Abstract

As mutações no

MCPH1

(microcefalina) e

ASPM

(fuso anormal -como microcefalia associados) genes causar microcefalia primária. Ambos são proteínas centrosomal associados envolvidos na mitose. Microcefalina desempenha um papel importante na resposta a danos no ADN e ASPM é necessário para a divisão correcto de células neuro-epiteliais proliferativas do cérebro em desenvolvimento. Redução

MCPH1

expressão de ARNm e

ASPM

ARNm sobre-expressão têm sido implicados no desenvolvimento de carcinomas humanos. câncer epitelial de ovário (EOC) é caracterizada por tumores altamente aneuploides. Anteriormente temos relataram baixa microcefalina e altos níveis de proteína ASPM e associações com parâmetros clínico-patológicos em células malignas de fluidos de ascites. Para confirmar estes resultados anteriores em uma escala maior microcefalina e ASPM níveis de expressão e localizações foram avaliados por imuno-histoquímica em duas coortes; um conjunto de treinamento de 25 amostras e um conjunto de validação de 322 amostras de tecido EOC. Os resultados foram correlacionados com os dados histopatológicos associados. Em tecidos ovarianos normais, o padrão de coloração nuclear microcefalina foi consistentemente forte. Nos tecidos de câncer, identificamos baixa expressão microcefalina nuclear em tumores em estágio avançado de alta qualidade e (

p Art 0,0001 e p = 0,0438, respectivamente). ASPM tinha moderado a elevado nuclear e baixa a moderada expressão citoplasmática no tecido normal. ASPM expressão citoplasmática diminuiu com o grau do tumor e fase do subtipo seroso de EOC (P = 0,023 e P = 0,011, respectivamente). Citoplasmática ASPM aumentou com a fase do tumor no subtipo endometrióide (p = 0,023). O aumento da capacidade de invasão tumoral (T3) e envolvimento ganglionar (N1) também correlacionada com uma diminuição no ASPM citoplasmática em EOC (p = 0,02 e p = 0,04, respectivamente). Temos validado descobertas anteriores de expressão desregulamentado de microcefalina e ASPM em EOC, confirmando associações para níveis microcefalina nucleares baixas e os níveis ASPM citoplasmáticos altas em um estudo de tecido tumoral escala maior. Microcefalina e ASPM pode ser biomarcadores úteis para EOC

Citation:. Alsiary R, ​​Brüning-Richardson A, Bond J, Morrison EE, Wilkinson N, Sino SM (2014) Desregulamentação microcefalina e ASPM Expression estão correlacionadas com epitelial Cancro do ovário da progressão. PLoS ONE 9 (5): e97059. doi: 10.1371 /journal.pone.0097059

editor: Xifeng Wu, MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de fevereiro de 2013; Aceito: 14 de abril de 2014; Publicado em: 15 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Alsiary et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho e Dr. Brüning-Richardson foram financiados pela Yorkshire Cancer Research [L328] para Drs Morrison, bond e Bell. A Universidade de Leeds suporta Dr. Bell, Dr. Bond e Dr. Morrison. Dr. Alsiary por uma bolsa do Ministério saudita do Ensino Superior, Dr. Wilkinson por Leeds Teaching Hospitals NHS Trust. Dr. Wilkinson detém financiamento do bem-estar das mulheres. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Cerca de 225.000 novos casos de câncer de ovário foram diagnosticados em 2008 em todo o mundo, compreendendo 4% de todos os cânceres femininos [1], [2]. A maioria dos cânceres de ovário são epiteliais, frequentemente presentes em fases avançadas e estão associados a altas taxas de mortalidade [3]. Portanto, investigar a função e expressão de proteínas prognósticos potenciais é essencial para o avanço do nosso entendimento da patogênese molecular do câncer epitelial de ovário (EOC). Isto é especialmente desejável no que respeita à identificação de biomarcadores de diagnóstico para gerenciamento de pacientes [4].

O

MCPH1

e

MCPH5

genes codificam microcefalina eo anormal fusiforme proteína associada a microcefalia (ASPM), respectivamente, [5], [6].

