Abstract

Tem ADAMTSs família de proteinases secretadas Ou seja, quando a quota de llo por sua vez, Protestante INASE DOMÍNIO com metaloproteinases de matriz (MMP). Ao agir sobre o grande painel de substratos extracelulares, eles controlam várias funções celulares, como Fusion, adesão, proliferação e migração. Através de seus motivos trombospondina eles também possuem propriedades anti-angiogénicos. Leia ADAMTSs investigou se o cipar RTI na progressão do cancro colo-rectal e invasão. Sua expressão pura investigadas em ambos os níveis de proteína mRNA e. Usando RT-PCR, a expressão de

ADAMTS-1 |,

-4

,

-5

e

ADAMTS-20

pura estimado em tumores colorretais estágio diferente de câncer e local anatômico e linhas celulares de 3 agressividade diferente. Uma sobre-expressão de ADAMTS-4 e -5 puros observado, especialmente em amostras de tecido, enquanto ADAMTS-1 e -20 PROSTITUTA Encontrado para produzir regulada para baixo. Western blot Análise suportado ainda mais os resultados de RT-PCR, revelando Além disso, a degradação de ADAMTS-1 e -20 em cancro. Na expressão situ e localização de

ADAMTS-1 |,

-4

,

-5

e

-20 pura

também investigado por análise imuno-histoquímica. Nossos dados sugerem uma correlação positiva entre

ADAMTS-4

e

-5

expressão e progressão do câncer, em contraste com os membros anti-angiogénicos da família,

ADAMTS-1

e

-20

, que PROSTITUTA Encontrado para produzir regulada para baixo. Nossos resultados suportam a noção de que a sobre-expressão de ADAMTS-4 e ADAMTS-5 no câncer colorretal pode produzir uma possível vai nvasive mecanismo das células cancerosas, a fim de degradar proteoglicanos de ECM

CITAÇÃO:. Filou S, o RPE Tinou A, Kyri está em ulou D, D Bounias, Stavropoulos H, Ra zoula viral P, et al. (2015) Expressão ADAMTS no câncer colorretal. PLoS ONE 10 (3): e0121209. doi: 10.1371 /journal.pone.0121209

Editor do Academic: Alberto G. Passi, da Universidade de nsubria, ITALY

Recebido: 01 de outubro de 2014; ACEITOS: 02 de janeiro de 2015; Publicação: 18 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Filou et al. Este é um artigo de acesso livre distribuído sob os termos da licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original e de recursos são creditados

Dados Disponibilidade: todos os dados relevantes estão dentro do Papel

financiamento:.. os autores não têm financiamento ou apoio ao Relatório

interesses concorrentes:. os autores declararam não concorrentes que existam interesses

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é o terceiro câncer mais freqüentemente diagnosticado e a segunda principal causa de mortes por câncer nos Estados Unidos [1] e na Europa, também. Embora CRC é ncidence, em países economicamente desenvolvidos, está estabilizado ou melhor, não quis [2] Há ainda o usuário uma pergunta para a maior compreensão da biologia da angiogênese e invasão com vista à descoberta de moléculas anti-angiogénicos /anti-Israel nvasive. Acumulando e vidência demonstra o papel crucial de enzimas proteolíticas, tais como metaloproteinases de matriz (MMP) e intimamente relacionado ADAMTSs (a desintegrina e ter uma volta protestante llo INASE com motivo de trombospondina) na progressão e desenvolvimento de câncer [3]. São o grupo ADAMTS distinta das metaloproteinases dependentes de zinco e exibir semelhanças elevadas Quence com a família de venomases cobra reprolisina. A família completa ADAMTS humanos compreende 19 genes [4] (ADAMTS-5 e ADAMTS-11 compartilham o mesmo gene) e, embora eles são proteínas solúveis, muitos deles parecem se ligar a matriz extracelular através dos seus motivos trombospondina ou sua espaçador Região [5 -7]. ADAMTS têm funções variadas, incluindo Clementina Avage específica dos proteoglicanos da matriz agrecano, versicano e brevican (ADAMTS-1, -4, -5, -8 e -15) [7-9], a inibição da angiogénese (ADAMTS-1, -8 ) [8-12] e processamento de colágeno (ADAMTS-2, -3 e -14) [13].

