Abstract
Embora os efeitos da sanguinarine, um alcalóide benzofenantridínico, por inibição de alguns tipos de crescimento de células cancerosas tem sido estabelecida, os mecanismos subjacentes não são completamente compreendidos. Este estudo investigou possíveis mecanismos pelos quais sanguinarine exerce a sua acção anticancerígena em linhas celulares de cancro da bexiga humanas cultivadas (T24, EJ, e 5637). Sanguinarina tratamento resultou na inibição do crescimento de concentração-resposta das células cancerosas da bexiga através da indução de apoptose. A apoptose induzida por Sanguinarina foi correlacionada com a sobre-regulação de Bax, a sub-regulação de XIAP e de proposta, a activação de caspases (-3, -8 e -9), e a geração de aumento de espécies de oxigénio reactivas (ROS) . O ROS eliminador de N-acetilcisteína (NAC) reverteu completamente os eventos apoptóticos desencadeada-sanguinarina. Além disso, a sanguinarina aumentado eficazmente a activação da quinase c-Jun N-terminal (JNK) e a expressão do gene de resposta precoce de crescimento 1 (Egr-1), o qual foi recuperado por pré-tratamento com NAC. Além disso, knockdown de
Egr-1
expressão por pequeno ARN interferente apoptose induzida por sanguinarina atenuado, mas não o inibidor de JNK, o que indica que a intercepção de geração de ROS bloqueou os efeitos apoptóticos induzidos por via sanguinarina desregulação da expressão de Egr-1 proteínas. Tomados em conjunto, os dados fornecem evidência de que sanguinarina é um potente agente anticancro, que inibe o crescimento de células cancerosas da bexiga e induz a sua apoptose por meio da geração de radicais livres
citação:. Han MH, Parque C, Jin CY , Kim GY, Chang YC, Lua SK, et al. (2013) A apoptose indução de células do cancro de bexiga humana por Sanguinarina através Espécies-Mediated Reativas de Oxigênio aumento da regulação do Gene-1 Response Crescimento Precoce. PLoS ONE 8 (5): e63425. doi: 10.1371 /journal.pone.0063425
editor: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, Estados Unidos da América
Recebido: 19 de fevereiro de 2013; Aceito: 01 de abril de 2013; Publicado em: 22 de maio de 2013
Direitos de autor: © 2013 Han et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia concessão (NRF) financiado pelo governo da Coreia (2012-0000476 e 2012046358). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
benzo [c] alcalóides fenantridina (BAS) são um grupo relativamente pequeno de alcalóides de isoquinolina, que foram detectados em muitas espécies de plantas das famílias Papaveraceae, Fumariaceae, Ranunculaceae e Rutaceae [1]. Sanguinarine é um sal de amônio quaternário que pertencem a este grupo de BAs. Foi extraída de algumas plantas, incluindo bloodroot (
Sanguinaria canadensis
L.), papoila espinhosa mexicano
Argemone mexicana
L.,
Chelidonium majus,
e
Macleaya cordata
. [2], [3]. Sanguinarina tem sido demonstrado que possuem fortes propriedades antibacterianas e anti-inflamatórios [4] – [6]. Dados recentes demonstraram também que este composto pode induzir apoptose numa variedade de linhas de células de cancro in
in vitro
; no entanto, ele não mostra quaisquer efeitos tóxicos sobre as células normais quando administrado em doses similares [7] – [16]
espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas altamente reativas.. Eles incluem radicais ânion superóxido, peróxido de hidrogénio, oxigénio atómico, e radicais hidroxila. ROS são geralmente derivados a partir do metabolismo normal do oxigénio, e as mitocôndrias são a principal fonte de ROS. Embora os níveis basais de ROS servir como um regulador fisiológico da proliferação celular e diferenciação normal, níveis elevados de ROS pode causar sérios danos ao ADN e proteínas, conduzindo a apoptose [17] – [19]. Além disso, o stress oxidativo excessivo particularmente como alvo as mitocôndrias, causando uma perda de potencial de membrana mitocondrial (
ΔΨm
) e a apoptose mediada por mitocôndrias [17] – [19]. Estudos recentes sugerem que a geração de ROS por sanguinarine inicia uma cascata de sinais de morte celular em algumas linhas celulares de cancro humano
in vitro
[12], [13], [15].