MCPH1

e

MCPH5 Quais são dois dos dez genes microcefalia identificados, que estão implicados na autossômica recessiva microcefalia primária (MCPH) [7] – [13]. Microcefalia é caracterizada pelo crescimento de cérebro fetal reduzida resultante de defeitos de mitose durante o desenvolvimento do cérebro embrionário [14]. Microcefalina é uma proteína nuclear e citoplasmática que consiste de 835 aminoácidos. A proteína contém três domínios BRCA1 C-terminal (BRCT), um

N

-terminally localizados e duas no

C

-terminus [5]. Microcefalina está envolvido na resposta a danos no ADN com um papel adicional como um regulador de condensação cromossoma evitando células entrem mitose antes da replicação de ADN está concluída [15] – [17]. Microcefalina também é conhecido como BRIT1 (

BRCT

-repeat inibidor da expressão de hTERT), o qual foi inicialmente identificado como um repressor da transcrição da telomerase humano da transcriptase reversa (hTERT), a subunidade catalítica da telomerase humana [18]. A proteína ASPM consiste de 3477 aminoácidos [6] organizados em uma putativos

N

domínio de ligação de microtúbulos -terminal [19], [20], dois motivos de homologia de repetição calponina, mais de 80 isoleucina-glutamina (IQ) repete [6], [21], que tipicamente se ligam à calmodulina e um

C

-terminus consistindo de uma única sequência como Armadillo e uma região envolvida na citocinese [8], [22]. ASPM desempenha um papel no controlo da função mitótica do fuso [6], [22]. ASPM está localizado nos pólos do fuso em metáfase e ao núcleo e centrossoma durante a interfase [6], [22] – [27]. Além disso, o ASPM localiza no meio do corpo durante a citocinese, sugerindo que desempenha um papel na abscisão [22], [27].

Várias linhas de evidência indicam que microcefalina ASPM e desempenhar um papel na carcinogénese. No nível do DNA, Rai

et al.

Informou que

MCPH1

número de cópias foi diminuída em 40% (35/87) do EOC avançada e em 72% (39/54) de câncer de mama casos de câncer [16]. De modo semelhante, ao nível do ARNm

MCPH1

ARNm foi diminuída em 63% (19/30) de EOCs [16]. Nós relatamos reduziu os níveis de proteína microcefalina em 29% (93/319) dos carcinomas de mama ductal invasivo, com expressão microcefalina diminuindo com o aumento do grau de câncer de mama. Importante, microcefalina foi um preditor independente de sobrevida específica do câncer de mama em geral [28]. Recentemente mais dois pequenos estudos de câncer de mama têm confirmado a associação de expressão microcefalina reduzido com a progressão do tumor eo prognóstico [29], [30]. expressão microcefalina diminuiu também foi relatado em um estudo de câncer de próstata pequena [16], o que sugere que existe uma correlação negativa entre os níveis microcefalina, estabilidade genômica e aberração cromossômica. Recentemente inativação de

MCPH1

pela exclusão, a metilação do promotor e mutação foi identificada num estudo de câncer de células escamosas oral [31]. Este estudo também mostrou que microcefalina sobre a proliferação expressão inibida, invasão e crescimento crescimento e tumor independente de ancoragem em ratinhos nus que suportam a função supressora de tumores de microcefalina [31].

Em contraste,

ASPM

mRNA níveis foram aumentados em células tumorais e transformadas humanos [26], [32]. Aumento

foram também identificados ASPM

níveis de mRNA e proteína no glioblastoma multiforme (GBM), onde foram associados com o aumento do grau do tumor [32], [33]. Além disso,

ASPM

upregulation mRNA foi identificada em 66% (162/247) de carcinoma hepatocelular, uma observação associada com aumento da invasão, estágio elevado e recorrência tumoral precoce [34]. Recentemente regulação positiva de ASPM correlacionada com a sobrevivência reduzida paciente também foi identificado no cancro pancreático [35].

