Abstract

O tipo 2 transmembrana serina-protease matriptase é amplamente expresso em carcinomas humanos e cancros hematológicos. A actividade proteolítica de matriptase é um alvo potencial de medicamentos e sondas de imagem. Avaliamos o destino de matriptase ativa após a indução da activação matriptase zymogen. Expondo oito células de carcinoma humano a pH 6,0 induzida robusta activação zimogénio matriptase seguido por inibição rápida da matriptase nascente activo por factor de crescimento de hepatócitos inibidor de activador (HAI) -1. Por conseguinte, não matriptase enzimaticamente activa foi detectada nestas células. Alguns matriptase activo é, no entanto, derramou-se rapidamente para o meio extracelular por estas células de carcinoma. A falta de matriptase ativo associado à célula e o derramamento de matriptase ativo também foram observadas em duas linhas de câncer hematológico. Matriptase derramamento está correlacionada de perto com a indução da activação do matriptase, sugerindo que a activação matriptase e derramamento são cineticamente acoplado. O acoplamento permite que uma proporção de matriptase ativo para sobreviver HAI-1 inibição por derramamento rápido da superfície celular. Nosso estudo sugere que celular livre, matriptase ativa é escassa e pode não ser um alvo eficaz para

in vivo

de imagem e desenvolvimento de medicamentos

Citation:. Chu LL, Xu Y, Yang JR, Hu YA, Chang HH, Lai HY, et ai. (2014) células cancerosas humanas Manter níveis modestos de enzimaticamente activa matriptase Apenas em Extracelular Milieu seguinte Indução de Zimogénio Activation. PLoS ONE 9 (3): e92244. doi: 10.1371 /journal.pone.0092244

editor: Jian Cao, Stony Brook University, Estados Unidos da América

Recebido: 10 Janeiro, 2014; Aceito: 09 de fevereiro de 2014; Publicação: 24 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo National Cancer Institute (NCI) Grants SR1 CA 123223 (para M. Johnson e C.-Y. Lin); Departamento de Taiwan Defesa Grant MAB-102-08 (a J.-K. Wang); e concessão Chi Mei-Medical Center CMNDMC-10211 (para J.-K. Wang e L.-L. Chu). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. C.-Y.L. é um inventor em patentes US # 6077938 e # 6677377 e M.D.J. e C.-Y.L. são inventores sobre a patente US 7355015 #. Isto não altera a adesão dos autores para as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

As proteases catalisam a quebra de proteínas pela hidrólise de ligações peptídicas. Através da clivagem regulada de proteínas, proteases estão envolvidas em muitos processos fisiológicos altamente controlada, tais como a replicação do ADN, a progressão do ciclo celular, a morte celular, a angiogénese, a coagulação sanguínea, inflamação, neurogénese e imunidade. desregulação da protease tem sido implicada numa ampla variedade de doenças, incluindo o cancro e desordens cardiovasculares. As proteases estão, por conseguinte, considerado como alvos eficazes para o desenvolvimento de drogas e como alvos biomarcadores. Os inibidores do proteassoma, por exemplo, têm sido utilizados para tratar doenças malignas hematológicas [1], [2], e os níveis séricos de PSA de protease (antigénio específico da próstata) têm sido utilizados como um biomarcador para a monitorização do cancro da próstata em vários contextos [3]. A invenção de sondas baseados em atividade (ABP) permite a avaliação da actividade protease dentro de células vivas ou em organismos inteiros [4]. Apesar do sucesso de algumas drogas e sondas, contudo, tendo como alvo a actividade proteolítica para o desenvolvimento de drogas e biomarcadores nem sempre tem sido muito satisfatória. Tão atraente como eles são, diagnósticos e terapias proteases de inspiração tem muitas complexidades e limitações que precisam ser levados em consideração antes de desenvolver novos medicamentos ou sondas de segmentação proteases e proteases atividades inerentes. Estas limitações incluem o estado activational das proteases, a localização funcional das proteases, e inibidores de proteases endógenas, todos os quais afectam a actividade das proteases e pode, por sua vez afecta a eficácia do inibidor de protease e sondas.

