Abstract
avanço recente na tecnologia de sequenciamento permitiu perfil abrangente de alterações genéticas em câncer. Nós estabelecemos uma plataforma de sequenciamento alvo usando a tecnologia de próxima geração seqüenciamento (NGS) para uso clínico, que pode fornecer dados de mutação e cópia número variação. NGS foi realizada com a biblioteca-end emparelhado enriquecido com exons de 183 genes relacionados com o cancro. pares de tecido normal e de tumor colo-rectal de 60 adenocarcinomas foram usadas para testar a viabilidade. mutação somática e número de cópias alteração foram analisadas. Um total de 526 variações de sequência não sinónimas somáticos foram encontradas em 113 genes. Entre estes, 278 variações de nucleotídeo único foram 232 mutações pontuais somáticas diferentes. 216 SNV foram 79 polimorfismos de nucleotídeo único conhecidas no dbSNP. 32 indels foram 28 diferentes mutações InDel. número médio de gene mutado por tumor foi 4 (variação 0-23). ganho de número de cópia ( dobra X2) foi encontrado em 65 genes em 40 pacientes, copiar enquanto perda de número ( x0.5 vezes) foi encontrado em 103 genes em 39 pacientes. Os genes mais frequentemente alterado (mutação e /ou número de cópias alteração) foram
APC
em 35 pacientes (58%),
TP53
em 34 (57%), e
KRAS
em 24 (40%). lista gene alterado revelou ErbB via de sinalização como a via mais comumente envolvidos (25 pacientes, 42%). plataforma de sequenciamento alvo usando a tecnologia NGS é viável para uso clínico e fornece dados abrangentes alteração genética
Citation:. Han S-W, Kim H-P, Shin J-Y, Jeong E-G, Lee W-C, Lee K-H, et al. (2013) Sequencing alvejado dos genes do cancro-relacionadas no câncer colorretal Usando Next-Generation Sequencing. PLoS ONE 8 (5): e64271. doi: 10.1371 /journal.pone.0064271
editor: Noam Shomron, Universidade de Tel Aviv, Israel
Recebido: 18 de fevereiro de 2013; Aceito: 10 de abril de 2013; Publicado em: 21 de maio de 2013
Direitos de autor: © 2013 Han et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma bolsa da Korean Healthcare Tecnologia R D projeto, o Ministério da Saúde, Bem-estar Assuntos da Família, República da Coreia (A091081). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Os autores desejam declarar que Jong-Yeon Shin e Kim Jong-Il são consultores para Psoma Therapeutics e Jeong-Sun Seo é um consultor para Macrogen. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
Vários eventos genéticos acumulam durante a progressão da carcinogênese colorretal [1]. Há um número de subtipos moleculares de cancro colo-rectal incluindo instabilidade microssatélite e instabilidade cromossómica [2], [3]. No entanto, os subtipos têm limitado valor preditivo ou prognóstico e não influenciam a decisão de tratamento na presença de metástases. Em contraste,
KRAS
mutação é o teste molecular mais importante e amplamente utilizado única no câncer colorretal metastático. estado mutacional de
KRAS Tablet Guides decisão de tratamento porque a presença da mutação pode prever ausência de benefícios a partir de
anticorpos -targeted EGFR
[4].
sequenciamento em larga escala analisa utilizando métodos de sequenciação convencionais forneceu paisagem genética de câncer colorretal mostrando que há um gene algumas “montanhas” mutantes em grande proporção de tumores e muitos “colinas” mutante raro [5], [6]. Além disso, a análise do número de cópias do genoma revelou que o câncer colorretal apresenta alterações numéricas menos cópia em comparação com cancro da mama [7]. avanço recente na tecnologia de sequenciação usando a próxima geração de sequenciamento (NGS) tem facilitado a análise do genoma inteiro em cânceres individuais e identificação de novas alterações genéticas [8], [9]. Em estudos de cancro colo-rectal, novas fusões genéticas recorrentes foram identificadas [10], [11]. No entanto, grande falha da abordagem sequenciamento do genoma ou exome todo é identificação de muitos incomuns possíveis “passageiros” mutações funcionalmente pouco claras, com significado clínico desconhecido. Além disso, relativamente baixa do âmbito da abordagem em larga escala tem limitação de sensibilidade e especificidade, o que é um problema importante para a aplicação na prática clínica. alterações genéticas identificadas por análise de cobertura de baixo precisa de confirmação para ser usado na tomada de decisão clínica.