reativas de oxigênio espécies (ROS) são moléculas altamente reativas. Eles incluem radicais ânion superóxido, peróxido de hidrogénio, oxigénio atómico, e radicais hidroxila. ROS são geralmente derivados a partir do metabolismo normal do oxigénio, e as mitocôndrias são a principal fonte de ROS. Embora os níveis basais de ROS servir como um regulador fisiológico da proliferação celular e diferenciação normal, os estudos mostraram que níveis elevados de ROS pode causar sérios danos ao ADN e proteínas, conduzindo a apoptose [17] – [19]. Além disso, o stress oxidativo excessivo particularmente como alvo as mitocôndrias, causando uma perda de potencial de membrana mitocondrial (
ΔΨm
) e a apoptose mediada por mitocôndrias [17] – [19]. Estudos recentes têm sugerido que a geração de ROS por sanguinarine inicia uma cascata de sinais de morte celular em algum câncer humano linhas celulares
in vitro
[12], [13], [15].
Entre muitos genes regulados por redox, o crescimento inicial resposta-1 (Egr-1), um factor de transcrição dedo de zinco, é de interesse uma vez que é rapidamente e de forma transiente induzido por um número de estímulos extracelulares [20] – [22], e pela todos os indutores de sinalização mediada por ROS e inflamação [23] – [28]. Assim, Egr-1 pode desempenhar um papel crítico na coordenação de acontecimentos celulares após estresse oxidantive [29] – [31]. No entanto, o papel de Egr-1 em apoptose vias ativadas por ROS em células cancerosas sinalização tratado com sanguinarine não foi delineado.
O presente estudo utilizou as linhas celulares de cancro da bexiga humana, T24, EJ, e 5637, para examinar a eficácia citotóxica de sanguinarina e investigar os mecanismos moleculares subjacentes à actividade apoptótica causada por sanguinarina. Os resultados mostraram que as vias de sinalização de apoptose induzida por sanguinarina modulada a actividade de Bcl-2 e o inibidor da proteína de apoptose (IAP proteínas) da família e levou a disfunção mitocondrial, activação de caspases, e a indução de Egr-1. Os resultados também sugerem que ROS são reguladores críticos dos eventos apoptóticos induzidos por sanguinarine.
Materiais e Métodos
cultura de células e viabilidade celular Assay
linhas celulares de cancro da bexiga Humanos ( T24, EJ, e 5637) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Rockville, MD, EUA). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, EUA) e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C num ambiente húmido contendo 5% de CO
2. Sanguinarina (Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, EUA) foi dissolvido em metanol, como uma solução mãe a uma concentração de 10 mM e foi armazenada em alíquotas a -20 ° C. Para o estudo de viabilidade das células, as células foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 1 × 10
5 células por poço. Após 24 h de estabilização, as células foram tratadas com várias concentrações de sanguinarina durante mais 24 h. Após o tratamento, a viabilidade das células foi determinada com o ensaio de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT, Sigma-Aldrich), o qual é baseado na conversão de MTT a MTT formazano por enzimas mitocondriais.
a coloração nuclear com DAPI
Depois de tratar as células com sanguinarina durante 24 h, foram colhidas, lavadas em solução salina tamponada com fosfato gelada (PBS), e fixadas com paraformaldeído a 3,7% (Sigma-Aldrich) em PBS durante 10 min à temperatura ambiente. As células fixadas foram lavadas com PBS e coradas com 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, Sigma-Aldrich) de solução (2,5 ug /ml) durante 10 min à temperatura ambiente. As alterações na morfologia nuclear das células foram analisadas utilizando um microscópio de fluorescência (Carl Zeiss, Alemanha).