ADAMTS-1 e -8 são considerados para produzir factores anti-angiogénicos, causa nascimento da interação entre sua motivos trombospondina e CD36, uma glicoproteína receptor de membrana de células endoteliais [11, 12]. Estas proteases têm sido mostrados para inibir a angiogénese induzida por VEGF no ensaio da membrana corioalantóica (CAM) [10] e suprimir vascularização induzida por FGF-2-no ensaio de córnea de bolso. No entanto, ADAMTS-1 deve produzir um mais considerado como lecule com efeitos anti-ou protestante-metastáticos dependendo do local Avage o Clementine, durante a sua Avage Clementine Auto-proteolítica [14]. ADAMTS-8, também parece inibir a sinalização do receptor do factor de crescimento epidérmico, juntamente com a diminuição dos níveis de MEK fosforilada e ERK [15]. Além disso, a 12q12 lócus de Gene ADAMTS-20 foi encontrado para produzir sujeitos a translocações e outras alterações em neoplasias humanas [16-19] e também várias condições patológicas, incluindo a doença de Parkinson [20].

Há a riqueza de e ADAMTS vidência demonstrando que estão desregulados no câncer humano. De fato, estudos anteriores demonstraram que ADAMTS-20 é abundante no cérebro e da mama carcinomas, sugerindo que esta provocação protestante de que poderia desempenhar um papel na progressão do tumor. Para ADAMTS-1, tem sido demonstrado que a superexpressão da sua isoforma de comprimento completo aumenta o crescimento do tumor e promove a metástase pulmonar de células TA3 mamarias ou células de pulmão de Lewis, enquanto verificou-se diminuição no carcinoma do pulmão de células não pequenas, os tumores pancreáticos e linhas celulares de cancro da próstata [21, 22]. Também tem sido mostrado que ADAMTS-1, -5, -9, -12, -15 e -18 promotores de genes são hipermetilado em cancro colorrectal, o que sugere a diminuição da expressão dessas enzimas neste estado [23]. Além disso, tanto ADAMTS-15 e -18 genes sofrer mutações frequentes em células de câncer colorretal, mas nenhum e vidência ainda apresentados ao seu efeito na expressão ou função das enzimas. Em contraste, ADAMTS-4 e -5 são regulados positivamente em glioblastomas (GBMS), com o possível papel no aumento da degradação da brevican aumentando assim o potencial nvasive [24, 25]. Aumento versicam, que pode produzir Relacionado a ADAMTS expressão modulados, também é observada em adenomas do cólon caninos e carcinomas [26]. Não decorim versicam mas a acumulação está relacionada com a malignidade em mammographically detectada uma elevada densidade e microcalcificações malignas-aparecendo em carcinomas de mama não palpáveis ​​[27].

Para obter mais conhecimentos sobre se é provável para o overexpressed versicam para produzir ADAMTS-1 degradado por ADAMTS como o cancro do mecanismo nvasive, leia examinados, -4 e -5 expressão e tecidos saudáveis ​​do cólon cancerosas e também em linhas celulares de cancro do cólon de potencial metastático diferentes. Uma vez que o objetivo deste estudo pura para revelar potenciais alvos para o desenvolvimento de novos anti Não, a única terapias nvasive mas também anti-angiogénicos, a pura expressão subgrupo anti-angiogênico ADAMTS também estimou. Além disso, uma vez que ADAMTS-1 o efeito anti-angiogénico é mediada pelos seus motivos trombospondina [11] e da ADAMTS-20 contém 14 repetições de que, também estimada seus níveis celulares totais no cólon neoplásica e saudável.

Materiais e Métodos

Materiais

os anticorpos policlonais de coelho, ab28284 (contra a extremidade N-terminal da ADAMTS-1), (ab84792 contra a extremidade C-terminal da ADAMTS-4), ab41037 (contra os resíduos 600-700 de ADAMTS-5) e ab60148 (contra domínio catalítico de ADAMTS-20) PROSTITUTA comprado de Abcam (Cambridge, UK) e IgG anti-coelho de cabra conjucated com o pr xidase pura de EMD da Corporação llipore (llerica salão de beleza, Massachusetts, EUA). De murganho anti-tubulina (T9026) e a IgG PROSTITUTA O xidase conjugado de ratinho anti-(A4416), obtido a partir de Sigma-Aldrich Inc. (St. Luis, EUA). Expor rato e coelho específico HRP /DAB IHC Kit de Detecção (ab94710) puro do Abcam. O ARN total extraído de tecido congelado puro e células em cultura utilizando o kit de extracção de NucleoSpin Macherey-Nagel (Düren, Alemanha), seguindo o protocolo do fabricante. RT-PCR puro obtido da Takara (Otsu, Shiga, Japão) Um passo estojo de RT-PCR, utilizados para o tecido do cólon fresco e da Takara PrimeScript 1

kit de síntese de ADNc de cadeia r e Finnzymes (Espoo, Finlândia) Dynazyme II de ADN em lymerase kit, utilizado para células em cultura. Primers humanos para todas as moléculas prostituta concebido no laboratório, utilizando o Programa PerlPrimer. Todos os outros produtos químicos usados ​​em todo o PROSTITUTA estudo sobre a melhor do grau analítico ilable viral.

