Abstract

Fundo

câncer de próstata resistente à Castrados

(CRPC) é uma condição letal em pacientes que recebem terapia de privação de andrógeno para o cancro da próstata (PC). Apesar de numerosos estudos que mostram a expressão de proteína HIF1α sob normoxia em linhas celulares PC, o papel desta expressão HIF1α normóxica na quimio-resistência e a migração não foi investigada anteriormente. Como nenhum método está actualmente disponível para determinar quais os tumores irão progredir para CRPC, o papel de HIF1α no PC e seu potencial para predizer o desenvolvimento da CRPC também foi investigada.

Métodos

O efeito de proteína HIF1α knockdown na quimio-resistência e a migração de células PC3 foi avaliada por contagem de células e ensaios de Transwell, respectivamente. a eficiência de tradução do ARNm HIF1α foi determinada em células PC utilizando uma construção HIF1α 5’UTR-luciferase. Os resultados clínicos foram correlacionados após a coloração de 100 tumores de próstata para a expressão HIF1α.

Resultados

As linhas celulares CRPC-like (PC3 e DU145) expressou mais proteína HIF1α de uma linha de células sensíveis andrógeno ( LNCaP). taxa de migração e quimio-resistência foram maiores nas células PC3 e ambos foram diminuídas quando a expressão HIF1α foi reduzida. O aumento da tradução de ARNm HIF1α pode ser responsável por HIF1α sobreexpressão em células PC3. Os pacientes cujos tumores expressaram HIF1α tinha diminuído significativamente a sobrevida livre de metástases e os pacientes que estavam em terapia de privação de androgênio diminuiu a sobrevivência CRPC-livre na análise de Kaplan-Meier. Na análise multivariada HIF1α foi um fator de risco independente para progressão para PC metastático (taxa de risco (HR) 9,8, p = 0,017) e desenvolvimento de CRPC (HR 10,0, p = 0,021) em pacientes em terapia de privação de androgênio. Nomeadamente os tumores que não expressam HIF1α não metástase ou desenvolver CRPC.

Conclusões

HIF1α é susceptível de contribuir para a metástase e quimio-resistência do CRPC e orientada redução da HIF1α pode aumentar a capacidade de resposta de CRPC à quimioterapia. Expressão de HIF1α pode ser uma ferramenta de triagem útil para o desenvolvimento da CRPC

Citation:. Ranasinghe WKB, Xiao L, Kovac S, Chang M, Michiels C, Bolton D, et al. (2013) O papel da hipóxia-inducible factor 1α na determinação das propriedades dos cancros da próstata castrou-resistente. PLoS ONE 8 (1): e54251. doi: 10.1371 /journal.pone.0054251

editor: Irina U. Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 22 de Agosto de 2012; Aceito: 10 de dezembro de 2012; Publicação: 16 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ranasinghe et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações 454322 (GSB), 566.555 (CGS, aS) e 628390 (aS, op, GSB) do Nacional de Saúde e Pesquisa médica do Conselho da Austrália. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PC) é o segundo câncer mais comum em homens em todo o mundo e continua a impor uma carga de doença significativa e um problema de saúde em todo o mundo em crescimento. No entanto, a nossa compreensão dos mecanismos que contribuem para o desenvolvimento de PC é ainda limitada [1]. Os androgénios e o receptor de androgénio (AR) são reguladores importantes da estimulação e a sobrevivência de células de cancro da próstata. terapia da privação do andrógeno (ADT) é a base do tratamento da metastático e câncer de próstata localmente avançado. No entanto, ADT eventualmente falha para manter a supressão de cancro da próstata a maioria dos homens com esta condição.