Análise por Citometria de Fluxo para a sub-fase G1
As células foram colhidas e lavadas uma vez com PBS, fixadas em gelada etanol a 70%, e armazenadas a 4 ° C. Antes da análise, as células foram lavadas uma vez com PBS, suspensas em 1 ml de um iodeto de propidio frio (PI, Sigma-Aldrich), contendo 100 mg /ml de RNase A, 50 ug /PI ml, 0,1% (w /v) de citrato de sódio, e 0,1% (v /v) de NP-40 e foram ainda incubadas em gelo durante 30 min no escuro. As análises de citometria de fluxo foram realizadas utilizando um citómetro de fluxo (FACS Calibur, Becton Dickinson, San José, CA, EUA), e software Pro celular-quest foi usado para determinar o teor de ADN relativo com base na presença de fluorescência vermelha [19].
Detecção de apoptose por anexina V-FITC coloração
As células foram lavadas com PBS e ressuspenderam-se em um tampão de ligação da anexina-V contendo 10 mM HEPES /NaOH (pH 7,4), 140 mM de NaCl , e 2,5 mM de CaCl
2. Aliquotas de células foram incubadas com anexina V-isotiocianato de fluoresceína (FITC, R D Systems; Minneapolis, MN, EUA), misturados e incubados durante 15 min à temperatura ambiente no escuro. PI a uma concentração de 5 ug /ml foi adicionado a distinguir as células necróticas. As células apoptóticas (V
+ /PI
-). Foram medidos com um citómetro de fluxo
Medição de intracelular ROS
a produção de ROS foi monitorizada utilizando o corante não polar estável 2, 7 diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA, Sigma-Aldrich). As células foram semeadas em placas de 24 poços e incubadas na presença ou ausência de sanguinarina por diferentes períodos de tempo. Mais tarde, as células foram incubadas com 10 mM de DCFH-DA, durante 30 min. A produção de ROS nas células foi monitorizado com um citómetro de fluxo usando o software Cell-Pro quest [32]. A produção de ROS intracelular também foi monitorizada pela emiss de fluoresccia de DCFH-DA no interior das células utilizando um microscópio de fluorescência.
Extracção de proteínas e Western Blotting
As células foram colhidas e lavadas duas vezes em PBS a 4 ° C. Os lisados celulares totais foram lisadas num tampão de lise (Tris 40 mM [pH 8,0], 120 mM de NaCl, 0,5% de NP-40, ortovanadato de sódio 0,1 mM, 2 ug /mL de aprotinina, 2? g /ml de leupeptina e 100 ug /ml de fluoreto de phenymethylsulfonyl). Os sobrenadantes foram recolhidos, e as concentrações de proteínas foram medidas utilizando um ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Para a análise de Western blot, quantidades iguais de extractos de proteína foram extraídos a partir de géis de SDS-poliacrilamida e transferidos para membranas de difluoreto de polivinilideno (Schleicher Schuell, Keene, NH, EUA) por electrotransferência. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite em pó magro em PBS com Tween 20 (PBS-T) (Tris 20 mM [pH 7,5], NaCl 100 mM e 0,1% de Tween 20) durante 1 h à temperatura ambiente. As membranas foram então incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários, sondados com anticorpos secundários ligados a enzima, e visualizados por quimioluminescência aumentada (ECL; Amersham Corp., Arlington Heights, IL, EUA) de acordo com o procedimento recomendado. Os anticorpos primários foram comprados a partir de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, EUA) e Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, EUA). -Burro anti-coelho marcado com peroxidase de imunoglobulina anti-rato e ovelhas imunoglobulina marcada com peroxidase foram adquiridos a partir da Amersham Corp.
A caspase in vitro Ensaio de Actividade
A caspase actividades foram determinadas por ensaios colorimétricos utilizando caspase-3, -8, -9 e kits de activação de acordo com o protocolo do fabricante (R D Systems). Resumidamente, as células foram lisadas num tampão de lise durante 30 min num banho de gelo. Os sobrenadantes foram recolhidos e incubados a 37 ° C com tampão de reacção, que continha ditiotreitol e os substratos Asp-Glu-Val-Asp (DEVD) -p-nitroanilina (PNA) para a caspase-3, Ile-Glu-Thr-Asp (IETD) -PNA para a caspase-8, e Leu-Glu-His-Asp (LEHD) -PNA para a caspase-9. A densidade óptica da mistura de reacção foi quantificado espectrofotometricamente a um comprimento de onda de 405 nm.