Estudos sobre

Células

culturas de células.

Caco-2, DLD-1 e HT-29 linhas celulares de cancro do cólon PROSTITUTA adquiridos a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). A agressividade das linhas celulares é mais baixa em células Caco-2 e mais elevada em células HT-29. DLD-1 e células HT-29 PROSTITUTA cultivadas em meio RPMI 1640 com 2 mM de L-glu tamina e suplementado com 10 mM HEPES; 1 mm de piruvato de sódio, 4,5 g /L de glucose, 1,5 g /l de bicarbonato de sódio e 10% de soro fetal de bovino (FBS), Quando necessário, tal como recomendado pela ATCC. Caco-2 As células PROSTITUTA cultivadas em Mínimo de Eagle meio essencial com BSS de Earle e 2 mm tamina L-Glu (EMEM) e suplementado com piruvato de sódio a 1,0 mm, 0,1 mm de aminoácidos não essenciais, 1,5 g /l de bicarbonato de sódio e 20% de soro bovino fetal quando necessária, como também recomendado pela ATCC. Células prostituta cultivadas a 37 ° C, 5% O

2 e 100% de umidade.

lise celular.

As pelotas de células cultivadas tratadas com uma prostituta Ppro tampão de lise disso, contendo 25 mm HEPES, NaCl 150 mM e 5 mm de EDTA em 10% de glicerol e 1% de Triton X-100. Extracções PROSTITUTA realizada durante 30 min a 0 ° C, sob agitação em vórtice durante 4 seg a cada 10 minutos, com a presença de inibidor sphatase phosphotyrosyl audiência de Na

3VO

4 (50 mm) e um dos seguintes inibidores amole protestantes: aprotinina (1250 ng /mL), Pefablock (1000mg /mL), Leupeptin (10 mM), após centrifugação em 10.000 rpm por 5 min.

Estudos em amostras humanas

Os doentes.

a prostituta tecidos cancerosos do cólon obtidas a partir de pacientes (38 pacientes, com idade média de 73 anos, faixa etária: 50-81), que foram submetidos a intervenção cirúrgica devido a carcinoma colorectal. Sou os pacientes do estágio (de Duke), treze pacientes de estágio B, doze pacientes do estágio C e quatro pacientes de estágio D PROSTITUTA incluídos neste estudo. Os pacientes incluídos no estudo de outros PROSTITUTA livre de doença e sofreu Nunca Antes de qualquer das doenças. tecidos do cólon saudáveis ​​(N = 6) PROSTITUTA também incluídos em nosso estudo. Este projeto estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Universitário de Patras, na Grécia, e pura consentimento informado de todos os pacientes que entraram no estudo.

Extração seqüencial de componentes extracelular e células-associado a partir de tecidos.

os tecidos do cólon normais e cancerosos recolhidos PROSTITUTA em cubos e sequencialmente extraídos com 10 Vols de 10 mM de fosfato dissódico, M NaCl 0,14, pH 7,4 (PBS), nidine cloridrato de 4 da borboleta M (GdnHCl) – de sódio 0,05 M para Cetate pH 5,8 e 4 GdnHCl M-0,05 M de sódio-Cetate de 1% de Triton X-100, a fim de obter a solúvel e as formas ligada à membrana de ADAMTSs. Extracções PROSTITUTA realizada durante 24 h a 4 ° C sob agitação suave, com a presença do seguinte turno protestante INASE inibidores: ε-amino-n-capróico ácido (0,1 M), PMSF (0,4 mM), N-e thylma a imida (10 mM), fosfato dissódico EDTA (10 mM) e nascimento é midine-HCl (5 mM). Os extractos PROSTITUTA recolhido e armazenado a -20 ° C até à sua utilização [28-30]. O protocolo de extracção puro concebidos de tal maneira de jogar ADAMTS parate existia em formas livres nos tecidos e deve produzir extraiu-se em PBS (uma sso as condições iniciativa), a partir de ADAMTS que interagem com outras macromoléculas extracelulares que deve produzir extraídos em 4M GdnHCl (di sso as condições iniciativa) e a partir de ADAMTS existentes nas membranas das células que deva produzir extraídos especialmente em GdnHCl 4M-1% de Triton X-100.

imuno-histoquímica.