Cancro da próstata resistentes-Castrados

(CRPC) é uma forma letal de PC que podem progredir rapidamente e metastizar. No desenvolvimento da CRPC, mais de 84% dos pacientes terão metástases [2]. Alguns biomarcadores para predição de CRPC foram descritos [3], [4], e, atualmente, não existe um consenso universal sobre a identificação de quais pacientes com PC irão progredir para CRPC. Além disso, os mecanismos que resultam no desenvolvimento e progressão da CRPC permanecem pouco compreendidos, em parte, devido à limitada disponibilidade de linhas de células que modelam estreitamente CRPC. O PC3 duas linhas de células PC utilizadas e DU145 não são considerados como totalmente representativa de células CRPC já que não foram isolados a partir de cancros da próstata que recidiva após terapia de privação de andrógeno, e desde que eles expressam pouco [5] se houver AR [6], Considerando AR é frequentemente sobre-expressos em tumores CRPC. No entanto, como células PC3 e DU145 exibir algumas das propriedades fundamentais de um tumor CRPC incluindo alta de migração (metástase), andrógeno-independência e quimio-resistência similar à linha de células CRPC LNCaP C4-2 [7], e também compartilhar propriedades moleculares semelhantes , incluindo a depleção /mutação do ADN mitocondrial, que foram correlacionadas com a invasividade e resistência às drogas [8], estas duas linhas celulares são frequentemente referidas como células CRPC [9], [10], [11].

a hipoxia é uma redução da concentração normal de oxigénio do tecido que ocorre em muitas doenças, incluindo o cancro. Um ambiente hipóxico dentro da próstata tem sido postulada como sendo responsável pela promoção de alterações genéticas secundárias e estimulação angiogénica, que conduz a um fenótipo de célula mais agressivo e progressão maligna [12]. A capacidade das células para se adaptar a hipóxia é dependente de um conjunto de factores de transcrição indutíveis por hipoxia (HIFs) que consistem de um alfa reguladora (HIF1α) e uma subunidade beta constitutiva (HIF1β). HIFs se ligar à sequência de núcleo 5′-RCGTG-3 ‘nos promotores alvo e induzir mais de 200 funcionalmente diversos genes envolvidos na sobrevivência das células [13]. A síntese de HIF1α ocorre através de mecanismos independentes de oxigênio, mas a sua degradação é dependente de oxigénio e envolve hidroxilase prolil, hidroxilase asparaginil, a proteína de Von Hippel-Lindau e do sistema proteossómica [13].

Embora HIF1α é mais expressa num certo número de cancros humanos [14], [15], o papel de HIF1α na progressão do cancro não é clara. Elevadas concentrações de HIF1α em linhas de células renais e de cancro da mama foram mostrados para aumentar a sobrevivência de células de cancro, enquanto que em concentrações de cancro do ovário alta HIF contribuído para um aumento da apoptose [13]. Dai e colaboradores relataram que a hipoxia aguda expressão aumentada HIF1α e a motilidade e a capacidade invasiva das três linhas de células PC [16]. No entanto, apesar dos numerosos estudos que mostram a presença de expressão HIF1α em normoxia, e um relatório de que a sinalização HIF1α é regulada positivamente em células LNCaP C4-2 resistente à castração normóxicas, em comparação com as células LNCaP parentais [17], o papel da expressão é HIF1α normóxica não é bem documentada, e, por conseguinte, formaram a base do nosso estudo.

de modo semelhante, apesar de expressão em tecidos de alta HIF1α PC [14], [18], [19], [20], [21], [ ,,,0],22], [23], [24], a sua associação com o prognóstico é inconclusiva [25], [24], [26], [27]. No entanto, o consenso é que HIF1α é regulada em tumores de próstata [28], [24] e é um escudo induzida por tumor potente contra o estresse oxidativo ou destruição pela privação de andrógeno, quimioterapia ou radiação citotoxicidade [29]. Atualmente não há estudos têm relatado as relações entre expressão HIF1α eo desenvolvimento de CRPC. Portanto, nosso objetivo foi investigar o papel do HIF1α na regulação da CRPC e analisar o seu potencial como um biomarcador para prognóstico do desenvolvimento da CRPC.

Materiais e Métodos

Os estudos in vitro

cultura celular.

As três linhas humanas da próstata de células de câncer (PC3, DU145 e LNCaP) utilizados neste estudo foram generosamente doada por a /Prof. Ian Davis, Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne, e tinham sido adquiridos a partir de ATCC em 2009. As linhas de células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Mulgrave, Austrália) suplementado com FBS a 8% e 100 U /mL de penicilina. Todas as células foram mantidas a 37 ° C numa incubadora humidificada com 95% de ar e 5% de CO

2. As células tratadas com hipóxia foram cultivadas da mesma forma que os controlos, com excepção de que a fase gasosa continha 94% de azoto (N

2), 5% de CO

2 e 1% de O

2, com concentrações de oxigénio monitorizados e automaticamente ajustada por um controlador electrónico de oxigénio (ProOx Modelo 110, Biospherix, Redfield, Nova Iorque).

análise de Western blot.

