Abstract
O câncer gástrico (GC) é uma das neoplasias mais comuns em todo o mundo. Emergindo a evidência mostrou que a expressão aberrante de microRNAs (miRNAs) desempenha um papel importante na progressão do câncer. No entanto, pouco se sabe sobre o papel potencial do miR-217 em GC. Neste estudo, foram investigados o papel de miR-217 sobre a proliferação celular e a invasão de GC. A expressão de miR-217 foi regulada em células e tecidos GC GC humanos. expressão forçada de miR-217 células de GC inibiu a proliferação e invasão. Além disso, glipicano-5 (GPC5), um novo ocncogene, foi identificada como o alvo potencial de miR-217. Além disso, a sobre-expressão de miR-217 induzida por promoção GPC5 auditivos de proliferação e invasão em células de GC. Em conclusão, estes resultados revelaram que o miR-217 funciona como um supressor de tumor, inibindo a proliferação e invasão de células por GC GPC5 segmentação, o que pode, consequentemente, servir como um alvo terapêutico para pacientes GC
citação:. H Wang , Dong X, Gu X, Qin R, Jia H, Gao J (2015) microRNA-217 Funciona como um supressor de tumor potencial em Câncer gástrico por Segmentação GPC5. PLoS ONE 10 (6): e0125474. doi: 10.1371 /journal.pone.0125474
editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, CHINA
Recebido: 10 de outubro de 2014; Aceito: 24 de março de 2015; Publicação: 22 de junho de 2015
Direitos de autor: © 2015 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer gástrico (CG) é o quarto neoplasias humanas mais comuns e a segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, com cerca de um milhão de novos casos por ano [1-4]. Apesar dos recentes avanços no método de diagnóstico, técnica cirúrgica e novos regimes de quimioterapia, a taxa de sobrevivência a longo prazo para a GC é ainda bastante baixa [5, 6]. Em muitos pacientes, GC é diagnosticado em estágio avançado com extensa invasão e metástase linfática. estratégias terapêuticas bem sucedidas são limitados e a mortalidade é elevada [7]. Portanto, é urgente para investigar os mecanismos moleculares fundamentais subjacentes à resistência aos medicamentos, a heterogeneidade histológica, e desenvolvimento de metástase para identificar novos marcadores para o diagnóstico e tratamento de GC.
Os microRNAs (miRNAs) são pequenas, cerca de 22 -nucleotide, RNAs que funcionam como reguladores negativos de genes codificadores de proteínas ao nível pós-transcricional de não codificação [8, 9]. Ao ligar-se às sequências complementares nas regiões 3 ‘não traduzida (3’-UTR) de seus mRNAs alvo, miARNs podem induzir degradação do mRNA directa ou inibição da translação [10-13]. Evidências crescentes indicou que miARNs estão envolvidos em muitos processos biológicos importantes, incluindo a proliferação celular, diferenciação, apoptose, angiogénese e resposta imune. Desregulamentação dos miRNAs pode conduzir a expressão do gene aberrante em várias doenças, incluindo câncer gástrico [14-16]. No entanto, a compreensão do papel e da função de miARN no GC ainda está na fase inicial. Da mesma forma, os papéis de muitos outros miRNAs expressos de maneira aberrante no desenvolvimento GC ainda são desconhecidos.
regulação negativa do miR-217 é um evento frequente em vários cancros, sugerindo o seu importante papel na tumorigênese [17-19]. No entanto, pouco se sabe sobre o papel potencial do miR-217 em GC. Neste estudo, a expressão do miR-217 foi diminuída em linhas celulares e tecidos de GC. Além disso, a menor expressão de miR-217was associada a fase pTNM. A sobre-expressão de miR-217 suprimiram a invasão de células e proliferação de GC. Além disso, o ensaio de repórter de luciferase e western blot confirmou que a função miR-217might como um supressor de tumor no GC por targetingGlypican-5 (GPC5).