a imuno-histoquímica (IHC) realizados em puro 5 uM secções cortadas de formalina, fixa Os blocos de parafina-incorporada como descrito anteriormente [29], utilizando anticorpos policlonais contra primárias ADAMTS-1, -4, -5 e -20 diluído 1: 6250, 1: 2000, 1: 650 e 1: 6250, respectivamente, em TBS contendo 1 % (w /v) de BSA. Os complexos de antigénio-anticorpo obtido PROSTITUTA visualizada por incubação com anti-coelho de cabra HRP é njugate e manchando o puro desenvolvida com DAB /peróxido de hidrogénio de Kit de IHC (Abcam) De acordo com as instruções do fabricante. Finalmente, a prostituta secções contrastadas com hematoxilina. Uma coloração positiva puro

pontuados de acordo com toda a intensidade de cada uma das secções.

análises de Western blot

Cerca de 20 ug de proteína, quantificados utilizando um ensaio de Bradford (BioRad), a partir de tecidos e células culturas Extractos, e as culturas de células Meios PROSTITUTA precipitado com 5 vols de etanol, dissolvidos em 20 ul de tampão de amostra de Laemmli e aplicadas à electroforese em gel de Lya crylamide (PAGE) em géis de 10% de concentração na crylamide como previamente descrito [28]. As macromoléculas prostituta então transferido para o lyvi nylidene di flúor (PVDF) membranas (Immobilon-P, a llipore) a uma corrente constante de 80 são a 4 ° C durante 20 h em 0,05 M de Tris /HCl, pH 8,3 e as membranas PROSTITUTA lavada com 0,14 M de NaCl em tampão de fosfato 0,01 M (PBS), pH 7,2, contendo 0,1% (v /v) de Tween-20 (PBS-T). Após bloqueio com 5% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS-T, as membranas prostituta imersos em solução de anticorpo contra ambos ADAMTS-1, -4, -5 ou -20 diluído a 1: 5000, 1: 500, 1: 250 e 1: 5000, respectivamente, em PBS contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS-T e incubadas durante 1 h à temperatura ambiente. Após repetidas lavagens com PBS-T, as membranas prostituta incubadas com o anticorpo secundário adequado diluída 1: 10000 em PBS-BSA a 1%, incubaram-se durante 1 h à temperatura ambiente e lavou-se com PBS-T. A PROSTITUTA bandas imunorreagentes visualizadas por atenção aumentada com o método conectores nescence (ECL) (Amersham, Reino Unido), segundo as instruções do fabricante e por e Xposure a filme de raios-X Agfa Curix, em tempos variados entre 1 e 30 min, dependendo da experiência.

extração de RNA e RT-PCR analisa

tecidos do cólon frescos pROSTITUTA pulverizados em azoto líquido e cultivadas como células prostituta submetidos a extração de RNA total, utilizando o kit de extração NucleoSpin, conforme descrito nas instruções do fabricante e tratados com DNase isenta de RNase para remover ADN genómico contaminante. Para tecidos do cólon, cadeia de ADNc sintetizada a partir puros 80 ng de ARN total em componentes de reacção 50 uL de um-passo kit de RT-PCR, de acordo com as instruções do fabricante. Esta mistura de reacção contida na adição de 1 | iM de iniciadores e sentido ntisense mostrado na Tabela 1. A amplificação pura realizada num GeneAmp 2400 termociclador (Perkin-Elmer Co.) e o perfil de reacções utilizadas para todos os iniciadores define puro: 95 ° C durante 10 min para a activação de ADN em lymerase e inactivação de nscriptase TRANSLATION_LANGUAGE inversa e depois 25-35 ciclos, dependendo da análise, a 94 ° C durante 30 s, 52-58 ° C, dependendo do conjunto de iniciadores para 1 min e 72 ° C durante 1 min a extensão do anel Phi. Para culturas de células, em dois passo de RT-PCR puro aplicada e o ADNc da primeira cadeia puro sintetizados a partir de 1 ug de ARN total em componentes de reacção de 20 uL para PrimeScript 1

kit de síntese de ADNc de cadeia r, usando 6mers aleatórios, de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, 100 ng de cDNA amplificado prostituta em 50 componentes da reação ul de DNA no kit lymerase. Esta mistura de reacção continha 0,5 | iM para além do sentido e os iniciadores ntisense mostrados na Tabela 1. A amplificação pura realizada num GeneAmp 2400 termociclador (Perkin-Elmer Co.) e o perfil de reacções utilizadas para todos os iniciadores define puro: 95 ° C durante 2 min, 94 ° C durante 30 s, 52-58 ° C, dependendo do conjunto de iniciadores para 1 min e 72 ° C durante 1 min a extensão do anel e Phi repetido puro por 25-35 ciclos, em função da análise. Os produtos da reacção PROSTITUTA separados por electroforese em 2% (w /v) de geles de garose Gelstar Stain contendo a vitamina alize não os fragmentos de ADNc amplificados sob UV. A prostituta géis então digitalizado e as bandas prostituta analisados ​​densitometricamente. Qu das diferenças tativos Antioch entre amostras de cDNA normalizados prostituta por incluindo GAPDH em todos os experimentos.