As células foram lavadas uma vez com solução salina tamponada com fosfato arrefecido com gelo ( PBS) e lisadas com 0,1-0,2 ml pré-cozidos de dodecilsulfato de sódio (SDS) de tampão de lise. As proteínas foram separadas por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida, e transferidos para uma membrana de nitrocelulose Hybond-C extra (GE Healthcare, Rydalmere, Austrália). HIF1α proteína foi detectada com um anticorpo anti-humano HIF1α monoclonal de ratinho (1:1000, BD Biosciences, North Ryde, Austrália) seguido de um anticorpo de rábano de cabra anti-ratinho secundário conjugado com peroxidase (1:5000, Bio-Rad). Como um controlo de carga, as manchas foram incubadas com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo de coelho anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). As bandas foram visualizadas em uma LAS 3000 Leitor de Imagem (Fujifilm, Brookvale, Austrália), com um avanço de Western Blotting Detection Kit ECL (GE Healthcare). A análise densitométrica das bandas de proteína foi realizada com o software MultiGauge (Fujifilm).

ensaio de proliferação.

Para a medição de níveis basais de proliferação, 2 × 10

5 células foram cultivadas numa 6 bem placa de petri em meio de cultura suplementado com FBS. As células foram lavadas com PBS a 24 horas e cultivadas durante mais 48 horas em meio isento de soro. As células que estavam a receber tratamento foram plaqueadas como acima, e o meio foi removido após 24 horas e suplementado com meio FBS livre antes do tratamento com peróxido de hidrogénio (H

2O

2), cloreto de cobalto, 5-fluorouracilo (5-FU) ou hipoxia (1% de O

2) durante 48 horas. As células foram contadas utilizando um contador de células automatizado (Countess®, Invitrogen).

Os ensaios de migração /invasão (Transwell de ensaio)

células de cancro de próstata foram semeadas a uma densidade de 2 × 10

5 as células em 250 ul por poço de meio de cultura isento de soro para a câmara superior de membranas de filtro de tereftalato de polietileno revestido com fibronectina. As câmaras superiores foram inseridos em poços de cultura de tecidos e o meio de cultura isento de soro de 750 ul foi adicionada à câmara inferior. Após a noite de incubação a 37 ° C, as células não migratórias na superfície da membrana superior foram removidas com uma mecha de algodão, e as células que migraram através dos poros da membrana e invadiram o lado inferior da membrana foram fixadas com 90% de metanol e coradas com hematoxilina e eosina. Para a avaliação quantitativa, o número de células coradas, que migram foi então contado sob um microscópio. Cinco campos de baixa potência por filtro foram contados em três ocasiões separadas por três experimentos independentes.

Stable HIF1α knock down em células PC3.

Os plasmídeos que codificam humana HIF1α shRNA (Mission® números de clone TRCN0000003810 e TRCN0000010819, que codificam para um gancho de cabelo do tipo siARN) e um plasmídeo de controlo negativo (SHC002) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). As células foram transfectadas com um plasmídeo HIF1α shRNA ou o plasmídeo de controlo negativo utilizando o método de transfecção Neon® (Invitrogen). Resumidamente, 1 x 10

6 as células foram tripsinizadas, lavadas com PBS, sedimentadas e antes de ressuspensão em 100 ul de tampão de ressuspensão de néon. Foram adicionados HIF1α ou controlo plasmídeo shRNA (5 ug) e misturou-se bem no seio da suspensão de células antes da transfecção. As células transfectadas foram semeadas em meio completo e seleccionado com 1,0 ug /ml de puromicina (Sigma-Aldrich), durante 7 dias antes de mais ensaios. Knockdown da proteína HIF1α foi demonstrado por transferência de Western, e por medição do seu produto a jusante, o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), por ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA).

eficiência da tradução.

