adesão, mas também como um indutor de sinal através da ligação a integrinas expressa em células T [9], [10]. FN actua em conjunto com anti-CD3 para induzir a proliferação de células T, que é pensado para depender de integrina de activação muito tardia antigénio-4 (VLA-4) /interacções CS1 [11], [12]. fragmento de fibronectina humana recombinante (FN-CH296, RetroNectin) tem sido amplamente utilizado para a terapia de genes retrovirais para aumentar a eficiência da transferência de genes. FN-CH296 também foi relatado para ser capaz de estimular o crescimento de células T de sangue periférico, in vitro, quando utilizado em conjunto com anti-CD3 e IL-2. Anti-CD3 /IL-2 /FN-CH296-células T estimuladas continha uma quantidade mais elevada de células T menos diferenciadas e na persistência in vivo destas células foi significativamente maior do que as células estimuladas por outros métodos [13]. Estas observações nos levaram a aplicar estimulação FN-CH296 mediada às células T fenótipo menos diferenciados para gerar células “T encaixar” [2], [14] que são ideais para ACT. Desta forma, procedeu-se a avaliar a segurança e eficácia da terapia com células T FN-CH296-estimulada em pacientes com câncer avançado.

Métodos

O protocolo para este ensaio e apoiando lista TREND são disponível como informação de apoio; veja Checklist S1 e Protocolo S1.

Design Estudo

O protocolo clínico foi aprovado pelo comitê de ética da Kyoto Prefectural University of Medicine e foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsínquia e as directrizes éticas para Investigação clínica (do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar, Japão). O principal objectivo desta fase I de ensaios clínicos foi avaliar os perfis de segurança e de eventos adversos da terapia de células T FN-CH296 estimulado em pacientes com câncer avançado. Nosso objetivo secundário foi avaliar a actividade antitumoral da terapia ACT. Este estudo foi conduzido como um projeto padrão 3 + 3 fase I que investigou a dose limitante toxicidades (DLTs) que ocorre ao longo de um período de 28 dias após a segunda infusão de linfócitos em cultura. DLT foi definida como ≥3 grade de qualquer acontecimento adverso relacionado com a infusão de células de cultura. Usamos um design acelerado de titulação para avaliar a segurança do número de linfócitos adotivos a 1 × 10

9 (coorte 1), 3 × 10

9 (coorte 2), e 9 × 10

9 ( coorte 3) por pessoa. Se não há DLTs foram observadas no primeiro grupo de pacientes, um segundo grupo de 3 pacientes foram tratados com a dose mais elevada seguinte. Se DLT foi observada em, pelo menos, um paciente, a coorte foi expandido para 6 doentes. Se ≥2 DLTs foram observados na coorte inicial ou expandido, não há mais aumentos de dose foram realizadas e a dose máxima tolerada (MTD) foi considerada ter sido excedido. Não houve aumento da dose intra-paciente neste estudo.

O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes. Este estudo está registrado no Registro umin ensaios clínicos com a UMIN000001835 identificador

Os pacientes

Os pacientes inscritos neste estudo preencheram os seguintes critérios de elegibilidade:. Histologicamente ou câncer de esôfago citologia confirmou, câncer gástrico, colo-rectal câncer, câncer pancreático, câncer do trato biliar ou cancro do pulmão de não-pequenas; doença residual após o tratamento padrão sem outras opções de tratamento curativo disponíveis; Não há planos para receber quimioterapia diferente do pró-drogas fluorouracil orais, radioterapia ou modificadores da resposta biológica; entre 20 a 80 anos de idade; um status Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) a realização de 2 ou menos; uma expectativa de vida de pelo menos três meses; pelo menos quatro semanas desde a última quimioterapia ou radioterapia; . E hematológica, função hepática, renal e cardíaco adequado

A exclusão critérios foram os seguintes: presença de infecção descontrolada; uma história de doença auto-imune ou hipersensibilidade grave, presença de complicações graves, tais como angina instável ou infarto do miocárdio no prazo de seis meses do início do câncer, pneumonia intersticial ou fibrose pulmonar, com achados radiológicos, presença de ascite marcados ou derrame pleural, íleo, outra doença maligna ativa , mental grave deficiência, gravidez ou lactação, e um histórico médico de hipersensibilidade severa.