O tratamento com pequeno ARN interferente
As células foram semeadas numa placa de 6 poços a uma densidade inicial de 1,5 × 10
5 células por poço. Após 24 h de estabilização, elas foram transfectadas com 100 nM de pequeno ARN interferente (siRNA) contra Egr-1 humano, ou uma quantidade igual de RNA irrelevantes inespecíficos (Dharmacon, Chicago, IL, EUA), utilizando um reagente de transfecção (Genefectine, Genetrone Biotech , Seul, Coreia do Sul), de acordo com as instruções do fabricante. Após 24 h de transfeco, as culas foram incubadas sob as condições indicadas.
Análise estatística
Os dados são expressos como médias ± DP. As comparações estatísticas foram realizadas utilizando SPSS 12.0 seguido pelo teste de Fisher. diferenças significativas entre os grupos foram observadas através de Student não pareado
t
-teste. A
p
valor 0,05 foi aceito como uma indicação de significância estatística
Resultados
Efeitos de Sanguinarina sobre a viabilidade celular e apoptose Indução
Para. investigar se sanguinarina inibiu a proliferação de células de cancro da bexiga, linhas celulares de cancro da bexiga de três (T24, EJ, e 5637) foram estimuladas com as concentrações indicadas de sanguinarina, durante 24 h, e um ensaio de MTT foi realizado. Como mostrado na Fig. 1, o tratamento com sanguinarina diminuiu a viabilidade das células cancerosas da bexiga de um modo dependente da concentração. Assim, foram realizadas experiências adicionais para determinar se este efeito inibidor da sanguinarina sobre a viabilidade das células foi o resultado da morte celular por apoptose. Em primeiro lugar, a coloração DAPI determinaram alterações morfológicas nas células, como mostrado na Fig. 2A. O tratamento com 1,5 uM sanguinarina resultou em um número significativo de células com a condensação da cromatina, perda de construção nuclear, e formação de corpos apoptóticos, que estas características não foram observados em células de controlo. Segundo, a análise de citometria de fluxo para a detecção de populações de células hipodiploidia determinado o grau de apoptose em células tratadas com sanguinarina. Tal como indicado na Fig. 2B, a adição de 1,5 uM de sanguinarina para as células da bexiga resultou no aumento da acumulação de células na fase sub-G1. Em terceiro lugar, as análises de citometria de fluxo com anexina V e PI coloração determinada a magnitude da apoptose induzida por sanguinarina. Como mostrado na Fig. 2C, os números de células anexina V-positivos mostraram aumentos significativos nas células tratadas com sanguinarina em comparação com as células de controlo não tratadas. Consequentemente, estes dados sugerem que as células de cancro da bexiga pode sofrer apoptose após exposição a sanguinarina.