Para determinar se o 5 ‘UTR do mRNA HIF1α tem qualquer papel na HIF1α sobreexpressão em células da próstata de um plasmídeo repórter foi construído em que toda a UTR 5’ e 238 pb da sequência do promotor HIF1α foi clonado a montante de

Firefly

luciferase sequências de codificação do plasmídeo repórter pGL4.10. A construção repórter foi transfectado para células de LNCaP e PC3 e a actividade de luciferase de pirilampo impulsionado pelo vector repórter HIF1-UTR e

Renilla luciferase

(pTK Renilla repórter-vector de controlo) foram determinados após 24 horas de incubação. ARNm total foi extraído das células transfectadas e a quantidade de ARNm de luciferase foi determinada utilizando PCR em tempo real. ARNm de luciferase nas células transfectadas com o vector vazio pGL4 foi utilizado como controlo basal. a eficiência da tradução foi calculada dividindo o

Firefly

actividade de luciferase (proporcional a proteína da luciferase) pela concentração de

Firefly

ARNm de luciferase. Esta proporção foi ainda corrigida para a eficiência de transfecção, tendo em conta a

Renilla

atividade luciferase.

estudos de resultados clínicos

amostras de tecidos humanos.

Para o avaliação das associações entre a expressão HIF1α e os resultados clínicos, 100 tumores de próstata humanos de pacientes que forneceram consentimento informado por escrito foram coletadas seguintes prostatectomia radical ou ressecção transuretral da próstata (RTU) em nossa instituição entre 2000 e 2011. Todas as amostras foram obtidas a partir da Cancro do Victorian Biobank e ou o Departamento de Anatomia Patológica do Hospital Austin, Victoria, Austrália. Aprovação para o uso de espécimes biológicos e os dados do paciente identificado-de para este estudo foram obtidos a partir de Comitê de Ética em Pesquisa da Austin saúde humana.

imuno-histoquímica.

Secções de tecido

Parafina-incorporados foram de-encerado em histolene hidratado e com a diminuição da concentração de etanol. As lâminas foram lavadas em solução salina tamponada com Tris /Tween 20 (TBST) e os antigénios foram recuperados por meio de aquecimento em tampão de ácido cítrico (pH 6,0) em um forno de microondas durante 2 minutos a alta médias e 13 minutos, em meio de baixo. As lâminas foram deixadas a arrefecer e as peroxidases endógenas nos espécimes foram bloqueados por tratamento com peróxido de hidrogénio a 3% durante 10 minutos no escuro. As lamelas foram lavadas em água, equilibrada em tampão TBST, bloqueadas com Ultravision (Thermo Fisher Scientific) durante 10 minutos e coradas para HIF1α utilizando um anticorpo policlonal HIF1α (1:100, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) a 4 ° C durante a noite . Após incubação do anticorpo, as lâminas foram tratadas com um anticorpo secundário conjugado com HRP (Dako), no escuro à temperatura ambiente durante 1 hora. As lâminas foram lavadas com TBST seguinte 5 minutos de incubação com 3,3′-diaminobenzidina (DAB) cromogénio (1 gota /ml de tampão de substrato, Dako) para completar o desenvolvimento da cor. Finalmente, as lâminas foram contrastadas com hematoxilina durante 1 minuto, lavado em água e água da torneira de Scott correr durante 1 minuto cada, desidratado e tampa escorregou. Os investigadores eram cegos para o status de amostras individuais, e os tumores foram divididos de acordo com a presença ou ausência de HIF1α em vez de coloração fraca ou forte para reduzir a variação inter-observador.

Outcomes.

metástases distantes foram definidos por anormalidades documentadas no osso-scan ou tomografia computadorizada. CRPC foi definida como 2 aumentos consecutivos de antigénio específico da próstata (PSA), a partir do nadir do PSA. O tempo para o desenvolvimento de metástases distantes foi medida a partir de uma cirurgia, enquanto que o tempo para o desenvolvimento da CRPC, quimio-resistência e de morte específicas de PC foram medidos a partir do início da privação de androgénio. PSA pré-intervencionista foi definida como PSA imediatamente antes de obter a amostra de tecido, e T3 e T4 encenação foi definido como o câncer de próstata localmente avançado como na Comissão Mista 2002 Americana sobre sistema de estadiamento do câncer [30].