O nosso estudo recente EOC determinou uma correlação entre os níveis microcefalina e ASPM com o grau do tumor e sobrevivência em linhas celulares e culturas primárias de células malignas derivadas de amostras de ascites de ovário [36]. Neste trabalho foram validados nossas descobertas originais em um estudo em maior escala utilizando amostras de tecido EOC e investigaram os papéis de microcefalina e ASPM na progressão EOC. Nossos resultados sugerem que microcefalina e ASPM pode ser biomarcadores úteis na gestão do EOC.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

aprovação ética adequada foi obtida a partir Comitê de Ética em Pesquisa local de o Leeds Teaching Hospitals NHS Trust, Leeds, Reino Unido, (referência REC 09 /H1306 /96). Todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito e todos os dados foram analisados ​​de forma anónima.

Amostras de Pacientes

Uma coorte de 25 de arquivo tumor, fixado em formol e (FFPE) blocos embebidos em parafina foram obtidos a partir do exame histopatológico Departamento de Hospital St James University, Leeds e usado para criar o conjunto de treinamento. A amostra definida nesta coorte representou quatro grandes (mais frequente) subtipos EOC (serosa, endometrioid, mucinoso e carcinossarcoma) e foram predominantemente de grau 3 tumores. Todos os blocos nesta coorte foram então combinadas em uma micromatriz de tecido em casa (TMA). Uma coorte normal, consistiu em 16 amostras de tecido ovariano tomadas a partir de qualquer ovário normal ou a partir de tecido normal adjacente ao tumor mais 4 trompa de Falópio normal e 4 amostras endométrio normal também estavam disponíveis.

foi obtida Outra coorte independente de 322 amostras EOC de Redes Tissue array e foi designado o conjunto de validação. O conjunto de validação consistiu de 294 amostras diferentes de cinco subtipos principais EOC (serosa, endometrioid, adenocarcinoma, células mucinoso e clara), mais 8 tecidos ovarianos normais tiradas de ovário normal e 20 a partir de tecido normal adjacente ao tumor. Os 322 casos foram representados em 616 núcleos, com núcleos duplos para casos de câncer e um único núcleo para o tecido normal. núcleos de tecidos eram de 0,6 mm de diâmetro, com uma espessura de 5 um. Os dados clínicos (grau, diagnóstico patologia, Federação Internacional de Ginecologia e estadiamento Obstetrícia (FIGO) e estadiamento TNM [37]) estavam disponíveis para esta coorte. A média de idade dos 294 pacientes foi de 48 anos (intervalo: 19 a 76 anos). Os resultados para a associação com a idade foram obtidos depois de os dados foram dicotomizados em dois grupos ( 50 e ≤50). as características do paciente detalhadas do conjunto de validação estão resumidos na Tabela 1.

Tissue Microarray Construção

Um in-house TMA foi construído a partir de 25 amostras EOC no Instituto de Câncer Leeds e Patologia instalação seguindo um protocolo descrito por Ellis

et al

[38]. Manual de socos arrayer tecido com um diâmetro de 0,6 mm (Beecher Instruments, Inc) foram utilizados para criar os núcleos. núcleos de tecido foram selecionados a partir da área do tumor o mais representativo em cada bloco do tumor após a revisão da hematoxilina e eosina associado lâminas coradas pela histopathologist ginecológica especialista (NW).

Detecção imunohistoquímica do microcefalina e ASPM

Para optimizar o protocolo microcefalina e ASPM coloração, a casa em secções EOC TMA foram coradas utilizando uma gama de diluições de anticorpos e os métodos de recuperação de antigénio. Microcefalina ASPM e foram coradas separadamente sob as mesmas condições, excepto para a recuperação de anticorpo e de diluição. As lâminas foram deparaffinised e re-hidratadas utilizando xileno e etanol série. Para bloquear a actividade da peroxidase de hidrogénio, as lâminas foram embebidas em 3% H

2O

2 em metanol. A recuperação de antígenos foi levada a cabo usando tampão Vector recuperação de antigénios (Vector Laboratories Ltd) numa panela de pressão durante 4 minutos para microcefalina e 2 minutos para ASPM. As secções foram bloqueadas com uma solução de caseina 01:10 vector (Vector Laboratories) para reduzir a coloração não específica. Nas secções TMA o de coelho anti-microcefalina ab2612 anticorpo (Abcam) foi utilizado a 1/300 e o coelho anti-