T24, 5637, e as células EJ foram tratados com as concentrações indicadas de sanguinarina durante 24 h, de acordo com as medições de viabilidade celular com um ensaio MTT. Os dados são apresentados como médias ± DP de três experiências independentes. Significativamente diferente do controle, *
p
. 0,05
(A) As células foram incubadas com 1,5 mM sanguinarine durante 24 horas e em seguida coradas com DAPI. Os núcleos corados foram então observadas sob um microscópio de fluorescência (ampliação, x 400) utilizando um filtro azul. (B) Para quantificar o grau de apoptose induzida por sanguinarina, as células foram avaliadas para o teor de ADN sub-G1 utilizando um citómetro de fluxo. (C) As células foram coradas com anexina-V e PI conjugado com FITC para a análise de citometria de fluxo. As células apoptóticas foram determinados por contagem da percentagem de anexina V (+), PI (-) células e a percentagem de anexina V (+), PI (+) células. Os dados são apresentados como médias ± DP de três experiências independentes. Significativamente diferente do controle, *
p
. 0,05
Modulação da Bcl-2 e IAP Familiares proteínas e ativação de caspase por Sanguinarina
A papel de Bcl-2 e as proteínas da família IAP foi determinada por transferência de Western para investigar os mecanismos que estão envolvidos na apoptose induzida por sanguinarina nas células cancerosas da bexiga. Como mostrado na Fig. 3A, o tratamento das células cancerosas da bexiga com 1,5 uM sanguinarina não causou alterações significativas na expressão das proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-XL. No entanto, os níveis de pró-apoptótica Bax aumentada e aqueles da proteína anti-apoptótico de XIAP diminuiu em resposta a sanguinarina. Além disso, a redução em proteínas pró-apoptóticas Lance mostrou um aumento acentuado com o tratamento sanguinarina em todas as linhas celulares de cancro da bexiga. Para determinar se a apoptose induzida por sanguinarina foi associada com a activação de caspases, foram examinadas a expressão e a actividade de caspases nas células tratadas com sanguinarina. Os resultados mostraram que o tratamento sanguinarina regulada negativamente os níveis das proteínas procaspase-3 e aumentaram os níveis de activo de caspase-3. Os níveis de pro-caspase-8 e -9 proteínas foram também sub-regulada nas células tratadas com sanguinarina (Fig. 3B). Para mais quantificação da activação proteolítica da pro-caspase-3, -8 e -9, os lisados equalizados pelo proteína a partir das células tratadas com sanguinarina foram testados para as suas actividades enzimáticas. Como mostrado na Fig. 3C, o tratamento sanguinarina marcadamente aumentou a sua actividade de caspase. As análises Western blot subsequente mostrou a clivagem proteolítica progressiva da poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) de proteína, que é um alvo a jusante da activado caspase-3 [33], nas células após o tratamento sanguinarina (Fig. 3B) .
(a e B) após 24 h de incubação com sanguinarina, as proteínas celulares foram separadas por géis de SDS-poliacrilamida e transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas foram sondadas com os anticorpos indicados, e as proteínas foram visualizadas utilizando um sistema de detecção de ECL. Para confirmar carga igual, actina foi utilizado como um controlo interno. (C) Para ensaiar o
In vitro
actividade da caspase, as alíquotas foram incubadas com DEVD-pNA, IETD-pNA, e LEHD-pNA como substrato para a caspase-3, -8, -9 e, respectivamente, e em seguida, os produtos libertados de fluorescência foram medidas. Cada ponto representa a média ± SD das experiências representativas realizadas pelo menos três vezes. A Student
t
-test (*
p Art 0,05 vs. controlo sem tratamento). Foi utilizado para analisar a significância estatística dos resultados
Sanguinarine- a apoptose induzida está associado com a geração de ROS
Para determinar se a apoptose induzida por sanguinarina foi associada com o stress oxidativo ROS-mediada, a produção de ROS intracelular foi medida com o ensaio de fluorescência de DCFH-dA utilizando um citómetro de fluxo. Tal como indicado na Fig. 4A, quando as células foram expostas a sanguinarina, o nível intracelular de ROS drasticamente aumentada em 30 minutos (mais do que um aumento de 8 vezes em comparação com o controlo), e depois diminuiu com o tempo. O tratamento prévio das células com um eliminador de ROS bem conhecido, N-acetilcisteína (NAC), grandemente diminuída neste elevado nível de ROS nas células tratadas com sanguinarina. A produção intracelular de ROS também foi monitorizada pela emiss de fluoresccia de DCFH-DA no interior das células T24 usando um microscópio de fluorescência. O aumento da intensidade de coloração com DCF-DA observado nas células tratadas com sanguinarina era dependente do tempo revogada para controlar os níveis na presença de NAC (Fig. 4B). Para determinar se a produção de ROS induzidas por sanguinarina era atribuível à indução de apoptose, as células foram tratadas com NAC durante 1 h e co-incubados com sanguinarina durante mais 24 h. Como mostrado na Fig. 5A, os efeitos inibidores de NAC na produção de ROS induzidas por sanguinarina correlacionados com uma marcada inibição de morte celular por apoptose medido pelo citómetro de fluxo. Além disso, o bloqueio da geração de ROS por pré-tratamento das células com NAC impediu a activação induzida por sanguinarina de caspases, a clivagem de PARP, e a modulação de Bcl-2 e as proteínas da família IAP (Fig. 5B e C). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que um sistema de geração de ROS desempenha um papel essencial na apoptose induzida por sanguinarina em células cancerosas da bexiga.