sequenciamento alvejado poderia ser uma alternativa melhor para a aplicação clínica da tecnologia NGS. Vantagem de abordagem orientada é aumento da profundidade de cobertura em comparação com abordagem exome todo, reduzindo o número de genes analisados com número semelhante de pares de bases sequenciadas. Isso permite a geração de dados confiáveis com profundidade suficiente sequenciação nos genes alvo de interesse.
Nós estabelecemos uma plataforma de sequenciamento alvo usando a tecnologia NGS, que inclui 183 genes e fornece mutação e copiar dados de variação número. O objetivo deste estudo foi testar a viabilidade da plataforma de sequenciamento alvo de uma futura aplicação clínica usando tecidos de tumor colorectal.
Materiais e Métodos
Ética declaração
O protocolo de estudo foi analisado e aprovado pelo Institutional Review Board do Hospital da Universidade Nacional de Seul (SNUH). Todos os pacientes deram consentimento informado por escrito para a banca de tecido e teste genético antes da cirurgia. Este estudo foi realizado de acordo com as recomendações da Declaração de Helsinque para a investigação biomédica envolvendo seres humanos.
Estudo visão geral
Um total de 183 genes (Tabela S1) foram selecionados com critérios : conhecido para prever a resposta, terapeuticamente targetable, envolvido em importantes vias de sinalização e alta frequência de mutação no Catálogo do somáticas mutações no banco de dados do Câncer (COSMIC). tumor primário fresco congelado e amostras de tecidos normais adjacentes foram adquiridos a partir SNUH Banco de Tumores. Os espécimes foram-identificados e informações clínico-patológico foi fornecida pelo Banco de Tumores. DNA extraído do tecido foi enviado para Genome Institute Medicina da Universidade Nacional de Seul. Os resultados da sequenciação foram relatados no prazo de 3 semanas (Figura S1).
enriquecimento alvo de DNA genômico e sequenciamento
O DNA genômico foi extraído das amostras pareadas usando o QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). Três microgramas de ADN foi cortado usando um Covaris S2 (Covaris, Inc., Massachusetts, EUA) para -250 NT a um ciclo de trabalho de 20%, o nível de intensidade de 5 e 200 ciclos por explosão para 180 s. bibliotecas de sequenciação o fragmento de código de barras foram feitas utilizando um kit de ponta emparelhados preparação de amostras de ADN (Ilumina, Califórnia, EUA) e um adaptador de multiplexação Ilumina (Ilumina) de acordo com as instruções do fabricante. Após ligação com o adaptador Ilumina, as bibliotecas foram preparadas usando AMPure talão (Beckman Coulter, Inc., Califórnia, EUA) em vez de purificação em gel. qualidade Biblioteca foi avaliada usando um Agilent 2100 Analyser e DNA 1000 fichas (Agilent Tecnologia, Califórnia, EUA). Para projetar as iscas de RNA para captura, utilizamos o COSMIC (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic) e o site da Agilent Technologies eArray (https://earray.chem.agilent.com/earray /). As regiões-alvo incluiu todos os exons de 183 genes envolvidos em vários tipos de câncer e comprimento total capturados foi de -1 M. As iscas foram 120 pb de comprimento, e a cobertura média isca de cada base na região alvo foi 2X. Temos evitado regiões mascarados padrão de repetição, mas permitiu que cada isca para sobrepor-se a uma região repetitiva até 20 pb. Também identificamos sequências dentro das regiões repetitivas que eram suficientemente original para servir como iscas razoáveis. Uma piscina de oito complexo equimolar foi produzido para o enriquecimento usando um SureSelect Kit alvo Enriquecimento System (Agilent Tecnologia) e um protocolo modificado. Quinhentos nanogramas de ADN reunido com 5 ul (100 ng) de iscas personalizadas foram utilizados para o enriquecimento, com bloqueio de oligonucleotídeos específicos para as bibliotecas de sequenciamento-end emparelhado e 24 h de hibridização. Híbridos da biblioteca biotinilados foram recuperados de ARN com contas de estreptavidina. As bibliotecas capturados foram amplificados e sequenciados na Illumina Genoma Analyser IIx por 2 x 69 ciclos. Nós alinhados the-pequena sequência resultante lê o genoma de referência (montagem NCBI genoma humano construir 37) usando o Nucleotide Programa de Alinhamento (GSNAP) Programa de Genômica de curto ler alinhamento [12], com provisão para 5% incompatibilidades após a contabilização de duplicatas PCR e lê que não alinhar a regiões do genoma capturados referência. Os dados de sequenciação são enviados para a EBI Europeia Nucleotide Archive (https://www.ebi.ac.uk/ena/home) sob o número de acesso ERP002442.