Análise Estatística

A normalidade da distribuição dos valores puros testados com o teste de Kolmogorov-Smirnov. Resultados PROSTITUTA analisados ​​estatisticamente utilizando o teste t não pareado para detectar diferenças entre os grupos.

P ≤0.05

pura considerado estatisticamente significativo.

Resultados

ADAMTSs expressão no câncer de cólon linhas celulares

análises RT-PCR.

a fim de ser nve stigate possível a implicação de ADAMTSs no CRC, leia examinou sua expressão a nível RNA e proteínas em linhas celulares de cancro do cólon Três. Os resultados indicados no mesmo nível de RNA, ADAMTS-1 expressão pura ligeiramente dependente da agressividade de células cancerosas; -lo puro não encontrado para produzir expresso em células Caco-2, enquanto que apresentou baixa expressão em DLD-1, o que aumentou ligeiramente em puras células HT-29. Além disso, em células HT-29 cultivadas na presença de soro, ADAMTS-1 pura expressão Encontrado elevada (Fig. 1). Pelo contrário, altos níveis de ADAMTS-4 ARN PROSTITUTA Três encontrado em todas as linhas celulares. No entanto, ADAMTS-4 Encontrado pura expressão para produzir um aumento da agressividade forma in-relacionadas, especialmente quando células cultivadas na ausência de soro. Além disso, com a excepção de as células DLD-1, a expressão aumentada de ADAMTS-4 PROSTITUTA observada pura Quando células cultivadas na presença de soro (Fig. 1C). Como mostrado na Fig. 1E, há ADAMTS-5 Encontrados pura expressão em Caco-2 células, enquanto pura observado principalmente em células HT-29. Ao contrário, da ADAMTS-1 e -4, ADAMTS-5 pura expressão Encontrado para produzir sub-regulada em células cultivadas na presença de soro. Um padrão de expressão diferente observado para ADAMTS-20 pura. Como mostrado na Fig. 1G, em DLD-1 e células HT-29, puros encontrados para produzir expresso apenas quando cultivadas na ausência de soro. No entanto, a presença de soro não parecia o 20 ADAMTS expressão confluência em Caco-2 Cells.

Semi-qu de Antioquia sentante RT-PCR Análise de (a) ADAMTS-1, (C) ADAMTS-4 (E) ADAMTS-5 e (G) ADAMTS-20 nas células em cultura (coluna branca /preta, presença /ausência de soro). Os valores são a GAPDH-normalizado média ± S.D. (B) ADAMTS-1 (D) e ADAMTS-4 (F) ADAMTS-5 proteína na distribuição celular e em extratos de células de mídia cultivadas. (S

+/-: presença /ausência de soro) *

P

≤0.05; diferenças estatisticamente significativas em comparação com células cultivadas na presença de soro. **

P

≤0.05; diferenças estatisticamente significativas em comparação com Caco-2 Células, ***

P

≤0.05; diferenças estatisticamente significativas em relação ao DLD-1 células. Para comparação, em imunoidentificação tubulina celular extratos puros incluídos no B, D e F.

analisa Western Blot.

ADAMTS-1 detectada datação radioativa na forma pura DLD-1 e HT- 29 linhas celulares, como a banda de 80 kDa nos extractos celulares, ao passo que apenas fragmentos de ADAMTS-1 de 35 kDa PROSTITUTA detectada em meios de comunicação (Fig. 1b), independentemente da presença de soro. Estes fragmentos podiam produzir produtos de ADAMTS-1 quer autocataliticamente transformados ou de ADAMTS-1 cataliticamente processados ​​por MMPs. Dado o fato de que tais fragmentos detectados PROSTITUTA não somente extra e intra-celularmente, São mais possível resultante da actividade MMPs. Em linhas de células Caco-2 é depois desta provocação pura llo protestante detectadas apenas na presença de soro, a mesma forma molecular como em outras linhas de células Ambos (Fig. 1b). Uma banda adicional de 65 kDa observada nos extractos puros de DLD-1 As células cultivadas na ausência de soro.