Preparação das células T FN-CH296 estimulados

o sangue periférico (50-70 mL) foi tomado de pacientes com câncer. As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram separados utilizando Ficoll-Paque Premium (GE Healthcare, Tóquio, Japão). Subsequentemente, 3-8 × 10

7 células foram re-suspensas em meio de cultura em um saco CultiLife215 (Takara Bio, Otsu, Japão) que foi pré-revestido com ambos os anticorpos anti-CD3 e FN-CH296 (RetroNectin®, Takara bio), que é um fragmento de fibronectina recombinante humana. As células foram cultivadas num meio isento de soro, GT-T551 (Takara Bio), o qual foi suplementado com 0,6-1,2% de plasma autólogo inactivado pelo calor e 200 U /mL de IL-2 recombinante (Proleukin; NovartisPharma, Nuremberga, Alemanha) . No dia 4, as células foram transferidas para um saco CultiLife Eva (Takara Bio), e forma-GT T551 que foi suplementado com 0,6-1,2% de plasma autólogo inactivado pelo calor e 200 U /mL de IL-2 foi adicionada. No dia 7, foi adicionado meio de GT-T551 contendo 200 U /mL de IL-2. No dia 10, as células foram colhidas e re-suspensas em 50-90 mL de solução criopreservadas consistindo de PB-1 (Kyokutou Seiyaku, Tokyo, Japão), RPMI 1640 (KOHJIN bio, Sakado, Japão) e albumina de soro humano (Albuminar; CSL Behring, PA, EUA) para criar o produto final de células. A fim de se obter o número determinado de linfócitos adoptivos, os pacientes em coortes 1 e 2 necessária uma cultura de linfócitos de uma só vez, e os pacientes no grupo 3 precisou de três culturas de linfócitos. . Linfócitos em cultura foram congeladas e armazenadas a -80 ° C até ao momento da transfusão

Antes da infusão pacientes, produtos de células foram avaliadas para o $ \\ raster (80%) = “RG1” $ viabilidade por azul de tripano ensaio de exclusão $ \\ raster (80%) = “RG2” $ a esterilidade do BacT /ALERT (bioMérieux, Durham, NC, EUA), sistema de detecção microbiológica, e $ \\ raster (80%) = “RG3” $ endotoxina por um ensaio de LAL cinético turbidimétrico. Ambos os testes de esterilidade e endotoxinas foram contratados para FALCO Biosystems (Kyoto, Japão). Além disso, marcadores fenotípicos de uma pequena alíquota do produto final foram examinados após a congelação-descongelação. Assim, estes marcadores são consideradas praticamente equivalentes aos das células infundidas.

Sangue Total Os ensaios de citocina

função imune foi testada usando sangue venoso obtido a partir de pacientes antes da administração de células cultivadas com eles (linha de base) e durante o acompanhamento que ocorreu 4 semanas após a 2

nd e 6 de infusão de células cultivadas (Fig. 1). Os métodos para quantificar a produção de IFN-α em sangue humano total foram descritos anteriormente [15]. Resumidamente, sangue periférico heparinizado foi cultivada com o vírus Sendai (500 HA /ml) num período de 8 h após a amostra de sangue foi colhida. A mistura de vírus-sangue foram incubados a 37 ° C durante 20 h, e a actividade de IFN-α nos sobrenadantes foi quantificada através de um bioensaio. Outras citoquinas foram quantificadas de acordo com os procedimentos descritos anteriormente [16], [17]. sangue completo heparinizado foi diluído quatro vezes com meio essencial mínimo de Eagle (Nissui Pharmaceutical Co. Ltd., Tóquio, Japão) e estimuladas com f ito-hemaglutinina-P (PHA-P, 25 ug /mL, Wako Puré Chemical Ind., Osaka, Japão ). As amostras foram incubadas a 37 ° C durante 48 h, após o que os sobrenadantes foram colhidos por centrifugação a 800 ×