N -terminal

ASPM anticorpo 216,1 [36] utilizado a 1/400. As lâminas foram incubadas a 4 ° C durante a noite numa câmara humidificada. Após três lavagens com TBS Tween (0,1%) as lâminas foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente com o polímero de coelho /ratinho secundário, conjugado com peroxidase EnVision (Dako). Depois de mais lavagens a reacção foi visualizado pela adição de 2% + diaminobenzine cromogénio em tampão de substrato de DAP por 10 minutos (Dako). As secções foram contrastadas com hematoxilina de Mayer (VWR International Ltd). Os controlos negativos, sem anticorpo primário e controlos positivos de tecido de ovário normal foram incluídos em cada lote de imuno-histoquímica.

microcefalina e ASPM Anticorpo Validação

A fim de determinar a especificidade de coloração do anticorpo em microcefalina amostras FFPE, um péptido de bloqueio imunizantes experiência foi realizada em secções de tecido EOC e no núcleo 25 in-house TMA. O anticorpo foi neutralizada pela pré-absorção com o péptido ab13737 BRIT1 (Abcam). O anticorpo foi diluído até à concentração de trabalho predeterminado (descrito acima) e incubado com um excesso de dez vezes do péptido durante a noite a 4 ° C antes da aplicação ao tecido. As secções de tecido com anticorpo neutralizado foram comparados com cortes de tecido correspondentes coradas apenas com o anticorpo.

Nós já havia determinado a especificidade de anticorpo do ASPM anticorpo 216,1 em trabalhos anteriores por experimentos de imunofluorescência peptídicas bloqueio [36]. Confirmou-se ainda mais o padrão de coloração do anticorpo observado em IHC por coloração do mesmo na casa de EOC-TMA com um outro anticorpo (279,3) gerado contra o

C

-terminus de ASPM. resultados de coloração semelhantes foram obtidos com ambos os anticorpos, com apenas pequenas diferenças entre os níveis de coloração citoplasmática.

Para mais validação da especificidade e sensibilidade dos anticorpos e para controlar os efeitos da fixação formalina e recuperação antigênica,

MCPH1

e

ASPM

foram derrubados na linha celular U-2 oS (ATCC, Manassas, VA, EUA) por ARNsi como descrito anteriormente [17], [36], [22]. Após 72 células hrs foram colhidas, peletizada, fixados em formalina e suspensas em 1% de ágar, em seguida, embebido em parafina e usados ​​como controles para a validação de anticorpos.

Avaliação imuno-histoquímica

Todas as seções TMA foram escaneados usando o Aperio digitalização do scanner Âmbito de slides (Aperio Technologies) a ampliação de 40x, utilizando ferramentas de morfometria em software Imagescope (Aperio). Para tanto microcefalina e ASPM os núcleos em replicado para cada amostra foram marcados para intensidades de coloração de coloração nuclear e citoplasmática (pontuação intensidade, 0 = nenhuma coloração, 1 = coloração fraca, 2 = coloração moderada e 3 = forte coloração), bem como a proporção de células com nuclear positivo ou coloração citoplasmática dentro dos núcleos (pontuação proporção). Para analisar o microcefalina manchando a Allred sistema (rápida) 8-unidade semi-quantitativa foi utilizado [39]. A proporção de células coradas nucleares ou citoplasmáticas positivas dentro de cada núcleo foi definido como 0 = nenhuma coloração, 1 = 1% da coloração, 2 = 1-10% de coloração, 3 = 11-33% de coloração, 4 = 34-66% manchas, 5 = 67-100% de coloração. A pontuação final foi obtida pela soma das pontuações de intensidade com a pontuação proporção, alcançando uma pontuação mínima de 0 e uma pontuação máxima de 8. Casos com uma pontuação de 4 ou menor foram chamados baixa, enquanto os casos com uma pontuação de 5 ou 6 foram rotulado como moderada e amostras com uma pontuação de 7 ou 8 foram consideradas como expressando altos níveis de microcefalina. Para análise de expressão ASPM dados foi utilizado um sistema de análise de dados ligeiramente mais sensível, em que a intensidade da coloração foi multiplicado pela percentagem de células com coloração nuclear ou citoplasmática [40]. Assim, a menor pontuação é 0 e os mais elevados 300. As amostras com uma pontuação de 0 foram chamados negativas, as amostras com uma pontuação de 1-100 baixos, amostras com uma pontuação de 101-200 moderada e amostras com uma pontuação de 201-300 foram teve como os níveis de expressão elevados. Para análise dos dados descontínua todas as amostras negativas e baixas foram designados baixa e todas as amostras de médias e altas foram designados níveis elevados ASPM.