ADAMTS-4 detectada namoro radioactivos em DLD-1 e HT-29 de células de linhas e forma pura, na presença não é de ou soro, como a banda de 90 kDa, intra e extracelularmente (Fig. 1d). No caso de Caco-2 Cells, a banda de 90 kDa pura Só detectado em extratos de células, enquanto que no Media celulares um extra no mmu por uma banda de datação radioativa de 50 kDa pura observado, provavelmente como resultado de sua própria atividade autocatalítica (Fig. 1d).

ADAMTS-5 detectado forma pura datação radioativa como uma banda de 74 kDa, em todas as três linhas de células cultivadas sob quaisquer condições (Fig. 1F). bandas adicionais de vários tamanhos, menor do que a forma da datação radioativa, PROSTITUTA observado nos extractos de células de HT-29 e principalmente de células Caco-2 células cultivadas na ausência de soro. Curiosamente, nenhum MMU é um pequeno grupo de qualquer namoro TAMANHO radioativo pura detectado na mídia de qualquer uma destas culturas de células. No entanto, ADAMTS-5 forma pura namoro radioactivos também detectado no meio extracelular, em células HT-29 cultivadas na presença de soro e em linhas de células DLD-1. Além disso, em células HT-29 cultivadas na presença de soro, as faixas adicionais de menor PROSTITUTA tamanhos também detectado no meio extracelular, sugerindo que o truncamento pós-tradução da enzima resultante quer da sua própria actividade ou actividade MMPs autocatalíticos.

Em contraste a todos os outros ADAMTSs estudado, ADAMTS-20 proteína não pura detectado nestas linhas celulares de cancro do cólon Três.

na expressão in situ de ADAMTS-1, -4, -5 e -20 por IHC

ADAMTS-1, -4, -5 e -20 na expressão in situ e localização Próximo puro analisada em secções de tecido do cólon de blocos embebidos em parafina, utilizando os anticorpos de PPro disso. coloração forte para ADAMTS-1 observados no cólon saudável pura, principalmente nas camadas musculares e no tecido de nnective entre as duas camadas (Fig. 2A, saudável). No CRC, ADAMTS-1 mostraram forte expressão no tecido muscular (seta na Fig. 2A, St. C) e Baixa expressão principalmente citoplasmática em células de câncer de espécimes fase C. Reduzida ou nenhuma coloração para ADAMTS-1 observados em amostras de tecido muscular puras da fase B (Fig. 2A, St. B) e em outras fases de amostras (C e D), respectivamente. A coloração para ADAMTS-4 no tecido do cólon saudável observada nos puros Duas camadas de Muscularis Externa e não na BMU cosae (Fig. 3A, saudáveis). câncer precoce em estágios, as etapas e B, ADAMTS-4 exibiu um padrão de expressão semelhante à ADAMTS-1, uma vez que mostrou coloração em estroma (setas na Fig. 3A, St., St B) e bastante mais fraca ou nenhuma mancha no câncer As células (pontas de seta na Fig. 3A e B St. St., respectivamente). No entanto, em espécimes de estágios C e D, as células cancerosas mostraram expressão citoplasmática derable Clara de ADAMTS-4 (setas na Fig. 3A St. C e D e suas inserções St., respectivamente). Além do mais, menos ou nenhuma expressão de ADAMTS-4 estroma puro observada nas amostras de células nas fases C e D, respectivamente (setas na Fig. 3A e St. St.C D, respectivamente). Quanto ADAMTS-5, Low coloração bastante puro observadas na camada longitudinal do Muscularis Externa em amostras de cólon saudável (seta na Fig. 3B, saudável). No CRC, nenhuma coloração para ADAMTS-5 observado tanto em puro ou estroma em células epiteliais neoplásicas, palco dos espécimes (seta e ponta de seta na Fig. 3B, St.A, respectivamente), enquanto expressão de ADAMTS-5 pura detectados no estroma células de espécimes, fase B (seta na Fig. 3B, St. B). Como ADAMTS-4, ADAMTS-5 também exibiu forte coloração citoplasmática em células de câncer de estágio C e amostras D (pontas de seta na Fig. 3B St.C St. e D, respectivamente) e nenhuma expressão no estágio estromal D. Finalmente, ADAMTS- 20 também exibiu baixa coloração na camada longitudinal do Muscularis externa em espécimes saudável cólon (Fig. 2B, saudáveis), enquanto que no CRC-lo puro detectada apenas em células de cancro de fase B e principalmente de espécimes fase C (pontas de seta na Fig. 2B, St. St.B e C, respectivamente).