Estatística análise.

a análise estatística foi realizada sob a orientação do serviço de aconselhamento de estatística da Universidade de Melbourne, Austrália. O teste do qui-quadrado de Pearson e teste exato de Fisher foram realizados utilizando dois-por-dois quadros (pontuação de Gleason, HIF1α positividade, estágio do tumor e número de pacientes iniciados na terapia de privação de andrógeno) em software SigmaStat (Jandel Scientific, San Rafael, CA) para testar a associação entre as características do paciente e expressão HIF1α. análise uni e multivariada foram realizadas utilizando modelos de regressão de Cox para todas as variáveis. A fim de superar a não-convergência do modelo de regressão de Cox na análise de HIF1α positividade e pontuação de Gleason (como não houve resultados no grupo negativo HIF1α e a baixa pontuação de Gleason), estas análises uni e multivariada foram calculados por regressão de Cox com o método de Firth penalizado máxima verossimilhança usando o software R, (R fundação para Statistical Computing versão 2.14.0). A sobrevida foi calculado para cada resultado utilizando curvas de Kaplan-Meier com o teste de log rank no pacote estatístico SPSS (IBM SPSS versão 17). avaliações de teste de diagnóstico com análise de sensibilidade e especificidade foram realizados utilizando MedCalc software estatístico (MedCalc Software, Bélgica https://www.medcalc.org/).

In vitro

dados são apresentados como médias ± SEM. A significância estatística para comparações individuais de dados distribuídos normalmente foi determinada pelo teste t de Student ou para dados que não foram distribuídos normalmente por Mann-Whitney Rank Sum. Para comparações múltiplas foram realizadas one-way ANOVA seguido pela correção de Bonferroni. Todas as estatísticas foram analisados ​​com o programa SigmaStat (Jandel Scientific).

Resultados

HIF1α expressão se correlaciona com a migração Taxa em células PC

HIF1α expressão da proteína foi analisada em andrógeno-sensíveis (LNCaP) e andrógeno-insensitive (PC3 e DU145) células CRPC-like. expressão basal HIF1α sob normoxia foi superior em 12 ± 6 vezes e de 10 ± 4 vezes, respectivamente, na CRPC-como linhas celulares PC3 e DU145, em comparação com células LNCaP sensíveis-andrógenos (Figura 1A). É interessante a observação de que a taxa de crescimento basal de células de LNCaP em condições isentas de soro, foi muito mais elevada do que as células PC3, que expressam mais HIF1α, indica que a expressão aumentada de HIF1α não conduz necessariamente a uma maior proliferação (Figura 1B). Para investigar o potencial metastático de linhas celulares de PC, a migração da CRPC linhas celulares PC3 e DU145 foi comparado com células LNCaP sensíveis-andrógenos, utilizando um ensaio Transwell. A observação de que a migração de células PC3 e DU145 foi 177 ± 6% e 215 ± 17%, respectivamente, do valor para as células LNCaP (100%) (Figura 1C) indicou que a sobre-expressão de HIF1α está associada com o aumento da migração.

Uma concentrações) proteína basal HIF1α nas linhas de células humanas PC LNCaP, DU145 e PC3 sob condições de normóxia foram analisados ​​por Western blot. (B) A proliferação foi avaliada por contagem de células após 24 e 48 horas. (C) as taxas de migração /invasão foram medidos por ensaios de Transwell às 24 horas. Os valores em (A) e (C) são expressos como o aumento para o dobro em comparação com as células LNCaP, enquanto que os valores em (B) são expressos como uma percentagem do tempo 0 valor. Todos os valores são a média ± SEM de, pelo menos, três tratamentos separados. taxas (D) sobrevivência das células PC expostos a condições citotóxicos. A sobrevivência de células PC3 (que têm maior proteína HIF1α basal) quando exposto ao stress oxidativo com peróxido de hidrogénio (H

2O

2) ou quimiotoxicidade com 5-fluorouracilo (5-FU) foi comparada com a sobrevivência de LNCaP células (que têm menor expressão HIF1α). A sobrevivência foi avaliada pela contagem do número de células em 24 horas. Os valores são expressos como uma percentagem do controlo não tratado e são a média ± SEM de, pelo menos, três tratamentos separados. #, P . 0,05 contra células LNCaP tratados