variante de nucleotídeo único (SNV) e detecção INDEL
Chamamos variantes genômicas de cada amostra (SNVS e indels curtas), utilizando critérios modificados de nossas publicações anteriores no sequenciamento de genoma completo [13], [14]. Resumidamente, SNVS e indels foram definidos com base na satisfação das seguintes três condições: (1) o número de mapeados exclusivamente lê na posição deve ser de duas ou mais; (2) a qualidade da base média (
Phred
pontuação Q) para a posição deve ser de 20; e (3) a frequência de leitura de alelo na posição deve ser de 20%. Para a detecção das mutações somáticas (SNVS e indels) nos tecidos de cancro, foram utilizadas as seguintes condições: (1) SNVS nonsynonymous indels ou nos tecidos de cancro; (2) a contagem de SNV alelo deve ser zero na sequência alvo de tecido normal; (3) A contagem de alelo de tipo selvagem deve ser de 10 ou mais na sequência alvo de tecido normal; e (4) as posições de candidatos não deve ser polimorfismos de acordo com a dbSNP132. As consequências funcionais das novas variantes missense foram preditos usando Classificando intolerante de Tolerant (SIFT) [15]. Mutação no
KRAS
foi confirmada utilizando sequenciamento Sanger. Foram utilizados os iniciadores seguintes: codon12 e 13, directo 5′-CGTCTGCAGTCAACTGGAAT-3 ‘e inverso 5′-GAGAGTGAACATCATGGACC-3′; codão 61, directo 5’-CAGACTGTGTTCTCCCTTCTCA-3 ‘e inverso 5′-CTCATGTACTGGTCCCTCATTG-3′; e códon 146, em frente 5’-TGGACAGGTTTTGAAAGATATTTG-3 ‘e reverso 5′-ATTAAGAAGCAATGCCCTCTCAAG-3’. Todas as reacções de sequenciação foram realizadas em ambas as direções para a frente e ré, e todas as mutações foram confirmadas pelo menos duas vezes a partir de PCR independentes isolados.
Copiar número alteração
Nós estimamos a cobertura dos genes utilizando sequenciamento lê mapeada para as regiões alvo. Para detectar cópia número de alteração para um determinado par de câncer e tecidos normais, os rácios de cobertura das pregas foram calculados (tumor /normal) por 183 genes alvo. Após a etapa de normalização considerando bases totais lidos obtidas a partir de cada tecido, índice de cobertura de dobra foi ajustado pela pureza de células de tumor estimado descrito abaixo. Definimos que uma mostra de gene de cópia ganho de número quando o seu rácio de cobertura dobra ≥2.0 e perda quando ≤0.5.
contagens Para estimar a pureza do tumor, usamos leitura do SNVS somáticas identificadas. Dado SNVS somáticos para cada tecido de cancro, assumiu-se que o cancro é composto por um grande clone e as SNVS são derivados a partir do clone. Além disso, nós considerado SNVS como heterozigotos cuja freqüência do alelo é de 0,5. Com estes pressupostos, pureza tumor foi estimado como se segue. Os números esperados de tipo selvagem lê originado a partir do clone do cancro e células normais foram calculados. Então, a proporção de tipo selvagem mais SNP ler as contagens para o cancro entre o número total de contagens de leitura foi considerada como a pureza tumoral correspondente. Em 3 amostras que tinham nenhum tumor SNV específico, o valor da mediana de 57 amostras foi usada na análise das variações no número de cópias.