Análise Estatística

O não-paramétrico de Kruskall-Wallis (KW) e Wilcoxon -Mann-Whitney (WMW) foram utilizados para identificar a associação entre microcefalina e ASPM com variáveis ​​clínicas (estágio da doença, grau, tipo histológico, metástases, comprometimento de linfonodos e idade dos pacientes). Todos os testes estatísticos foram em frente e verso, e uma

P ≤ 0,05

valores foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

microcefalina e ASPM Antibody Caracterização

A anticorpos microcefalina e ASPM foram inicialmente otimizado para uso em seções TMA embebidos em parafina. A imuno-histoquímica com anticorpos demonstraram que estes microcefalina ASPM e foram localizadas no núcleo e no citoplasma de ambos o normal (Figura 1) e amostras de tecido do EOC (Figura 2). O padrão de coloração nuclear microcefalina foi abolido quando o anticorpo foi pré-incubado na presença do péptido. No entanto, alguns baixo nível de fundo coloração citoplasmática uniforme ainda estava presente em todos os núcleos (Figura S1). Portanto, não incluímos a coloração microcefalina citoplasmática em qualquer uma análise mais aprofundada

epitélio ovariano normal demonstrando forte expressão microcefalina em ambos os núcleos e citoplasma (A D). E nuclear forte e expressão ASPM citoplasmática moderada (G J). trompa de Falópio normal, demonstrando nuclear moderada heterogêneo e fraca coloração microcefalina citoplasmática (B E) e coloração ASPM demonstrando forte nuclear e expressão citoplasmática moderada (H K). Endométrio normal mostrando forte coloração heterogênea nuclear e citoplasmática microcefalina (C F) e nuclear forte e fraca citoplasmática de coloração ASPM (I L). Todas as imagens são de ampliação x15.

adenocarcinoma seroso TMA núcleos mostrando microcefalina nuclear e citoplasmática (A e B) e expressão ASPM (C e D), respectivamente. seta branca mostra a coloração nuclear e seta preta mostra coloração citoplasmática. A e B são 20x, C e D são ampliação de 40x.

O padrão de coloração para ASPM anticorpo 279,3 realizada em paralelo com a coloração com anticorpo 216,1 revelou que coloração citoplasmática foi semelhante para ambos os anticorpos. No entanto, 216,1 mostrou um padrão de coloração nuclear mais pronunciada do que 279,3 e, consequentemente, este anticorpo foi usado para manchar o conjunto de validação EOC. Os resultados para os padrões de coloração de núcleos representativos e um resumo dos resultados da coloração são apresentados na Figura Tabela S2 e S1.

Para confirmar ainda mais a validade dos anticorpos para corar tecidos embebidos em parafina, os anticorpos foram testados em parafina células OS -embedded U-2 com e sem siRNA knockdown para microcefalina ou ASPM. células knockdown para ambos os genes mostrou muito fraca coloração em relação ao controle siRNA (Figura S3).