(A) As células foram incubadas com 1,5 uM sanguinarina durante os tempos indicados, ou eles foram pré-tratados com NAC 10 mM, durante 1 h e ainda tratados com 1,5 uM sanguinarina durante os tempos indicados. Eles foram, então, corados com DCFH-DA. geração de ROS foi medida usando um citómetro de fluxo. Cada ponto representa a média de experiências representativas realizadas duas vezes. (B) DCFH fluorescência em células T24 cultivados sob as mesmas condições como (a) Determinou-se a fluorescência utilizando um filtro verde. Pelo menos cinco campos foram visualizadas em cada uma das experiências.
(A) As células foram tratadas com ou sem NAC (10 mM) durante 1 h antes do desafio com 1,5 ^ M de sanguinarina, durante 24 h. Eles foram recolhidas e coradas com FITC-conjugado anexina-V e PI para análise de citometria de fluxo. Os dados são apresentados como médias ± DP de três experiências independentes. A Student
t
-test (*
p Art 0,05 vs. controlo não tratada;
#
p Art 0,05 vs. células tratadas com sanguinarine) foi utilizado para analisar a significância estatística dos resultados. (B) Em seguida foram colhidas e as proteínas foram indicados detectado por análise de Western blot. Actina foi utilizado como um controlo interno. (C) Para ensaiar o
In vitro
actividade da caspase, as alíquotas foram incubadas a 37 ° C durante 1 h, e os produtos libertados de fluorescência foram medidas. Cada ponto representa a média ± desvio padrão de experiências representativas realizadas pelo menos três vezes. A Student
t
-test (*
p Art 0,05 vs. controlo não tratada;
#
p Art 0,05 vs. células tratadas com sanguinarine) foi utilizado para analisar a significância estatística dos resultados.
a apoptose não está associado com a ativação de JNK
induzida por Sanguinarina
Muitos relatórios anteriores indicaram que citotóxico sinalização ROS pareceu ser mediada, em parte, através da activação da quinase c-Jun N-terminal (JNK) em cascata, em vez do que a quinase p38 activada por mitogénio (MAPK) ou a cinase regulada por sinal extracelular (ERK) [34] – [36]. Assim, o presente estudo investigou o envolvimento de JNK na apoptose induzida por sanguinarina. Como mostrado na Fig. 6A, a fosforilação de JNK foi detectável após tão pouco como 15-30 min de tratamento sanguinarina e persistiu por, pelo menos, 1-4 h do tratamento. No entanto, o limpador de ROS NAC bloqueou completamente a fosforilação aumentada de JNK (Fig. 6B). Estes resultados indicaram que a via JNK foi activada de uma forma dependente da ROS em resposta à presença de sanguinarina. Para determinar se a activação da JNK participou na apoptose, foi testado o efeito de um inibidor de JNK específica, SP600125, nas células tratadas com sanguinarina. Os resultados mostraram que o pré-tratamento SP600125 não atenuou a acumulação de células apoptóticas em relação a células tratadas com SP600125 sozinho (Fig. 6C). Os dados indicam que a fosforilação de JNK ROS-dependente não ocorre a montante da apoptose induzida por sanguinarina em células cancerosas da bexiga.
(A) As células foram tratadas com sanguinarina durante os tempos indicados, ou (B) que foram pré-tratados com NAC durante 1 h e desafiados com sanguinarina durante 24 h. Eles foram, em seguida, colhidas, e as proteínas foram indicados detectado por análise de Western blot utilizando anti-p-JNK, os anticorpos anti-JNK, e um sistema de detecção de ECL. (C) As células foram tratadas com ou sem SP600125 durante 1 h antes do desafio com sanguinarina durante 24 h. As células foram analisadas usando um citómetro de fluxo para determinar a anexina-V. Os dados são apresentados como médias ± DP de três experiências independentes. Para a análise estatística, a
t
-test foi realizada (*
p Art 0,05 vs. células não tratadas).