número de cópia alteração quantitativa foi confirmada utilizando PCR em tempo real com o sistema de detecção iCycler QI ( bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) utilizando SYBR green I (Molecular Probe, Eugene, OR) em reacções em triplicado. Os iniciadores utilizados na reacção de PCR foram como se segue:
ERBB2
, directo 5′-TGCTGGAGGACGATGACATG-3 ‘e inverso 5′-CTGGACAGAAGAAGCCCTGC-3’;
SRC
, frente 5’CGGTTACTGCTCAATGCAGA-3 ‘e reverso 5′-CAAGAGCGCTCGTACCTTTC-3’;
TP53
, frente 5′-CCCTTCCCAGAAAACCTACC-3 ‘e reverso 5′- ACTGACCGTGCAAGTCACAG-3’;
PTEN
, frente 5’TGGCACTGTTGTTTCACAAG-3 ‘e reverso 5′- TGTTCCAATACATGGAAGGATG-3’;
BRCA1
, frente 5’GTTTGCCAGAAAACACCACA-3 ‘e reverso 5′-TTTATGCAGCAGATGCAAGG -3’;
BRCA2
, frente 5′-TGCCTGGCCTGATACAATTA-3 ‘e reverso 5′- TTGCTGCTTCCTTTTCTTCC-3’; e
ACTB
, frente 5’AGAGCTACGAGCTGCCTGAC e reverso 5′- GGATGCCACAGGACTCCA-3 ‘. Fluorescência
hibridização in situ
(FISH) análise do
ERBB2
/CEP17 foi realizada utilizando o kit PathVysion (Vysis, Downers Grove, IL) de acordo com as instruções do fabricante.
estatuto de microssatélites
O status de microssatélites de cada tumor foi determinada pelo exame 5 marcadores microssatélites (D2S123, D5S346, D17S250, BAT25 e BAT26) como descrito anteriormente [16]. De qualquer iniciador para a frente ou para trás, para cada marcador foi marcada com fluorescência, e os produtos de PCR foram submetidos a electroforese e analisadas. Classificamos estatuto MSI como segue:. MSI-alta, a instabilidade em dois ou mais marcadores microssatélites, MSI-baixo, instabilidade em um marcador, e MSS, nenhum marcador instabilidade
análise Pathway
Pathway análise foi realizada para os genes que têm a mutação ou número de cópias alteração em cada tumor, utilizando banco de dados para anotação, visualização e integrado Descoberta de Recursos (DAVID) Bioinformática versão 6.7 utilizando a via bases de dados BBID, Biocarta, e Enciclopédia Kyoto de genes e genomas (KEGG) [17 ]. gráfico de anotação funcional em DAVID foi criada usando o genoma humano como pano de fundo e limiares de contagem de 2 e pontuação EASE como 0,1.
Resultados
As características dos pacientes e perfil sequenciamento
as características dos pacientes são como descrito na Tabela 1. foram usadas amostras pareadas de tumor colorretal primário e mucosa normal adjacente removido durante a operação para análise.
a cobertura média das 120 amostras analisadas was175X (intervalo 99X-435X) (Tabela S2). Foi 181X (100X-435X) para o tumor e 170X (99X-312x) para mucosa normal. a percentagem de células de tumor na amostra de tumor pode ser avaliado usando SNVS específicas do tumor em 57 amostras. O percentual médio foi de 71% (intervalo 42-100).
Mutações
Um total de 532 variações nonsynonymous somáticas em 113 genes foram encontrados (Figura 1). 494 variações de nucleotídeo único foram observadas em 106 genes de 60 pacientes e 38 mutações InDel (11 inserções e 27 deleções) em 19 genes de 21 pacientes (Tabela S3)
SNV, a variação de nucleotídeo único.; SNP, single nucleotide polymorphism; NMD, non-sense decadência mediada.