g

durante 10 min, e, em seguida, armazenada a -80 ° C até serem necessários para análise. Os níveis de citocinas nas amostras foram medidos com um sistema de matriz de citocinas multiplex Bio-Plex (; Bio-Rad Laboratories, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. O kit de grânulo Multiplex Th1 /Th2 (Bio-Rad Laboratories) medidos os seguintes citocinas: IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, Factor de Necrose Tumoral (TNF ) -α, IFN-γ, e factor estimulador de colónias (GM-CSF de granulócitos-monócitos). aquisição e análise de dados foram realizados com o Gerenciador de Software Bio-Plex, versão 5.0. Uma vez que os níveis de citocinas sem PHA-P-estimulação eram extremamente baixos (dados não mostrados), foram avaliados somente aqueles com PHA-P-estimulação neste estudo.

Os indivíduos receberam terapia de células T estimulada em CH296 os dias 1 e 15. realizou-se as avaliações de segurança durante as primeiras 6 semanas de tratamento. Os pacientes que desejavam continuar o tratamento recebido até 4 tratamentos adicionais a cada 2 semanas. Para testar a função imunológica, o sangue venoso foi obtido a partir de matérias antes do início da terapia (linha de base) e durante um follow-up que ocorreu em 4 semanas (2 tratamentos) e após 6 administrações de células cultivadas.

Análise de citometria de fluxo

As células foram coradas com FITC, ficoeritrina (PE) -, ficoeritrina TexasRed (ECD) -, ou ficoeritrina-cianina (PC5) -conjugated mAb específico para CD3, CD4, CD8, CD27 , CD45RA, CD56, HLA-DR (Beckman Coulter, Marseille, França), CD28, NKG2D (eBioscience, CA, EUA) e CCR7 (R D systems, MN, EUA). Para determinar a regulamentar células T (Treg), foram utilizados os seguintes anticorpos: PE-Cy ™ 5 de rato anti-humano CD4, rato PE CD25 anti-humano e Alexa Fluor® 488 rato anti-humano Foxp3 (BD ​​Biosciences Pharmingen, CA , EUA). As células foram incubadas a 5 ° C durante 30 min, em seguida, lavou-se com solução salina tamponada com fosfato e analisadas por Cytomics FC500 (Beckman Coulter). Para a detecção de Foxp3, as células foram permeabilizadas durante a noite em Fix tampão /Perm (eBioscience) e depois corados com anti-Foxp3. aquisição e análise de dados foram realizados com o software CXP, versão 2.2 (Beckman Coulter). O fluxo de dados foi analisado pelo seguinte método: portas de linfócitos foram determinadas visualmente no FSC /SSC trama, após o que portões com uma região positiva de CD3, HLA-DR foi determinada por coloração das células com anticorpos de controlo de isotipo. Os outros (CD4, CD8, CD28, CD45RA, CD56, CD28, NKG2D e CCR7) foram determinados visualmente em um ponto vale do histograma ou gráfico de pontos. Tregs fenótipo foi definida como células CD4 + CD25 + Foxp3 +.

tratamento do estudo

As células congeladas foram descongeladas rapidamente a 37 ° C num banho de água com agitação suave. Os pacientes foram infundidos por 30 min em regime de ambulatório do Hospital Universitário de Kyoto Prefectural. Os doentes foram monitorizados quanto a efeitos tóxicos agudos durante pelo menos uma hora após a infusão, antes de serem descarregadas. linfócitos em cultura foram administrados nos dias 1 e 15, e realizamos imuno-controlo para avaliar a segurança do tratamento de 4 semanas após a transferência adoptiva de células 2 foi feito. Duas transferências geralmente são suficientes para avaliar a segurança dos novos ACT no entanto, uma vez mais tratamentos pode ser benéfica, os pacientes poderiam receber até mais quatro transferências a cada duas semanas a menos que tivessem efeitos tóxicos inaceitáveis, progressão da doença, ou retirou o consentimento (Fig. 1).

toxicidade e eficácia Avaliação

Segurança e toxicidade foi determinada com base em entrevistas com pacientes regulares, exames laboratoriais e exames físicos. Os efeitos tóxicos foram monitorados de acordo com os critérios do National Cancer Institute Common toxicidade (NCI-CTC versão 3.0). A relação entre a transferência adoptiva de células e a toxicidade foi avaliada com base nas características de efeitos secundários ACT em comparação com os pró-fármacos de fluorouracilo orais.