Materiais e Métodos
Declaração de Ética
Todos os pacientes concordaram em participar do estudo e deram consentimento informado por escrito. Este estudo e consentimento foi aprovado pelo conselho de ética do Instituto das Affiliated YanAn Hospital da Universidade Médica Kunming e cumpriu com a Declaração de Helsinki.
As amostras de tecido
As amostras de tecidos humanos GC e emparelhado tecidos gástricos não-tumorais Adjacente que estavam mais longe do que 5 cm a partir dos tumores foram obtidos de 50 pacientes submetidos à ressecção cirurgia no The Affiliated YanAn Hospital da Universidade médica Kunming. Amostras frescas foram congeladas de azoto inliquid pressão imediatamente após a ressecção e armazenado a -80 ° C. Todas as amostras foram obtidas com consentimento informado dos pacientes e foram histologicamente confirmado por coloração com hematoxilina-eosina. O grau histológico de cancros foi avaliada de acordo com critérios estabelecidos pela Organização Mundial de Saúde. Nenhum dos pacientes receberam radioterapia ou quimioterapia antes da cirurgia. As características dos pacientes estão descritas na Tabela S1.
linhas de células e cultura de células
gástricas linhas de células cancerosas humanas SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 e normal gástrica linha de células epiteliais GES-1 (como controlo) foram adquiridos a partir do Instituto de Bioquímica e Biologia celular da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 foram propagadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e GES-1 foi propagada em meio de Eagle modificado de Dulbecco (Invitrogen). Todos os meios foram suplementados With10% de soro fetal bovino. As linhas celulares foram cultivadas a 37 ° C numa incubadora humidificada de 5% de CO2.
extracção de ARN e qRT-PCR
O ARN total foi extraído a partir de amostras congeladas (ou células) utilizando Trizol ( Invitrogen) seguindo o manual do fabricante. 1 mL de ARN foi utilizado para medir a expressão de miR-217 por RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) com os TaqMan miARN kit de transcrição reversa andtheTaqMan miARN iniciadores de RT-specific ensaio para miR-217 de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA). A expressão de U6 foi usado como controlo interno. PCR em tempo real foi realizada com 1 mL de cada ADNc de um Primeiro Passo Mais Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA), em duplicado. A expressão de miR-217 foi definida com base no ciclo limiar (Ct), e os níveis de expressão relativos foram calculados as22
– [(Ct de miR-217) – (Ct de U6)] após normalização com referência à expressão de U6 ARN nuclear pequeno [20, 21] (S2 Tabela).
Western blot
a proteína total foi extraído a partir de amostras congeladas (ou células) utilizando um kit de extracção total de proteína (KeyGen, Nanjing , China) de acordo com as instruções do fabricante. Medição da concentração de proteína foi realizada utilizando um Kit BCA Protein Assay (KeyGen). A análise por Western blot foi realizada tal como anteriormente descrito [22]. Os anticorpos primários utilizados para a transferência de western foram policlonal de coelho anti-GPC5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), anticorpo monoclonal anti-GAPDH (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA).
celular transfecção
O miR-217 mímico, controle de mímica (corrida), miR-217 inibidor, controlo de inibidor, Pez-GPC5 e controle de vetores foram adquiridos de RiboBio (Guangzhou, China). As células HGC-27 foram semeadas em placas de seis poços a 30% de confluência, um dia antes da transfecção. Lipofectamine2000 (Invitrogen) foi utilizado para transfecção do plasmídeo isolados ou em conjunto com os oligonucleótidos de ARN.