Entre os 494 SNVS, 278 variações foram 232 diferentes mutações pontuais (67 mutações previamente relatados e 166 novas mutações) e 216 foram relatados anteriormente 79 diferentes polimorfismos na dbSNP .
ponto mutações composta de 43 mutações nonsense e 189 mutações missense. Encontrámos 2 novas mutações recorrentes,
JAK1
c.1595C T (p.R532H) em 2 pacientes e
EWSR1
c.1769A C (p.Q590P) em 2. As mutações pontuais foram mais frequentemente observada em
APC
(32 mutações em 29 pacientes), seguido de
TP53
(27 em 27),
KRAS
(24 em 24),
TTN
(36 em 21), e
FBXW7
(15 em 14) (Tabela 2).
As 32 mutações InDel foram 3 mutações conhecidas e 25 novas mutações , que foram 2 deleções simples de um aminoácido, 26 mutações frameshift. Entre as mutações frameshift, 14 estão previstos para resultar em mediada por nonsense deterioração. 3 novas mutações InDel foram recorrentemente observou:
ACVR2A
c.1303delA (p.K435fs) em 3,
TGFBR2
c.449_450delAA (p.E150fs) em 2 e
BLM
c.1536delA (p.G512fs) em 2.
números medianos de mutação e gene mutado por tumor foram de 4,5 (intervalo 0-32) e 4,0 (0-23), respectivamente. genes mais comumente mutados foram
APC
(35 pacientes),
TP53
(27), e
KRAS
(24). Foi realizada seqüenciamento Sanger para validação de
KRAS
mutação e todas as mutações identificadas pelo NGS foi confirmada.
número de cópias alterações
Copiar número mudança foi observada em 132 genes e 51 tumores (85%) (Figura 2 e Tabela S4). ganho de número de cópia ( dobra X2) foi encontrado em 65 genes a partir de 40 tumores e copiar perda de número ( x0.5 vezes) em 103 genes de 39 tumores. Dentre os tumores que mostram cópia alteração do número, número médio de genes envolvidos foi de 6 (intervalo 1-44). Genes mais frequentemente mostrando ganho de número de cópias foram
SRC
(15 pacientes),
MAFB
(15),
TOP1
(14),
RecQL4
( 13), e
GNAS
(13). Exceto para
RecQL4
localizado no cromossomo 8q24, os outros 4 genes foram localizados na 20q 11-13. Genes mostrando a perda frequentes foram
TP53
(13 pacientes),
Smad2
(12),
SMAD4
(12),
MAP2K4
(11),
BCL2
(11),
WRN
(10), e
DCC
(10).
TP53
e
MAP2K4
foram localizados na 17p12-13, enquanto que
Smad2
,
SMAD4
,
BCL2
, e
DCC
foram localizados na 18q21, e
WRN
localizado na 8p12. RT-PCR quantitativo foi usado para validação de número de cópias alteração do
SRC
,
ERBB2
,
TP53
,
PTEN
e
BRCA2
em amostras representativas e apresentaram valores comparáveis.
ERBB2
foi ainda validado utilizando FISH (Figura 3).
As amostras são alinhados de acordo com a amostra número de identificação no eixo Y e os genes são alinhados de acordo com a localização cromossómica do eixo-X.
* Os valores são proporções dobra cobertura não ajustados para a pureza tumor. Imagem representativa da análise FISH de
ERBB2
(vermelho) e CEP17 (verde) mostrando amplificação do
ERBB2
.
Combinados alterações genéticas
combinando mutação e copiar dados de números,
APC
foi o gene alteração genética mais freqüente (35 pacientes). Três pacientes tiveram perda de número de cópias de
APC
, mas os 3 tumores também tinham mutações InDel. Em caso de
TP53
, 6 pacientes concomitantemente tinha mutação pontual e copiar perda de número e 7 pacientes apresentaram cópia perda número como o único mecanismo genético de
TP53
inativação. Não houve alteração do número de cópias no
KRAS
. No entanto, copiar o ganho número de
HRAS
foi encontrado em 6 pacientes.
tumores MSI-H tendem a ter maior número de genes com mutação em comparação com MSS /MSI-L (média de 10,8
vs
3,9, respectivamente;
p
= 0,11 pelo teste t) e menor número de genes que têm número de cópias alteração (média de 3,2
vs
8,6, respectivamente;.