Actividade

antitumoral foi avaliada com base na resposta do tumor actual. Para avaliação da eficácia, a tomografia computadorizada (TC) foi executada antes do início do tratamento ACT, quatro semanas após a 2

ND infusão de linfócitos em cultura e, posteriormente, a cada 4 semanas durante três meses. As respostas foram definidos de acordo com os Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos (RECIST versão 1.0) critérios.

Análise Estatística

A Wilcoxon Signed Rank Test foi utilizado para comparar os resultados antes e depois do tratamento. Spearman método coeficiente de correlação foi utilizado para avaliar a possível associação linear entre duas variáveis ​​contínuas. P valores inferiores a 0,05 foram considerados significativos. Todas as análises estatísticas foram realizadas com o software SPSS (versão 20) para Windows (IBM Corporation, Illinois, EUA).

Resultados

características do paciente

de maio de 2009 a dezembro de 2009 , dez pacientes com câncer foram incluídos neste estudo. Um paciente descontinuado devido a uma rápida piora de sua condição geral antes de iniciar o tratamento. Assim, nove pacientes eram elegíveis para o estudo e divididos em três grupos de tratamento. características clínicas dos pacientes estão listadas na Tabela 1. A idade média foi de 60 anos (variação 43-75), e todos os pacientes tiveram uma pontuação de 0 ou 1. Três pacientes desempenho ECOG teve cancro colo-rectal, dois tiveram câncer do ducto biliar, e um paciente cada tinha câncer pancreático, câncer gástrico, carcinoma hepatocelular e câncer de pulmão. Dos nove pacientes, sete receberam S-1 (uma fluoropirimidina oral) monoterapia que foi combinada com a terapia de ACT. Todos os pacientes foram submetidos a duas infusões de células cultivadas, e oito pacientes que desejavam continuar o tratamento completado mais 4 infusões de células T. Dos nove pacientes, um (paciente nº 9.) Não deseja continuar o tratamento, então ele recebeu duas injeções de células cultivadas no total.

fenótipo das células transferidas

Células expandida uma média de 394,0 vezes (intervalo, 292.5-554.5 dobras) durante o período de cultura de 10 dias. A viabilidade das células cultivadas média foi de 97,4% (intervalo 95,7-98,5%). As alterações no fenótipo da superfície da célula depois de cultura são mostrados na Figura 2. Antes da estimulação, as CMSPs continha 45% de células T CD4 + e cerca de 25% de células T CD8 +. A razão entre células CD8 aumentou significativamente para cerca de 60%, após cultura, ao passo que proporção de células CD4 + apresentam uma redução. A proporção de células CD27 + CD45RA + e CD28 + CD45RA +, que foi expresso em células T menos diferenciadas, aumentou significativamente para cerca de 60%, após cultura, ao passo que não houve nenhuma alteração significativa na proporção de células CCR7 + CD45RA +. Ambos CD3 + HLA-DR + e CD8 + NKG2D + população de células que são marcadores de ativação de linfócitos, aumentaram significativamente após a cultura. Por outro lado, CD3-CD56 + (células NK) e células CD3 + CD56 + (células NKT) eram insignificantes população de células após cultura (média de 0,73% e 2,16% respectivamente). O fenótipo das células transferidos de cada caso é mostrada na Tabela 2. A grande maioria das células foram transferidas CD3 positiva (98,1% em média), e havia muito poucos CD3-CD56 + células (0,73% em média). As proporções de células CD4 +, CD8 + e CD8 + + NKG2D células em células transferidas foram de 36,2%, 60,3% e 53,7%, respectivamente. Como para o fenótipo de células T menos diferenciadas, CD27 + CD45RA +, CD28 + CD45RA +, e CCR7 + CD45RA + células foram de 59,5%, 60,0%, e 22,4%, respectivamente. A proporção destes fenótipo de células T menos diferenciadas era marcadamente diferente entre os pacientes, particularmente, a proporção em paciente 2 foi consideravelmente reduzida (Tabela 2). Coeficientes de CD27 + CD45RA +, CD28 + CD45RA +, e CCR7 + CD45RA + células transferidas (após cultura) fortemente correlacionados com aqueles de PBMCs (antes da cultura) (Fig. 3).