microcefalina Expressão em Normal e EOC Amostras de Tecido

normal ovário, endométrio e amostras de tecido das trompas de Falópio todos revelados forte coloração microcefalina nuclear. A maioria (90%) de células epiteliais do ovário normais demonstraram coloração positiva microcefalina enquanto esta era ligeiramente mais baixa (70-80%) no endométrio e das trompas de Falópio amostras (Figura 1A-F). Inicialmente, a expressão de microcefalina foi avaliada na formação em casa definir TMA. análise dicotômica no conjunto de treinamento demonstrou perda de expressão microcefalina em 16/22 (73%) casos (Tabela 2). No conjunto de validação EOC, baixa expressão microcefalina foi identificada em 30% (89/294) das amostras de EOC (Tabela 3). Uma vez que estavam particularmente interessados ​​em níveis de expressão microcefalina e sua associação com a tumorigénese, examinamos nossos dados IHC para identificar possíveis correlações com os dados clínicos associados. Curiosamente, a análise dicotômica no conjunto de treinamento demonstrou perda de expressão microcefalina no grau 3 tumores EOC (Tabela 2). Este achado foi confirmado no conjunto de validação com coloração nuclear de baixa encontrada principalmente nas 3 tumores de grau (48%; 53/110 p 0,0001). Em tumores de baixo grau, foi observada coloração nuclear moderado ou elevado (

P

0,0001) (Figura 3). expressão nuclear microcefalina também diminuiu com o aumento do estágio do tumor (

p

= 0,0438) (Figura 4). Pacientes com mais de 50 anos de idade demonstraram menores níveis microcefalina nuclear (Tabela 3), mas a diferença não foi estatisticamente significativa (

p

= 0,0581). Não foram identificadas alterações significativas na expressão microcefalina entre os diferentes subtipos patológicos (

p

= 0,486) (Tabela 3). No entanto, a maioria (10/08, 80%) de carcinoma de células claras exibida moderada ou forte imunocoloração microcefalina. Isso pode refletir o fato de que 6/8 destes casos foram a fase I e ou que os diferentes subtipos de EOC seguir diferentes caminhos moleculares. Observamos, também, altas taxas de perda de microcefalina em adenocarcinoma seroso e mucinoso (68/207, 33% e 15/44, 34%, respectivamente, Tabela 3). Figura 5A-D demonstra a expressão de microcefalina nos diferentes subtipos de câncer epitelial de ovário.

Ai. tecido epitelial de ovário normal com expressão alta microcefalina. Aii-IV. Adenocarcinoma TMA núcleos mostrando forte expressão microcefalina em um tumor de baixo grau (Aii), moderada microcefalina em grau 2 (Aiii) e baixos níveis de expressão microcefalina nuclear em um tumor de alto grau (Aiv). Todas as imagens são ampliação de 40x. B. A correlação entre a expressão microcefalina nuclear diminui com o aumento do grau do tumor (

p Art 0,0001 utilizando um teste ANOVA)

Ai.. tecido epitelial do ovário normal demonstrando níveis elevados de expressão microcefalina. Aii-4iv Adenocarcinoma TMA núcleos mostrando microcefalina forte (Aii), microcefalina moderada (Aiii) e baixos níveis de expressão microcefalina nuclear (Aiv) em estágio 1, 2 e 3 tumores, respectivamente. Todas as imagens são ampliação de 40x. B. níveis microcefalina fracas no núcleo estão associados com tumor estádio avançado (

p

= 0,0438 utilizando um teste ANOVA).

A. carcinoma de células claras e B. endometrioid adenocarcinoma ambos mostrando forte expressão microcefalina. C. mucinoso adenocarcinoma e D. adenocarcinoma seroso ambas apresentando fraca expressão microcefalina. Todas as imagens são de ampliação x40.

ASPM Expressão em Normal e EOC Amostras de Tecido

O epitélio normal do ovário, endométrio e trompas de Falópio mostraram expressão ASPM variável, com moderada a expressão nuclear de alta e baixa a moderada coloração citoplasmática ASPM (Figura 1G-G). O padrão de expressão ASPM em EOC foi determinada por imuno-histoquímica utilizando o conjunto de treinamento de 25 secções embebidas em parafina. O padrão de coloração destes em amostras de tumores foi nuclear e citoplasmática. No conjunto de treinamento, foi observada coloração alta nuclear (médio combinados e padrão de coloração forte) em tumores de alto grau (9/14, 64,3%), enquanto que alta citoplasmática ASPM estava presente em todos os núcleos, independentemente do grau. No entanto, subdividindo coloração em fraco, médio e forte revelou um aumento nos níveis elevados ASPM nucleares nos 3 tumores de grau. No geral, a proporção de marcação nuclear foi categorizado em forte (21%, 4/19), médio (31,6%, 6/19) e fraco (47,4%, 9/19) (Tabela 4). A análise mostrou que 10,5% (2/19) das amostras apresentaram forte coloração citoplasmática e 89,5% (17/19) tiveram coloração citoplasmática moderado. coloração citoplasmática baixo não foi observado. Análises posteriores revelaram uma tendência para o aumento da citoplasmática e coloração ASPM nuclear com grau (Tabela 4).