Os ensaios de luciferase
células de 8 × 10
3 foram plaqueadas em placas de 96 poços. Após 24 hincubation, uma mistura de 100 ng pLUC-3′-UTR, controlo negativo de 5 pmol, o miR-217mimic foi co-transfectadas com 20 ng de Renilla em células utilizando Lipofectamine 2000. Vinte e quatro hoursafter transfecção, as actividades da luciferase pirilampo e Renilla foram medido com um sistema Repórter dual-luciferase (Promega, Madison, WI, EUA). A eficiência de transfecção foi normalizada por co-transfecção com um vector repórter de Renilla.
proliferação celular
As células (3000 /poço) foram recolhidas e semeadas em placas de 96 wellplates e incubadas a 37 ° C após a transfecção. Após incubação durante 1 a 5 dias, a adicionou-se a media de cada poço 10% celular Contagem Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japão), e as placas foram ainda incubadas durante mais 3 horas a 37 ° C. Em seguida, o meio foi substituído com 150 mL de sulfóxido de dimetilo (DMSO, Sigma-Aldrich), e a absorvância foi medida a 450 nm utilizando um leitor de microplacas (Sunrise). O ensaio foi repetido 3 vezes, com seis repetições.
Northern blot
O ARN total foi isolado a partir de cada tecido utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen Life Technologies) e Northern blotting foi realizado como descrito anterior [23] . Após a hibridação perfeita Hyb Além disso, a 68 ° C, as membranas foram desenvolvidas e analisadas. As transferências de Northern hibridizaram com um RNA 18S ribossomal (rRNA) cDNA foram utilizados como controle.
invasão celular
ensaios de invasão foram realizadas em triplicata utilizando Transwell câmaras invasão revestidas com Matrigel (BD, EUA) como descrito no protocolo do fabricante. As células foram transfectadas withmiR-217 imita, inibidor ou oligonucleótido de controlo negativo, cultivadas durante 48 h, e transferida no topo das câmaras de invasão de Matrigel-revestidas num meio DMEM isento de soro (1 × 10
5 células por Transwell). DMEM contendo soro de vitelo fetal a 10% foi adicionado para as câmaras inferiores. Após incubação durante 24 h, as células que permaneceram na parte superior do filtro foram esfregadas fora e as células que migraram para a superfície inferior foram fixadas in90% e álcool, seguido por coloração com violeta de cristal.
Histologia
o diagnóstico histológico foi de acordo com o triplo local método de biópsia gástrica. Os tecidos foram fixados durante a noite em formalina tamponada, embebidos em parafina, cortados em espessura de 3 mm, e corados com hematoxilina-eosina (H E). Coloração
A análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas usando o pacote de software SPSS 17.0 estatística. As experiências foram repetidas de forma independente, pelo menos, três vezes, e os dados apresentados como médias ± DP. A associação entre o miR-217 e GPC5 foi analisada por meio do teste de correlação de Spearman. As comparações entre os grupos para significância estatística foram conduzidas com pareado dois t-teste cauda ou One-way ANOVA. P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultado
A expressão de miR-217 é regulada negativamente em linhas celulares GC
Temos primeiro quantificado o nível de expressão de miR-217 em quatro linhas humanos GC celulares (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) e GES-1 utilizando northern blot (Fig 1A). O nível de expressão de miR-217 wasdecreased em linhas celulares de GC em comparação com GES-1. QuantitativeRT-PCR também mostrou que a expressão de miR-217 foi diminuída em linhas celulares de GC (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) em comparação com GES-1, uma linha celular epitelial gástrica normal (Fig 1B ).
(A) O nível de expressão de miR-217 em quatro linhas de células GC humanos (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) e GES-1 foi quantificada utilizando Northern blot . (B) A expressão de miR-217 foi avaliar em linhas de células GC (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) andGES-1Usando RT-PCR quantitativo.