PBMC foram estimuladas com anti-CD3 /CH-296. No dia 10, as células cultivadas foram recolhidas por transfusão. fenótipos de superfície celular de PBMCs ou células de cultura foram analisados ​​por citometria de fluxo. Os resultados médios de nove indivíduos são mostrados. Em todos os painéis, as linhas representam a média ou desvio padrão. * P 0,05

A comparação foi feito em termos de marcadores da superfície celular (ou seja, CD27 + CD45RA +, CD28 + CD45RA +, CCR7 + CD45RA +)

Toxicidade

Os eventos adversos reportados neste estudo estão apresentados na Tabela 3. Um paciente, que foi administrada S-1, 3 neutropenia de grau no entanto, este episódio foi considerado estar relacionado com S-1 e não agir. Grau dois ou mais baixas toxicidades hematológicas de nível foram observadas principalmente em pacientes administrados com S-1, e essas toxicidades hematológicas eram em sua maioria transitória. Foram observados eventos não hematológicas incluindo fadiga e anorexia, mas todos esses foram suave. Não foram observadas toxicidades graves ou inesperados relacionados com a ACT. Assim, nenhum DLT foi observado neste estudo de fase I.

Resultados Clínicos

Um paciente (no.4) alcançaram resposta completa (CR). O paciente CR sofria de linfonodo recorrência após uma operação de câncer retal e ela foi tratada com mFOLFOX6 como quimioterapia de primeira linha. Posteriormente, ela foi tratada com Capecitabina como segundo quimioterapia linha, mas metástases em linfonodos intrapélvica foi detectada por FDG-PET. O doente recebeu então ACT terapia combinada com o S-1. Três meses depois de 6 infusões de células T em cultura, a lesão desapareceu completamente. no.8 paciente apresentou resposta parcial (PR). Ele tinha câncer do ducto biliar refratário, e foi tratado com GEM como quimioterapia de primeira linha seguida pelo GEM /S-1 como 2

nd linha de quimioterapia. No entanto, 17 meses após o início da quimioterapia, o tamanho do tumor primário e as metástases aumento na vértebra cervical foram detectados. Ele, em seguida, foram submetidos à terapia ACT combinado com S-1. Dois meses depois de 6 infusões de ACT, o tamanho do tumor primário no fígado diminuiu em 35% e as lesões metastáticas no vértebra cervical desapareceu completamente por FDG-PET.

Dos 9 pacientes, um (11,1% ) exibiram CR, um (11,1%) teve PR, 4 (44,4%) tinham doença estável (SD), e 3 (33,3%) tinham doença progressiva (DP) (Tabela 4). A taxa de resposta foi de 22,2% (95% de intervalo de confiança (IC) 2,8 60,0%?) Ea taxa de controle da doença (DCR; CR + PR + SD) foi de 66,7% (IC 95% 29,9-92,5%)

monitorização imune

Para determinar as respostas imunes em pacientes que recebem ACT romance, ensaios de citocinas no sangue total e análise Treg periférica, que pode ser útil na monitorização imune [18] – [20], foram realizados usando sangue venoso obtido a partir de pacientes. Não houve alteração significativa nos níveis de citocinas no sangue total (Fig. 4A) em doentes depois de terem sido infundidos com células cultivadas; No entanto, houve uma diminuição nos níveis de IL-4, IL-5 e IL-13 após o tratamento. Os níveis de IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-12 e GM-CSF na coorte 3 aumentou após o tratamento; em particular, os níveis de IFN-γ, IL-12 e GM-CSF aumentou um múltiplo de 10 ou mais vezes. Em seguida, avaliamos os níveis de citocinas no sangue total acordo com a resposta tumoral objectiva. Os níveis de IFN-γ, IL-2, IL-12 e GM-CSF em pacientes com PR /CR aumentou mais do que duas vezes após o tratamento, enquanto que os níveis em pacientes com DP ou Pd diminuído ou não se alterou significativamente após o tratamento ( Fig. 4B).

os níveis médios de citocinas em indivíduos em cada grupo (a) e níveis para as diversas respostas do tumor (B) são mostrados.