P
= 0,22 pelo teste t). tumores MSI-H teve maiores freqüências de alterações genéticas em
ACVR2A
(1,9% em MSS /MSI-L
vs.
50,0% no MSI-H,
p
= 0,002),
MLH1
(3,7%
vs.
33,3%,
p
= 0,046),
MSH6
(1,9%
vs.
33,3%,
p
= 0,024),
SPTAN1
(0%
vs.
33,3%,
p
= 0,008), e
TGFBR2
(1,9%
vs.
33,3%,
p
= 0,024). Em contraste, as alterações genéticas do
TP53
(63,0%
vs.
0%,
p
= 0,005) foram mais freqüentemente observadas em tumores MSS /MSI-L.
Poderíamos também identificar alterações genéticas que poderiam ter potenciais implicações terapêuticas (Tabela 3).
ERBB2
copiar ganho número foi identificada em 4 pacientes (intervalo X2.0-X71.5) e
ERBB2
ponto de mutação em 5 pacientes (1 paciente teve cópia ganho número e mutação pontual). alterações genéticas em
BRCA1
e
BRCA2
foram observadas em 4 pacientes:
BRCA1
perda (X0.49),
BRCA1 mutação
ponto,
BRCA2
perda (X0), e
BRCA2
mutação de deleção em 1 paciente cada.
EGFR
copiar ganho número foi encontrado em 4 pacientes (intervalo X2.0-8.2).
PIK3CA
ponto de mutação foi observada em 4 pacientes e
PTEN
perda e ponto de mutação em 4 pacientes (intervalo X0-X0.49) e 1 paciente, respectivamente.
pathway análise
Um total de 33 pacientes (55%) tiveram possível alteração de ganho de função no
RAS
/
RAF
percurso: 20 pacientes com
KRAS
somente, 3 com mutação
KRAS
mutação e ganho de
HRAS
, 1 com
KRAS
mutação e
BRAF
mutação, 3 com
ARN
mutação, 2 com
HRAS
ganho, 2 com
BRAF
mutação, 1 com
BRAF
mutação e
HRAS
ganho, e 1 com
RAF1
.
lista de genes alterados (mutação e copiar número mudança) usando DAVID ferramentas de anotação funcional Analisando, caminho relacionado foi identificada em 53 pacientes (Tabela S5) . número médio de percurso por paciente foi de 19 (intervalo 3-70). Excluindo as vias relacionadas com a doença (por exemplo, câncer colorretal), ErbB via de sinalização (KEGG hsa04012) era a via mais acometidos (25 pacientes, 42%).
Discussão
Na próxima era da medicina personalizada para tratamento de câncer, é essencial ter informação genética exata do câncer individual. Número de informação genética já guia decisões do tratamento na prática diária. Exemplos no tratamento de tumores sólidos incluem
ERBB2
(HER2) amplificação do gene na mama e câncer gástrico,
mutação no cancro do pulmão de não pequenas células EGFR e
KRAS
mutação em cancro colorrectal [18], [19], [20], [21]. tratamento personalizado do câncer é perseguido desde a fase inicial de desenvolvimento de drogas quando há um alvo conhecido [22]. No entanto, muitos dos agentes direcionados em desenvolvimento não têm um biomarcador preditivo genético. informação completa do estado genético de pacientes inscritos em ensaios clínicos de fase precoce e análises de associação com a resposta pode acelerar a identificação do paciente alvo.
Nós estabelecemos uma plataforma de sequenciamento alvo usando a tecnologia NGS para fornecer informação genética abrangente para pacientes individuais. No presente estudo, mostramos que a plataforma de sequenciamento alvo baseada em NGS é viável para uso clínico. Mesmo que nós não confirmar cada alteração genética identificada, experiência de validação de
KRAS
mutação e alterações no número de cópias representante (Figura 3) mostra que os resultados da plataforma é confiável. Além disso, o perfil de genes e padrão de gene número de cópias alteração comumente mutados (ganhos de 8q e 20q e perdas de 8p, 17p e 18q) são consistentes com o conhecimento prévio de alterações genéticas no cancro colorectal [23].