miR-217 é regulada negativamente em tecidos GC
RT-PCR quantitativo foi usado para examinar miR-217 expressão em 50 tecidos GC e seus pares tecidos não cancerosos adjacentes. As características histológicas representativas de GC e os seus tecidos emparelhados não cancerosas adjacentes foram mostrados na Fig 2A. Entre 50 tecidos tumorais, 44 casos apresentaram diminuição da expressão de miR-217 em comparação com os tecidos adjacentes normais (88%, 44 a 50, Fig 2B). A expressão de miR-217 foi inferior em tecidos de GC do que em tecidos cancerosos adjacentes (Fig 2C). . Além disso, os níveis mais baixos de expressão de miR-217 associado com o estágio de pacientes pTNM GC (Fig 2D)
(A) Os tecidos foram histologicamente confirmada utilizando H E de coloração. (Ampliação original, x 100). (B) o miR-217 foi detectado em 50 pacientes por GC-PCR em tempo real. Os dados são apresentados como o log 2 N /T de mudança de dobragem de tecidos GC em relação ao não-tumorais tecidos adjacentes. (C) A expressão do miR-217 em comparação com tecidos GC tecidos normais. A expressão de miR-217 foi normalizada para U6 snRNA. (D) A análise estatística da associação entre nível de miARN e fase pTNM (I, II, III e IV). * P 0,05, e ** p 0,01, *** p 0,001. One-way ANOVA foi realizada para análise.
miR-217 inibe a proliferação celular GC e invasão
A expressão de miR-217was aumentou em células HGC-27 transfectadas usando miR-217 imita (Fig 3A) e diminuiu usando o miR-217 inibidor (Fig 3B). A proliferação foi reduzida nas células HGC-27 transfectadas withmiR-217 imita em comparação com células transfectadas com precipitação ou não tratados (Fig 3C). Enquanto isso, a proliferação foi aumentada em HGC-27 células transfectadas withmiR-217inhibitor em comparação com células transfectadas com o controlo não tratado ou (Figura 3D). A capacidade de invasão das células transfectadas com miR-217 imita foi diminuiu em comparação com o grupo de corrida ou de células do grupo controle e miR-217 inibidor aumentou a invasão de células em comparação com o grupo de corrida ou de controle de células de grupo (Fig 3E).
( a) análise em tempo real de RT-PCR de miR-217 em células HGC-27 por transfecção ofmiR-217 mímico. A expressão de miR-217 em HGC 27 células transfectadas com miR-217 foi imita-se-regulated.U6 snRNA foi usado como controlo interno. (B) A expressão de miR-217 em HGC 27 células transfectadas com miR-217inhibitor era baixo-regulated.U6 snRNA foi usado como controlo interno. proliferação celular significativamente inibida expressão (C) ectópica de miR-217, como demonstrado pelo ensaio de CCK8. (D) Inibição de miR-217 de expressão promovida de forma significativa a proliferação de células, como demonstrado pelo ensaio de CCK8. (E) Análise de Invasão de HGC-27cells após o tratamento withmiR-217 imita, inibidores ou corrida ou controle; a proporção relativa de células invasivas por campo é mostrado a seguir, * p 0,05, ** p 0,01, *** p e. 0,001
miR-217 reduz a expressão pós-transcricional GPC5 por direccionamento directamente seus 3’UTR
análise utilizando algoritmos disponíveis indicaram que GPC5 era um gene alvo teórico de miR-217 (Fig 4A) [24]. Para provar que miR-217 alvejado diretamente o GPC53’UTR, foram realizados ensaios de gene repórter de luciferase. Ectópica de miR-217 reduziu a actividade de luciferase no gene repórter de tipo selvagem mas não o GPC5 mutante GPC5 3’UTR, indicando que o miR-217 orientada directamente a GPC5 3’UTR (Fig 4B). O nível de ARNm de GPC5 foi diminuída após a transfecção com o miR-217 imita e aumentou após a transfecção com o miR-217 inibidor utilizando qRT-PCR (Figura 4C). Consistente com este resultado, a capacidade de miR-217 para regular a expressão da proteína GPC5 foi verificada por Western blotting (Figura 4D).