tecido do cólon saudável e cólon canceroso da fase B e C, corado para ADAMTS-1 (a) e ADAMTS-20 (B). (A, ampliação, x4, localização anatômica, ceco, ampliação, x4, localização anatômica, ceco, ampliação, x4, localização anatômica, reto e B, ampliação, x4, localização anatômica, ceco, ampliação, x20, localização anatômica, ceco, ampliação, x20, localização anatômica, o reto). Inserções de A e B (todas ampliação, x10) mostram a mucosa e não bmucosa camada. As setas no cólon saudáveis ​​mostram a expressão de ADAMTS no tecido muscular. Setas em dois pontos canceroso mostrar a expressão de ADAMTS em estroma, enquanto setas mostram a expressão de ADAMTS em células cancerosas.

tecido do cólon saudável e cólon canceroso da fase A, B, C e D, corada para ADAMTS-4 (A) e ADAMTS-5 (B). (A, ampliação, x4, localização anatômica, ceco, ampliação, x10, localização anatômica, ceco, ampliação, x20, localização anatômica, ceco, ampliação, x4, localização anatômica, reto, ampliação, x20, localização anatômica, reto e B, ampliação, x4, localização anatômica, ceco, ampliação, x10, localização anatômica, ceco, ampliação, x20, localização anatômica, ceco, ampliação, x4, localização anatômica, reto, ampliação, x10, localização anatômica, o reto), corada para ADAMTS- 5. As inserções de mostrar a mucosa e não bmucosa camada no cólon saudável (ampliação, x 10) e a localização citoplasmática de ADAMTS-4 células de cancro na fase C e D (ampliação, X20 e X40, respectivamente). Inserções mostram B da Mucosa e não bmucosa camada sobre o cólon saudável (ampliação, x10) e a localização citoplasmática de ADAMTS-5 em células de câncer de fase C (ampliação, x20). As setas no cólon saudáveis ​​mostram a expressão de ADAMTS no tecido muscular. Setas em dois pontos canceroso mostrar a expressão de ADAMTS em estroma, enquanto setas mostram a expressão de ADAMTS em células cancerosas.

Expressão

ADAMTSs em tecidos de cancro do cólon

análises RT-PCR.

Os níveis de ARN de ADAMTSs PROSTITUTA examinados no ceco Saudável, sigmóide e reto. De todas as proteases investigados, ADAMTS-1 mostrou a expressão mais alta (mais que o dobro do Controle Interno GAPDH), enquanto ADAMTS-5 o menos puro protestantes expressa provocação (quase nível em Zero fighter) (dados não mostrados). RT-PCR indicaram que o

ADAMTS-1 | puro sub-regulada em amostras de cancro de qualquer fase em relação ao cólon saudável, com o maior de vinco a cerca de 20% nas amostras de fase (Fig. 4A). Esses dados estão de acordo com estudos anteriores, onde

ADAMTS-1 | havia sido encontrado para produzir regulados negativamente em muitos tipos de câncer [21, 22]. Um padrão de expressão Diferente de

ADAMTS-1 | pura observada para

ADAMTS-4

e-

5

, que PROSTITUTA Encontrado para produzir sobre-expressos em espécimes fase C; quase 14 vezes e 20 vezes em relação ao tecido saudável cólon, respectivamente (Fig. 4C, E). Estes PROSTITUTA de dados de acordo com estudos anteriores em outros tipos de câncer, onde e -5 tinha sido encontrado ADAMTS-4 para produzir sobre-expressos de modo a degradar proteoglicanos ECM, tais como agreecan e versicam para espalhar a invasão da célula cancerosa litate [24, 25 ]. Seguindo o mesmo procedimento protestante experimental para

ADAMTS-20

,-lo puro Encontrado elevada no estádio A e amostras de B em comparação com os tecidos saudáveis, 50% e 100%, respectivamente, mas no estádio C amostras que exibiram um de vinco para 20% (Fig. 4G).

semi-Qu de Antioquia tativo de RT-PCR a análise de (a) ADAMTS-1, (C) ADAMTS-4 (e) ADAMTS-5 e (G) ADAMTS-20. Os valores são a GAPDH-normalizado média ± S.D. distribuição das proteínas de (B) ADAMTS-1 (D) ADAMTS-4, (F) e da ADAMTS-5 (H) ADAMTS-20. *

P

≤0.05; diferenças estatisticamente significativas em relação aos tecidos saudáveis. **

P

≤0.05; diferenças estatisticamente significativas em relação ao estágio A. ***

P

≤0.05; diferenças estatisticamente significativas em relação ao encenar B. Ceco Saudável, cólon sigmóide e reto tecidos são mostrados;

O C-

: estágios CRC de Duke. Setas ndicate da migração em massa de marcadores moleculares. PBS, GdnHCl e Triton são as soluções de extração seqüencial usados ​​(mais suave do texto).

Analisa

Western Blot.