Quanto Tregs, tanto o número e proporção destas células no sangue periférico mostrou nenhuma mudança significativa após o tratamento, quando foram avaliadas de acordo com a coorte ou a resposta do tumor (Fig. 4A, B).

Discussão

os resultados apresentados neste estudo indicam que a terapia com células T FN-CH296-estimulada foi muito bem tolerado em nossa amostra do paciente. No ACT-relacionada significativa de grau 3 ou 4 eventos adversos ocorreram em qualquer paciente ea ACT produziu regressão do tumor em 2 pacientes: CR em um paciente com câncer retal e PR em outro com câncer das vias biliares. A taxa de resposta foi de 22,2% ea DCR foi de 66,7%. Apesar do tamanho da amostra, estes resultados são promissores.

Os resultados de estudos anteriores de rato e ensaios clínicos demonstraram que as células T menos diferenciadas pode ser o ideal para a população imunoterapias baseadas em actuar por causa da sua persistência in vivo , elevado potencial proliferativo, receptividade a sinais homeostáticos e co-estimuladores, a sua homing para tecidos linfóides secundários e a sua capacidade para segregar IL-2 [2] – [5]. Adicionado a esse, Yu et al. relataram que FN-CH296 agindo com anti-CD3 induz a proliferação de células T. Estas evidências sugerem isso é estímulo FN-CH296 /anti-CD3 pode ser uma maneira eficiente de gerar um grande número de células T menos diferenciadas adequado para ACT resultando em maior e mais longa persistência in vivo [13].

CD45RA , CD27, CD28 e CCR7 são conhecidos por ser altamente expressa em células T menos diferenciadas. Com base em estudos de infecção viral humanos, foi proposto um modelo linear de diferenciação de células T em que CD27 + CD28 + CD45RA + células naïve progredir através de um início de antígeno-experiente CD27 + CD28 + CD45RA e, em seguida, procede a um CD27 + CD28-CD45RA /+ fenótipo intermediário e finalmente para CD27-CD28-CD45RA +/- tarde antígeno-experiente. Este movimento linear conduz a um aumento do potencial citotóxico e uma redução na proliferação das células [21]. CD27 e CD28 são moléculas co-estimulatórias, que actuam em conjunto com o receptor de células T (TCR) para suportar a expansão de células T [22]. Tem sido sugerido que as células T que expressam CD28 segregam IL-2 e induzir moléculas anti-apoptóticas [23]. Nos últimos tempos, o papel da expressão de CD28 em ensaios clínicos com base em ato tem sido cada vez mais atenção e investigações mais detalhadas estão sendo feitas. Análise de persistir e não-persistentes TIL clones indicam a sobrevivência preferencial dos clonotypes que expressam níveis elevados de CD28, implicando uma vantagem de sobrevivência para as células T transferidas com CD28 + fenótipo menos diferenciadas [4], [5]. CD27 também pode aumentar a proliferação de células T induzida por TCR e é necessário para a geração e manutenção das células T de memória in vivo [24]. Há evidências de que a frequência de células T que expressam CD27 aumenta gradualmente após a ACT, e pode ser associado com a manutenção a longo prazo de um conjunto estável de células T específicas do tumor em pacientes que respondem [25]. Nesta fase I de ensaios clínicos, as frequências de ambas as células CD27 + CD45RA + e CD28 + CD45RA + aumentaram significativamente após a cultura e sua população em células transferidas eram cerca de 60%. Por outro lado, a frequência de células CCR7 + CD45RA +, que também foram expressas em células T menos diferenciadas, não se alterou após a cultura, por razões desconhecidas. As proporções das células T fenótipo menos diferenciadas (i.e. CD27 + CD45 +, CD28 + CD45RA +, e CCR7 + CD45RA + células) em células transferidas diferiram grandemente para cada paciente. A forte correlação positiva foi encontrada entre as proporções de CD27 + CD45RA + (ρ = 0,717, p = 0,037), CD28 + CD45RA + (ρ = 0,717, p = 0,037), CCR7 + CD45RA + (p = 0,733, p = 0,031) células células transferidas e aqueles em PBMC (antes da cultura). É necessário melhorar ou encontrar novos métodos que podem eficientemente gerar grandes números de células T menos diferenciadas, mesmo nos casos em que existem poucas células T menos diferenciadas. Consistente com relatórios anteriores [13], verificou-se que a estimulação com FN-CH296 /anti-CD3 preferencialmente expandida células CD8 + no presente estudo. Acredita-se geralmente que o mecanismo de tumoricida efectora predominante é o efeito de matar citotóxica de células T CD8