a principal vantagem da plataforma de sequenciamento alvo baseada em NGS é que os dados sobre genes múltiplos e múltiplas alterações genéticas (mutação pontual, mutação INDEL, e copiar o número de alteração) é gerado com um único experimento. A plataforma de sequenciamento de fornecimento de dados de mutação e número de cópias alteração requer menos quantidade de DNA ou tecido e custo em comparação com o teste alteração genética individual por sequenciamento ou de peixes que são comumente usados na prática diária atual. Além disso, a sensibilidade superior em relação seqüenciamento Sanger podem ser obtidas pelo aumento da profundidade de cobertura, principalmente nos casos com baixa pureza tumor.
Além de
KRAS
mutação, mutação de outros genes na via (
BRAF
,
ARN
, e
PIK3CA) também tem efeito negativo sobre a resposta ao cetuximab [24]. É provável que a análise de múltiplos genes na via também pode melhorar a previsão de resposta em outros tratamentos segmentados. plataforma sequenciação alvejado é uma opção ideal para avaliar múltiplos genes ao mesmo tempo. Além de
KRAS
mutação, alterações genéticas em
ARN
,
HRAS
,
BRAF
, e
RAF1
foram encontrados em amostras de cancro colorrectal analisados neste estudo.
Encontrar a alteração genética rara pode oferecer uma nova opção de tratamento para o paciente individual. Por exemplo, pacientes com tumores ter
ERBB2
copiar ganho número pode beneficiar de
ERBB2
-targeted agentes e tumores com mutação ou perda de
BRCA1
ou
BRCA2
de inibidores de PARP. Além disso, alterações genéticas ou via envolvida pode orientar a selecção do ensaio clínico fase inicial para pacientes que estejam inscritos. Pacientes com alteração de
RAS /RAF
via pode ter mais chance de benefício por participar de um ensaio clínico de inibidores da segmentação da via.
A fim de detectar mutações múltiplas com maior sensibilidade, espectrometria de massa plataforma de descoberta de mutação baseado está atualmente em uso [25]. No entanto, o número de mutações apenas limitado pré-determinado pode ser detectado e número de cópias alteração não pode ser detectada com a plataforma. Portanto, a plataforma alvo sequenciação utilizando NGS é superior em termos de a informação genética produzido e flexibilidade de constituir conjuntos de genes para análise. Estudos recentes também demonstraram utilidade da abordagem sequenciamento alvo ou NGS na prática clínica [9], [26], [27].
principal limitação do presente estudo é que a plataforma é incapaz de detectar genes de fusão e apenas tecido fresco congelado foi utilizado para a análise. Detecção de genes de fusão pode ser ativado por adição de baixo seqüenciamento RNA cobertura. Nós modificamos procedimento experimental para utilizar tecido embebido em parafina fixado em formalina (FFPE) e obtiveram sensibilidade comparáveis. Estamos actualmente a estudar a utilidade da plataforma de sequenciamento alvo de forma prospectiva na prática clínica. O estudo utiliza um ou outro tecido fresco ou FFPE e temos modificado lista gene para melhor representar as vias druggable e aumento da profundidade de cobertura ( X500).
Em conclusão, a plataforma de sequenciamento alvo usando a tecnologia NGS foi capaz de fornecer abrangente genética dados de alteração em amostras de tumores colorretais e pode ser usado em ambiente clínico.
Informações de Apoio
Figura S1. .
Estudo esboço
doi: 10.1371 /journal.pone.0064271.s001
(TIF)
Tabela S1.
Gene lista
doi:. 10.1371 /journal.pone.0064271.s002
(XLSX)
Tabela S2. . Informação
Cobertura
doi: 10.1371 /journal.pone.0064271.s003
(XLSX)
Tabela S3.
alterações genéticas por pacientes
doi:. 10.1371 /journal.pone.0064271.s004
(XLSX)
Tabela S4.
Copiar número alteração
doi:. 10.1371 /journal.pone.0064271.s005
(XLSX)
Tabela S5. vias
David
doi: 10.1371. /journal.pone.0064271.s006
(XLSX)