Associação de ROS-dependente Up- regulação de Egr-1 induzida com sanguinarina apoptose
Finalmente, a relação entre o potencial de apoptose induzida por sanguinarina e expressão de Egr-1 foi investigada. Como mostrado na Fig. As análises 7A, tempo-curso demonstraram que 1,5 uM de sanguinarina induzida proteínas Egr-1 dentro de 2 h, e estes não retornou à linha de base durante 4 h. Como sanguinarina gerado ROS dentro de 0,5 h, os níveis de ROS diminuiu após 2 h (Fig. 4), e a expressão de Egr-1 por sanguinarina maximamente aumentado ao longo do período de tratamento de 2-4 h, potencial regulação induzida por ROS da indução de Egr-1 foi investigada. Immunoblotting dados indicaram que o bloqueio da geração de ROS por pré-tratamento das células com proteínas Egr-1 induzida por sanguinarina NAC marcadamente eliminado nas três linhas de células (Fig. 7B). Para investigar o papel de Egr-1 na apoptose induzida por sanguinarina, de Egr-1 com sucesso a expressão do gene foi regulada para baixo usando Egr-1 siRNA (Fig. 7C). O seu efeito na clivagem de PARP, bem como na indução de apoptose, foi então avaliado. Como mostrado na Fig. 7D e E, a inibição da expressão de Egr-1 de forma eficaz a degradação induzida mitigado-sanguinarina de PARP e a acumulação de células sub-G1 apoptóticas. Os resultados confirmam que a indução de apoptose por sanguinarina ocorre de uma forma de Egr-1-dependente e que um aumento na produção de ROS é necessário para activação de Egr-1 e a ocorrência de apoptose induzida por sanguinarina em células cancerosas da bexiga.
as células foram tratadas com sanguinarina durante os tempos indicados (a) ou tratadas com ou sem NAC durante 1 h antes do desafio com sanguinarina durante 2 horas (B). Em seguida, quantidades iguais de proteínas (30? G) foram separadas em géis de SDS-poliacrilamida e transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas foram sondadas com anticorpo anti-Egr-1, e as proteínas foram visualizadas utilizando um sistema de detecção de ECL. (C-E) As células foram transfectadas com ARNsi contra Egr-1 humano, usando um reagente de transfecção. Após 24 horas da transfecção, as células foram tratadas com sanguinarina durante mais 2 h (C) ou 24 h (D e E). Eles foram, em seguida, colhidas, e as proteínas foram detectadas indicados por análise de Western blot (C e D). Além disso, as células foram avaliadas por um citómetro de fluxo para anexina-V (D). Os resultados são expressos como a média ± DP de três experiências independentes. A significância estatística dos resultados foi analisada com um Student
t
-test (*
p Art 0,05 vs. controlo não tratada;
#
p Art 0,01 vs. células tratadas com sanguinarine).