Maior HIF1α Expressão correlata ao aumento de célula de sobrevivência

Uma das características da CRPC é a sua resistência à quimioterapia e radioterapia. Para investigar se HIF1α é responsável pelo aumento da sobrevivência das células CRPC-como

in vitro

, a sobrevivência das células após o tratamento de células PC3 ou LNCaP com dois agentes citotóxicos, H

2O

2 (uma fonte do stress oxidativo) e 5-fluorouracilo (5-FU, um fármaco quimioterapêutico) foi medida. Os ensaios de proliferação celular (Figura 1D) revelou que as taxas de sobrevivência de 60 ± 14% e 42 ± 8% para as células PC3, após o tratamento com 100 uM H

2O

2 ou 15? M de 5-FU, respectivamente, foram significativamente maior que as respectivas taxas de sobrevivência de 17 ± 4% e 3 ± 1,6% em células LNCaP andrógeno-sensíveis.

HIF1α Knockdown Diminui célula de sobrevivência e migração de células PC3

Para confirmar que o aumento da sobrevida e migração de células PC3 foi devido a uma maior expressão da proteína HIF1α, a expressão de HIF1α em células PC3 foi derrubado usando vetores shRNA. A transfecção de células PC3 com um vector que expressa HIF1α shRNA reduziu a expressão da proteína HIF1α a 12 ± 3%, em clones 1 e 16 ± 3% no clone 2 em comparação com células PC3 de tipo selvagem (100%) (Figura 2A). VEGF, um produto a jusante de HIF1α, também foi diminuída nos clones HIF1α knockdown, que confirma a redução da actividade HIF1α (dados não mostrados). A observação de que não houve diferença na taxa de proliferação basal entre HIF1α shRNA-expressando células PC3 e células PC3 transfectadas com um vector de controlo scrambled é consistente com a descoberta de que não houve correlação entre maior expressão HIF1α e taxa de proliferação (Figura 1B). Seguindo

2 tratamento

2O H 22,5 ± 3% das células PC3 HIF1α knockdown (shRNA clone 1) sobreviveram, em comparação com a sobrevivência de 58,5 ± 10% em células mexidos de controlo transfectadas com vector PC3 (Figura 2B). Do mesmo modo, o 5-FU reduziu a sobrevivência celular para 27 ± 2% das células em HIF1α knockdown, em comparação com a sobrevivência das células 62 ± 9%, em células PC3 transfectadas com um vector de controlo scrambled. Não houve alteração significativa na expressão de HIF1α após o tratamento de células PC3 transfectadas com controlo de shRNA com 100 ^ M H

2O

2 ou 15? M de 5-FU, em comparação com células não tratadas PC3 (Figura 2C). No entanto, não foram de 2,3 ± 0,2 vezes e 6,6 aumentos ± 1 vezes na expressão de HIF1α após o tratamento de células PC3 com 1% de O

2 ou 300 uM CoCl

2, respectivamente (Figura 2C). Como mostrado na Figura 2A a expressão basal de HIF1α em HIF1α shRNA expressando células PC3 é indetectável, e, por conseguinte, não é possível determinar o efeito do tratamento com 100 uM H

2O

2 ou 15? M de 5-FU sobre HIF1α shRNA-expressar clones de PC3.

concentrações de (a) HIF1α foram reduzidos em 2 clones separados de células PC3 seguinte expressão estável de HIF1α shRNA como avaliado por Western blot. Os valores são a média ± SEM de pelo menos três experiências separadas e estão expressos em percentagem das células PC3 de tipo selvagem. *, P 0,05 contra células PC3 de tipo selvagem. (B) A sobrevivência de células PC3 após a exposição ao stress oxidativo (peróxido de hidrogénio (H

2O

2)) ou quimiotoxicidade (5-fluorouracilo (5-FU), durante 24 horas, foi reduzida após knockdown HIF1α comparação com mexidos células PC3 controlo de vector-transfectadas os valores são a média ± SEM de pelo menos três experiências separadas e são expressos como uma percentagem de não tratada células PC3 transfectadas com vector de controlo scrambled #, P .. 0,05 versus controlo (C), a expressão da proteína HIF1α em. células PC3 transfectadas com shRNA controle após o tratamento com 1% de O