Na validação também foi observada coloração nuclear e citoplasmática definido. Os padrões de coloração diferiam entre amostras tumorais e exemplos de baixa e alta expressão ASPM são apresentados na Figura 6A-D. Não foram identificadas associações significativas entre a expressão ASPM nuclear e os dados clínicos. Embora, curiosamente 52/294 (18%) dos casos apresentaram expressão ASPM nuclear elevado, o que aumentou com a série. A análise do conjunto de validação utilizando análise contínua de dados revelou níveis baixos de ASPM citoplasmática significativamente correlacionados com tumores de grau elevado do subtipo seroso (p 0,001) (Figura 7A). análise descontínua revelou que havia uma correlação significativa entre a baixa qualidade citoplasmática ASPM e alta tumor (p = 0,0138) e também estágio FIGO tumor (p = 0,032) (Tabela 5). Uma análise posterior dos dados descontínuos por subdivisão em subtipos de cancro revelou que, em adição à correlação de baixo ASPM citoplasmática com alto grau de tumor, havia também uma associação de diminuição ASPM níveis citoplasmáticos com o aumento do grau no subtipo seroso (p 0,0001) ( a Figura 7B) e um aumento dos níveis de expressão ASPM com o aumento da fase de tumor no subtipo endometrióide (p = 0,0229) (Figura 7C). A associação significativa entre a diminuição da coloração citoplasmática ASPM e estágio no subtipo serosa também foi identificada (p = 0,0017) (Figura 7D). A associação significativa entre os níveis de ASPM citoplasmáticos e idade do paciente não foi observado (Tabela 5).

A e B. núcleo TMA com baixa nuclear e expressão ASPM citoplasmática. C e D. TMA núcleo com alta nuclear e expressão ASPM citoplasmática. seta branca indica mancha nuclear, seta preta indica mancha citoplasmática. A e C são 6,2x e B, D são ampliação de 20x, respectivamente.

A. níveis ASPM citoplasmáticos diminuir com a série em EOC serosa (dados contínuos, p 0,0001). B. níveis citoplasmática ASPM diminuir com o grau do tumor no subtipo seroso (dados descontínuos, p = 0,0239). níveis C. citoplasmática ASPM aumentar com o estágio da doença no EOC endometrioid (dados descontínuos, p = 0,0229). níveis D. citoplasmática ASPM diminuir com o estágio da doença no subtipo serosa (dados descontínuos, p = 0,0017). E. níveis citoplasmática ASPM diminuir com a invasão do tumor (dados descontínuos, p = 0,02). níveis ASPM citoplasmáticos alto F. correlacionar sem envolvimento de gânglios linfáticos (p = 0,04). Todos os dados analisados ​​através de um teste ANOVA.

Relação entre o estadiamento histopatológico expressão (FIGO eo estadiamento TNM) e microcefalina e ASPM

Na validação definir microcefalina foi encontrada para diminuir com o aumento do estágio do tumor quando se utiliza o sistema de estadiamento FIGO (

p

= 0,0438) (Tabela 3). Da mesma forma ASPM coloração citoplasmática diminuiu com o aumento estágio do tumor quando se utiliza o sistema de estadiamento FIGO (

p

= 0,0032) (Tabela 5). microcefalina níveis de expressão e ASPM foram ainda avaliadas no contexto da gravidade da doença, conforme determinado pelo nível de invasividade tumoral (T1, T2 e T3). Os níveis de expressão microcefalina Nuclear diminuiu mesmo que o tumor estava limitado aos ovários (T1; p = 0,0021). Ao comparar a expressão microcefalina em T2 com o grupo controle, o resultado tornou-se mais significativa (p = 0,0009). No entanto, não houve diferença significativa na expressão microcefalina quando as amostras nos grupos T1, T2 e T3 foram comparados uns com os outros. Além disso, a expressão microcefalina não se correlacionou significativamente com o envolvimento linfonodos regionais (p = 0,1162) ou metástases à distância (p = 0,5251) (Tabela 3).