+ células T, no entanto, apesar da investigação feita até à data, o impacto da proliferação preferencial de células T CD8 em imunoterapia do cancro ainda precisa de muito mais investigação.

estudos anteriores demonstraram que o IFN-γ desempenha um papel importante na imunoterapia do cancro e a expressão de IFN-γ de células T é considerado ser altamente correlacionados com sucesso terapêutico. Nós também demonstraram que o ensaio dos níveis de IFN-y de sangue inteiro era um método eficiente para avaliar a resposta clínica ao imunoterapias do cancro [19] [20]. Neste estudo, os níveis de IFN-y de sangue total em grupo 3 aumentou até 10 ou mais vezes após 6 infusões de células cultivadas. sangue os níveis de IFN-gama inteiros na PR ou CR casos aumentou mais de duas vezes, enquanto aqueles em casos de PD ou SD viu nenhum aumento significativo após o tratamento. O achado em nosso estudo anterior [20] que o aumento nos níveis de IFN-γ de sangue total após a ACT foi independentemente relacionado à sobrevida global em doentes com cancro enfatiza a relevância dos resultados obtidos neste estudo.

Apesar de não significativa correlação entre o número de células T menos diferenciadas infundido e os níveis de IFN-γ sangue total não foi confirmado, provavelmente devido ao pequeno tamanho da amostra, supomos que as células T menos diferenciadas podem contribuir para a elevação dos níveis de IFN-y. Estudos futuros são necessários para explorar o efeito da quantidade de CD27 + CD45RA +, CD28 + CD45 + e CCR7 + CD45RA + células sobre os níveis de IFN-γ sangue total.

Em adição ao IFN-γ outros níveis de citoquinas Th1 tais como IL-2, IL-12 e TNF-α também aumentada em pacientes na coorte 3, e em pacientes com PR /CR, enquanto que a Th2 os níveis de citocinas, tais como IL-4, IL-5 e IL-13 diminuiu depois do tratamento. Além disso, o sangue total nível de GM-CSF aumentou em pacientes em coorte 3 e em pacientes que experimentaram PR /CR. Foi previamente relatado que a imunidade mediada por célula é preferencialmente activada por citocinas Th1, enquanto que as citocinas de Th2 suprime a imunidade mediada por células [26]. GM-CSF é uma citocina pleiotrópica que estimula as células dendríticas (DC) e promove a captação de antigénios tumorais por DCs que conduzem a de células T de cross-priming e activar o sistema imune contra antigénios específicos [27], [28]. Por conseguinte, com base nos resultados da vigilância imune feito no presente estudo, que estão inclinados a acreditar que a terapia com células T estimuladas CH296 fibronectina podem exercer efeitos anti-tumorais através da activação de imunidade mediada por células. Embora tenhamos demonstrado recentemente que a ACT tem o potencial para reduzir o número de Tregs [29], na análise realizada neste estudo, o número de Tregs periféricos não se alterou de forma significativa após o tratamento.

A capacidade de resposta a imuno-baseados terapias varia entre tipos de tumores. Enquanto melanoma e câncer de células renais são considerados classicamente ser imunogênica, a maioria das doenças malignas epiteliais não são imunogênica e respondem mal à imunoterapia. Em nossa amostra, todos os nove pacientes tinham doenças malignas epiteliais tais como cancros gastrointestinais e câncer de pulmão que são tradicionalmente considerados como refratários a imunoterapia. Deve notar-se que a resposta objectiva foi observada em doentes com cancro rectal e cancro do ducto biliar. Ainda não está claro se este romance ACT tem potencial terapêutico para vários tipos de tumor.