ADAMTS-4, -5 e -20 PROSTITUTA detectado no ceco, sigmóide e reto, enquanto ADAMTS-1 puro detectado Apenas em sigmóide e ceco. No entanto, eles diferem na sua extratabilidade revelando diferentes tipos de interações e /ou localização dessas enzimas dentro do tecido do cólon.

ADAMTS-1 Apenas pura detectado em PBS e GdnHCl /Triton extractos saudáveis ​​de sigmóide e ceco, como a banda de 120 kDa e 11 kDa, respectivamente, representando a forma latente da enzima e os produtos incompletos de síntese, enquanto que nenhum dos extractos continha a forma datação radioativa (80 kDa) da enzima. (Fig. 4b). ADAMTS-1 forma pura latente também detectado em ceco canceroso da fase B, usando o di sso criativa que condições mostrando que interagiram com componentes da MEC, como TIMP-3 ou A2 macroglobulina, que mantiveram a enzima na sua forma inactivada. No reto da fase canceroso-lo puro C detectada em GdnHCl como extractos de o fragmento de 35 kDa, possivelmente resultante da actividade MMPs (Fig. 4b). Figura A pura diferente obtidos a partir de sigmóide, Onde ADAMTS-1 puro Não detectadas em qualquer tipo de câncer palco. Assim, poderia produzir afirmou que ADAMTS-1 Papel no CRC depende na medida Grande no site anatômica.

Para o Continuar, a forma latente de ADAMTS-4 pura detectado em Triton Extractos de todos os três locais anatômicos cólon saudável como uma banda de 110 kDa. No entanto, em PBS e GdnHCl extratos de ambas ceco e no recto, sob a forma de encontros radioactivo da enzima (90 kDa) e vários fragmentos de vários tamanhos moleculares e dois fragmentos distintos de 60 kDa e 70 kDa PROSTITUTA detectados, respectivamente (Fig. 4D). Pelo contrário, ADAMTS-4 puro detectada na etapa B e C espécimes principalmente na sua forma namoro radioactivos. Nos espécimes ceco, fase B, a forma de datação radioativa da enzima pura detectado em PBS e GdnHCl Extractos, enquanto em amostras reto fase C, exceto para a forma datação radioativa que pura Encontrado em PBS Extractos, uma banda adicional de 110 kDa, o que representa a sua forma latente , puro, também detectada em todos os extratos da árvore.

seguindo o mesmo procedimento protestante experimental, ADAMTS-5 datação radioativa observada na forma pura e PBS GdnHCl extractos saudáveis ​​de cólon, mas também de todos os estágios do câncer, no entanto, com a fase-Related imunorreatividade aumentada (Fig. 4F).

Finalmente, análise de western blot revelou a presença de forma latente de ADAMTS-20 (161 kDa) nas PBS e GdnHCl extratos dos anatômicas três locais de tecidos saudáveis, sendo sigmóide contendo os montantes mais baixos. Interessantemente, ele também puro detectado cancro em todas as fases, no entanto com as diferenças na sua extractabilidade e nas formas moleculares. Nos espécimes fase sigmóide, a forma latente da enzima detectada em extractos puros de PBS, indicando que existia bastante livremente nesse tecido. ADAMTS-20 fragmentos detectados em PROSTITUTA GdnHCl e GdnHCl /Triton Extractos (Fig. 4H). Extratos de GdnHCl em amostras de ceco, fase B, o fragmento único de 60 kDa de puro obtido, enquanto em PBS e GDN-HCl extratos de espécimes reto fase C, uma menor fragmento adicional de 50 kDa de pura obtida.

Discussão

Acumulando e vidência de ADAMTSs implicação em malignidades humanas tem demonstrado seu significativo papel na progressão do tumor [21, 24, 25]. A sobre-expressão destas proteases é consistente com os requisitos das células de carcinoma para remover proteoglicanos de ECM, tais como agrecano e versicano, como um mecanismo complementar para a degradação de colagénio por colagenases e gelatinases. Por conseguinte, o aumento da expressão de versicam tem sido observada em neoplasias do cólon e do recto [26, 30]. informação adicional significativa daria o estudo da expressão ADAMTSs no CRC, uma vez que a degradação potencial do versicam resultaria em datação radioativa fragmentos versican com papéis estabelecidos na progressão tumoral [14]. Por outro lado, alguns membros da família ADAMTSs, os relatados como tendo um potencial papel anti-angiogénico, foram silenciadas epigeneticamente encontrado em vários tipos de cancro, incluindo o CRC [12]. Neste estudo, a possibilidade de modulação de ADAMTS-1, -4, -5 e -20 distribuição e expressão no câncer de cólon em comparação com cólon saudável pura investigado.