(A), a 3′-UTR do mRNA GPC5 contém as sequências de ligação
de miR-217. (B) actividade de luciferase relativa do GPC5reporter indicado construir em HGC-27cells é mostrado. Os valores da luciferase do pirilampo foram normalizados para a actividade da luciferase de Renilla e representada graficamente como a actividade de luciferase relativa. (C) o miR-217 reduziu significativamente a sobre-expressão dos níveis de ARNm em células GPC5 HGC-27 e miR-217 inibidor aumentou significativamente os níveis de mRNA GPC5 nas células HGC-27. (D) Western blotting foi realizado para examinar os efeitos de miR-217 sobre a expressão de GPC5. GAPDH foi também detectada como um controle de carga.
Restauração de miR-217 inibe a proliferação celular GC mediada por GPC5 e invasão
A superexpressão de GPC5 promoveu a proliferação de células GC e invasão. Quando miR-217 mímico e Pez-GPC5 foram co-transfectados HGC-27 células, miR-217 expressão reduziu a proliferação celular induzida por GC GPC5 e invasão (Fig 5A e 5C). A inibição da GPC5 reduziu a proliferação celular e a invasão de GC. Quando o miR-217 inibidor e shGPC5 foram co-transfectados em HGC-27, células de miR-217 inibidor promoveu a proliferação de células-shGPC5 inibida e invasão (Figura 5B e 5D).
O crescimento das células (A) em HGC- 27co-transfectadas com miR-217 mímica ou 2,0 ug Pez-GPC5 ou pCDNA vazio vector utilizando o ensaio CCK-8 proliferação. (B) O crescimento de células em HGC-27co-transfectadas com miR-217 inibidor ou 2,0 ug shGPC5 (pancadas baixo GPC5) ou pCDNA vector vazio usando ensaio de proliferação de CCK-8. (C) A célula invasora em HGC-27co-transfectadas com miR-217 mímico ou 2,0 ug Pez-GPC5 ou pCDNA vector vazio usando ensaio de invasão. (D) A célula invasora em HGC-27co-transfectadas com miR-217inhibitor ou 2,0 ug shGPC5 ou pCDNA vector vazio usando ensaio de invasão. * P 0,05, ** p 0,01 e *** p . 0.001
GPC5 é regulada em linhas de células de GC e espécimes
A expressão de GPC5 foi maior em linhas celulares de GC (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) em comparação com GES-1, uma linha normal da célula epitelial gástrica (Fig 6A). Os níveis de proteína de GPC5 também foram mais elevados em tecidos de GC do que em tecidos cancerosos adjacentes utilizando Western blot (Fig 6B).
(A) A expressão de ARNm de CPG5 foi avaliar em linhas celulares de GC (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) e GES-1 utilizando RT-PCR quantitativo. (B) O nível de proteína de CPG5 em oito tecidos GC humanos e seus controles normais adjacentes foi quantificada utilizando western blot.
Discussão
GC faz com que quase um milhão de mortes no mundo por ano [ ,,,0],25]. Recentemente, evidências acumuladas sugerem que miARNs desempenhar um papel crucial na patogénese da GC através de regulação da proliferação celular, apoptose, migração, anúncios invasão [26-28]. Neste estudo, miR-217 foi frequentemente reprimidos em linhas celulares de GC e tecidos humanos e do menor nível de miR-217 foi associado com estágio pTNM de GC. Mais experiências indicaram que a sobre-expressão de miR-217 pode suprimir a migração celular e invasão de GC. GPC5 foi identificada como um alvo directo e funcional de miR-217. Concluímos que o miR-217 parece ser um novo supressor de tumor no GC e que regulada negativamente o miR-217 pode contribuir para o desenvolvimento e progressão do tumor em pacientes GC. Regulação baixa de miR-217 é um evento frequente em vários cancros, sugerindo o seu importante papel na tumorigênese [17-19]. Li e seus colegas mostraram que miR-217 foi regulada para baixo no carcinoma de células renais de células claras (ccRCC) em comparação com o tecido normal emparelhado [29]. Menor nível de expressão de miR-217 foi associado com maior grau do tumor e estágio. Neste estudo, miR-217 foi frequentemente reprimidos no GC. Curiosamente, os pacientes com menor expressão de miR-217 tendem a ter mais avançado estágio TNM, sugerindo que a baixa expressão ofmiR-217was associada com a progressão GC. Outros estudos demonstraram que a sobre-expressão de miR-217 suprimiram a invasão de células e proliferação de GC. Juntamente com os resultados anteriores, estes dados sugerem que o miR-217might desempenhar um papel crucial na homeostase do tecido GC e deregulatedmiR-217 pode contribuir para o desenvolvimento de um estômago neoplasia.