Discussão
Para estudar os mecanismos pelos quais o tratamento sanguinarine induz a apoptose em células de cancro da bexiga, o presente estudo analisou uma série de marcadores associados com morte celular por apoptose. O mecanismo de apoptose é dividido em duas vias: uma via apoptótica da morte mediada pelo receptor de extrínseca e uma via apoptótica mediada por mitocôndrias intrínseca. a activação da caspase é geralmente considerada uma característica chave de apoptose nestas vias. A via extrínseca é activada na superfície da célula quando um ligando morte específica se liga ao seu receptor da superfície da célula correspondente. Nesta via, a caspase-8 actua como um iniciador da caspase, que activa as caspases efectoras a jusante, tais como a caspase-3, -6 e -7. Por outro lado, a via intrínseca tem um sinal apoptótico proveniente de dentro das células, e que conta com a permeabilização de membranas mitocondriais para libertar proteínas mitocondriais apoptogénicas para o citosol, activando assim o iniciador de caspase-9. A caspase-9 activado inicia os eventos a jusante directamente por clivagem e activação de caspases efectoras, gerando um fragmento que activa a via mitocondrial [37], [38]. A apoptose pode também ser regulada por vários produtos génicos, tais como a família Bcl-2 de proteínas anti-apoptóticas e pró-apoptóticas, e as proteínas da família de IAP, que são capazes de se ligar e inibir caspases [39], [40]. Na via de morte mitocondrial, a razão entre a expressão das proteínas pró-apoptóticas, tais como Bax e Bak e as proteínas anti-apoptóticos tais como Bcl-2 e Bcl-xL em última análise, determinar a morte celular ou sobrevivência. Além disso, a caspase-8 medeia a via intrínseca através de clivagem da proteína Bid pró-apoptótica, uma proteína somente de BH3, a uma oferta truncada (tBid) através da translocação do citosol para a mitocôndria, desencadeando a disfunção mitocondrial, seguida por activação da caspase 9 [41]. Este estudo demonstrou que a expressão do Bax proapoptótica mostrou um aumento da apoptose induzida por sanguinarina, ao passo que a quantidade de anti-apoptótico Bcl-2 e Bcl-xL permaneceram relativamente inalterados (Fig. 3A). Os dados também demonstram que a apoptose induzida por tratamento sanguinarina através da activação de dois caspases iniciadoras, caspase-8 e -9, que foram envolvidos nas vias extrínsecas e intrínsecas, respectivamente, bem como efector da caspase-3 (Fig. 3B e C), o qual foi associado com clivagem concomitante da PARP, um activado a caspase-3 de proteína substrato-alvo (Fig. 3B) [33]. Além disso, o tratamento sanguinarina reduzida a expressão de XIAP, um membro da família de IAP de proteínas (Fig. 3A), que têm sido relatadas para exercer efeitos anti-apoptóticos porque funcionam como inibidores directos de caspases activadas [37], [39]. Além disso, a exposição de células a sanguinarina levou a uma redução significativa em toda a Bid, indicando que a proteína pró-apoptótica, Bid, foi truncada (Fig. 3A). Assim, os presentes dados indicam que ambas as vias intrínsecas e extrínsecas pode ter contribuído, pelo menos em parte, para a apoptose induzida por sanguinarina das células cancerosas da bexiga humanos.
provas crescentes sugerem que as mitocôndrias danificadas estimular a produção de ROS e que a produção de ROS desproporcionada induz a apoptose através da via intrínseca, causando danos para as mitocôndrias através da activação de caspases [17] – [19]. Os dados mostraram que o tratamento resultou em sanguinarina aumentou significativamente a produção de ROS no início do processo. Co-cultura com NAC, um limpador ROS comumente usado, bloqueado geração de ROS (Fig. 4). Além disso, o bloqueio da geração de ROS apoptose completamente evitada (Fig. 5A) e recuperado a activação induzida por sanguinarina de caspases, a degradação de PARP, e a sub-regulação de XIAP e de expressão Bid inteiro (Fig. 5B e C). Estes resultados indicaram que a produção de ROS por sanguinarina é necessária para a indução de apoptose em células cancerosas da bexiga.
estudos recentes têm indicado que vários estímulos apoptóticos pode activar rapidamente MAPKs, que incluem JNK, ERK, e p38MAPK. Entre eles, a via de JNK, como uma via de sinalização a montante de caspase-3, pode desempenhar um papel importante no desencadeamento de apoptose em resposta a radicais livres gerados pela radiação ultravioleta ou aplicação directa de H
2O
2 [42] , [43]. Assim, o presente estudo investigou se esta via sinal foi envolvido no efeito apoptótica de sanguinarine em células de cancro da bexiga. Os dados indicam que a fosforilação de JNK ocorre rapidamente, dentro de 30 min de tratamento sanguinarina, e persiste durante, pelo menos, 1-6 h após a exposição sanguinarina (Fig. 6A).