2, 300? M CoCl

2, 100 ^ M H

2O

2, e 15 uM lisados ​​de 5-FU. Cell foram sujeitas a electroforese em SDS géis de poliacrilamida e testados com anticorpo HIF1α. expressão de GAPDH foi usada como controlo de carga. as transferências de Western apresentados são representativos de pelo menos três experiências separadas. densidades de bandas foram determinados por análise densitométrica de HIF1α /GAPDH e são apresentadas em relação ao valor para não tratada células. Os dados representam a média ± SEM; * p 0,05 vs. células PC3 não tratados. (D) As taxas de migração /invasão nas células PC3 knockdown HIF1α foram reduzidos em comparação com as células PC3 transfectadas com vector de controlo mexidos, como avaliadas pelo ensaio Transwell. Os valores são a média ± SEM de pelo menos três experiências separadas e são expressos como uma percentagem de células não tratadas de controlo PC3 transfectadas mexidos vector. *, P 0,05 versus controlo. (E) A indução de HIF1α em células LNCaP pela hipoxia (barras cinzentas escuras) ou por cloreto de cobalto (luz barras cinzentas) aumentou a sobrevivência após a exposição ao stress oxidativo com H

2O

2 ou quimiotoxicidade com 5-FU por 24 horas quando em comparação com células de controlo de LNCaP (barras pretas). Os valores são a média ± SEM de, pelo menos, três tratamentos separados e são expressos como uma percentagem do controlo não tratado LNCaP. #, P 0,05 contra as células LNCaP tratadas. *, P 0,05 contra as células LNCaP tratadas com 1% de O

2 e 5-FU. a expressão da proteína (F) HIF1α em células LNCaP tratadas com 1% de O

2 e 300 uM CoCl

2, em combinação com 100 ^ M H

2O

2 ou 15? M de 5-FU. Os lisados ​​celulares foram sujeitos a electroforese em géis de SDS-poliacrilamida e colocados a hibridar com anticorpo HIF1α. expressão de GAPDH foi usada como controlo de carga. As transferências de Western apresentados são representativos de pelo menos três experiências separadas. densidades de bandas foram determinados por análise densitométrica de HIF1α /GAPDH e são apresentadas em relação ao valor para células normóxicas submetidas ao mesmo tratamento. Os dados representam a média ± SEM; * P . Vs. controlo não tratada,

2O

2 ou 15? M de 5-FU tratadas células LNCaP 100 M H

Anteriormente a 1,8 vezes maior taxa de migração foi observada em 0,05 células PC3 em comparação com células LNCaP sensíveis de androgênio. Para determinar se ou não essa diferença foi mediada por HIF1α, a migração de knockdown e controle do vetor células-PC3 transfectadas HIF1α foi comparado. Knockdown de expressão HIF1α por interferência de RNA diminuiu a migração PC3 para 37 ± 10% (clone 1) e 14 ± 7% (clone 2), em relação ao controle do vetor células-PC3 transfectadas (100%) (Figura 2D).

indução de HIF1α em células LNCaP aumenta, foi induzida a expressão HIF1α célula de sobrevivência

Para determinar se a indução da expressão HIF1α em células LNCaP andrógeno-sensíveis pode aumentar a sua sobrevivência após o tratamento com agentes citotóxicos usando hipóxia (1 % S

2) ou o cloreto de cobalto mimético hipoxia (Figura 2E). A incubação de células LNCaP, quer com 100? M H

2O

2 ou 15? M de 5-FU reduziu a sobrevivência de 17 ± 4% e 26 ± 2%, respectivamente, em comparação com o controlo não tratado (100%). No entanto, as taxas de sobrevivência na presença de 100 ^ M H

2O

2 após o tratamento de células LNCaP com 1% de O

2 ou cloreto de cobalto aumentada para 40 ± 8% e 49 ± 11%, respectivamente. A sobrevivência (113 ± 23%) de células de LNCaP tratadas com 300 uM CoCl

2 em combinação com 15