Para investigar o mecanismo molecular da função supressora de tumores de miR-217 em GC, foi utilizado ensaio de repórter luciferase e western blot para confirmar que GPC5 foi alvo de miR-217 em células de GC. Para confirmar a regulação direta de GPC5 por miR-217, foi utilizado GPC 3 ‘UTR vector repórter tendo o sítio de ligação potencial de miR-217 em que o repórter fluorescente. Além disso, de qRT-PCR e análise Western blot mostrou que a sobre-expressão de miR-217 inibiu a expressão de GPC. Glypicans são uma família de proteoglicanos que são ligadas à superfície exocytoplasmic da membrana plasmática por meio de uma âncora glicosil-fosfatidilinositol [30, 31]. Seis glypicans foram identificados em mamíferos (GPC1 para GPC6) [32, 33]. GPC5 é expresso principalmente no desenvolvimento do sistema nervoso central, membros, rim, pulmão e fígado [34, 35]. Estudos recentes indicaram que alguns GPCS, especialmente GPC3 andGPC5, pode desempenhar um papel importante na regulação da progressão do cancro [35, 36]. Por exemplo,
Zhang
et al. mostrou que GPC5 foi altamente expressa em SACC-M (linha celular de alta pulmão metastático) e em amostras clínicas de carcinoma cístico das adenóides salivar (SACC) casos com metástase pulmonar [36]. O nível de expressão global de GPC5 em casos clínicos sacC com metástases do pulmão foi maior. Williamson et ai. mostraram que os GPC5was gene de codificação amplificadas em 20% dos pacientes com rabdomiossarcoma alveolar (RMS), e que esta glipicano foi sobre-expressa em pacientes RMS. Além disso, a infra-regulação da expressão GPC5 por siARN inibiu a taxa de proliferação de células RMS. Outro estudo descobriu que níveis elevados de expressão GPC5 previu pobres tempos de sobrevivência pós-cirúrgicas para pacientes com NSCLC curativa respeitados, o que sugere o valor de GPC5 como um indicador de prognóstico molecular [35, 37]. No nosso estudo, a expressão de GPC5 foi mais elevada em linhas celulares de GC e os níveis de proteína de GPC5 também foram mais elevados em tecidos de GC do que em tecidos cancerosos adjacentes. A inibição da GPC5 reduziu a proliferação celular e a invasão de GC. Restauração de miR-217 inibiu a proliferação de células GC mediada por GPC5 e invasão. Estes resultados demonstraram que ato miR-217might como um supressor tumoral no câncer gástrico, visando GPC5.
Em conclusão, o presente estudo demonstrou que o miR-217was reprimidos em tecidos GC e linhas celulares. Baixos níveis de expressão de miR-217 foram associados com a fase de pTNM pacientes. A expressão ectópica de miR-217 resultou na inibição da proliferação celular e invasão de GC. Outras investigações revelaram que GPC5 era um potencial alvo de miR-217. miR-217 pode servir como preditor de prognóstico e um alvo terapêutico para os pacientes do GC.
Informações de Apoio
Tabela S1. Resumo dos parâmetros clínico de pacientes com câncer gástrico
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125474.s001
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S2 Table. sequência de iniciador
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125474.s002
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