Para ASPM, uma associação entre os níveis de coloração citoplasmática e capacidade de invasão do tumor foi identificado. níveis citoplasmáticos altas ASPM foram encontrados em T1, que diminuiu significativamente com T2 e T3 (p = 0,0198) (Figura 7E). Alta ASPM citoplasmática também se correlacionou com nenhum comprometimento dos linfonodos (N0) e diminuiu com o envolvimento ganglionar (N1) (p = 0,04) (Figura 7F) (Tabela 5).

Discussão

EOC é frequentemente diagnosticada pela primeira vez em um estágio avançado devido à falta de sintomas e métodos fiáveis ​​de detecção precoce. Por conseguinte, a identificação de biomarcadores de diagnóstico e prognóstico para EOC é de grande importância clínica. Neste estudo nós investigamos a expressão de duas proteínas MCPH, microcefalina e ASPM, em amostras de tecido tumoral EOC. EOC exibe um elevado grau de aneuploidia. proteínas DNA danos resposta são uma defesa vital contra a instabilidade genômica e defeitos nestas proteínas podem levar ao câncer. Microcefalina tem um papel conhecido no reparo do DNA e ASPM para a função do fuso durante a mitose. O objetivo deste estudo foi determinar se microcefalina e expressão ASPM são associados com os parâmetros clínico em pacientes com EOC. Ambas as proteínas foram mostrados para ser desregulamentados outros tipos de câncer de uma forma que foi associado com a progressão do tumor [16], [28] -. [30], [36]

Recentemente, relatou uma associação de microcefalina e ASPM níveis em células malignas derivadas a partir de fluidos de ascites a partir de pacientes EOC com vários parâmetros clínicos-patológico [36]. No presente, o estudo escala maior, de coloração microcefalina nuclear e /ou citoplasmático foi identificado nas células tumorais. Nossos resultados no conjunto de treinamento revelou uma redução na expressão microcefalina nuclear em 73% (16/22) dos tumores EOC; esta percentagem foi reduzida para 30% (89/294) no conjunto de validação. Essa diferença entre as duas coortes potencialmente reflete o maior número de grau 3 casos no conjunto de treinamento (73%; 16/22) em comparação com o conjunto de validação (37%; 110/294). Neste estudo baixa expressão microcefalina foi identificado em tumores avançados de alta qualidade e (

p Art 0,0001 e p = 0,0438, respectivamente). Estas descobertas coincidir com o nosso estudo anterior em amostras de ascite ovarianos que indicavam que a expressão microcefalina foi reduzida em culturas de células derivadas de ascite de pacientes Edc com tumores avançados [36]. Nossos resultados são compatíveis com estudos que de informação reduzida

MCPH1

número de cópias de DNA em 72% (39/54) dos cancros da mama [16] e para os nossos próprios resultados de expressão microcefalina reduzida em 93/319 (29%) de amostras de cancro da mama, particularmente nos tumores de grau superior [28].

Anteriormente, foi identificada uma correlação entre a localização anormal de microcefalina com o grau do tumor em culturas primárias de células malignas derivadas de fluidos ascítico de pacientes com EOC . Nestas células, citoplasmática microcefalina aumentou com o grau do tumor. Sugere-se que pode ser devido a

MCPH1

mutações de deleção nos domínios BRCT C-terminal que foram mostrados anteriormente para resultar em movimento de uma microcefalina nuclear para localização citoplasmática semelhante ao

BRCA1

[41 ], [42], [43]. Um estudo recente caracterização diferente

MCPH1

variantes de processamento relatado mutação ou deleção de sinais de localização nuclear dentro do

gene MCPH1

resultou em uma mudança de localização do nuclear para citoplasmático [43].