O tipo 2 transmembrana serina-protease (TTSP) matriptase é um exemplo particularmente interessante dos desafios que a protease pode apresentar sobre a sua escolha como um alvo para o desenvolvimento de aplicações clínicas e as estratégias que podem ser necessários para empregar eficazmente inibidores de e sondas para a atividade matriptase . Matriptase é amplamente expresso por tecidos epiteliais e de facto é necessário para a manutenção da integridade do epitélio [5] – [7]. Matriptase é comumente desregulado em carcinomas através da expressão elevada, o aumento de activação do zimogénio, e um desequilíbrio na expressão de matriptase em relação ao inibidor de factor de crescimento de hepatócitos activador (HAI) -1, o inibidor de protease endógeno principal de actividade matriptase [8] – [10] . Em adição às células epiteliais, matriptase também é expresso em monócitos [11] – [13], mastócitos [14], condrócitos [15] e células progenitoras neurais [16], e matriptase tem sido implicada na osteoartrite [15] e aterosclerose [13]. A expressão de matriptase em mastócitos sugere que matriptase tem o potencial para contribuir para doenças relacionadas com alergias, tais como asma. Vários inibidores catalíticos matriptase têm sido desenvolvidos, incluindo pequenas moléculas e inibidores com base em peptídeos. Estes inibidores matriptase apresentam grande potência contra a atividade matriptase quando testado usando

in vitro

ensaios que, na maioria dos casos, fizeram uso de matriptase recombinante de domínio serina-protease [17] – [22]. inibidores à base de anticorpos dirigidos especificamente contra a matriptase activo (em oposição à forma de zimogénio) também têm sido desenvolvidos [23], e usado para detectar tumores em ratinhos através de ligação a matriptase activa na superfície de células cancerosas [24], [25].

matriptase é sintetizado como um zimogênio e sofre autoactiva�o para adquirir a sua actividade tipo tripsina potente. A activação de matriptase é rapidamente seguido pela inibição da matriptase activa a proteína nascente por HAI-1 e permanece ligado às células através do domínio de transmembrana de HAI-1. Não está claro o quanto e por quanto tempo nascente livre matriptase ativa persiste na superfície da célula: parâmetros que são importantes para qualquer justificação para o desenvolvimento de inibidores e sondas baseadas em atividades matriptase para aplicações clínicas. No estudo atual, partimos para avaliar o destino de matriptase ativa após a indução da activação matriptase zymogen no carcinoma humana e células cancerosas hematológicas. Independentemente da extensão da activação do zimogénio matriptase induzida, não, matriptase activa livre foi encontrada a persistir nas células cancerosas. É interessante notar, no entanto, uma pequena proporção do matriptase activa sobrevive HAI-1 por inibição sendo rapidamente verter para o meio extracelular. O nosso estudo sugere que, devido à falta de livre matriptase activo presente na superfície de células cancerosas, a actividade catalítica é improvável matriptase para apresentar um alvo eficaz para aplicações clínicas.

Materiais e Métodos

Chemicals e reagentes

Gelatina e 5,5′-ditio-bis- (2-nitrobenzóico) (DTNB) foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO); N-terc-butoxicarbonilo (Boc) -Gln-Ala-Arg-7-Amido-4-metilcumarina (AMC) foi adquirida a partir de Life Sciences Enzo (Farmingdale, Nova Iorque); de soro bovino fetal (FBS) foi obtido a partir de Omega Scientific (Tarzana, CA).

culturas de células

células de cancro da mama humano MCF7 e MDA-MB-468 foram mantidas num mínimo essencial modificado melhorado Médio (IMEM), suplementado com 10% de FBS. células de cancro da próstata humano LNCaP, PC3 e DU145, células de cancro do ovário humano OVCAR-3, células de mieloma múltiplo humano de células RPMI 8226 e células de linfoma de Burkitt humanas Ramos foram cultivadas em meio RPMI-1640, suplementado com FBS a 10%. células de cancro da mama humano as células cancerosas do ovário humano OV-2008 SK-BR-3, queratinócitos HaCaT humanos, e foram mantidas em meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), suplementado com 10% de FBS. As células foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2. Todas as células foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, Virginia), excepto HaCaT (CLS linhas celulares Service GmbH, Alemanha Eppelheim) e OV2008 (gentilmente fornecido pelo Dr. Caetano Marverti, Universidade de Modena e de Reggio Emilia, Itália) [26] .

Os anticorpos monoclonais

Os anticorpos monoclonais humanos matriptase M24 e M69 foram usados ​​para immunoblot análises para detectar matriptase total e matriptase activado, respectivamente [27] – [29]. O mAb M69 imobilizado em esferas de Sepharose foi utilizado para os estudos imunodepleção.

ensaio da actividade de Tryptic após a indução da activação de zimogénio matriptase

Para a indução da activação do zimogénio matriptase em células de carcinoma, as células foram cultivadas em 150 mm pratos ou placas de 6 poços. As células foram lavadas três vezes com PBS e depois incubadas durante 20 minutos à temperatura ambiente com 150 mM de tampão de fosfato de pH 6,0 (7 ml para 150 pratos mm e 1 ml para placa de 6 poços) ou 150 mM de tampão de fosfato de pH 8,0 como um não controle -activation. Em alguns casos, o PBS foi usado como o controlo não-activação. Após a incubação, adicionou-se base de Trizma a 2 M para ajustar o pH a 8,0. As células foram raspadas dos pratos ou poços para se obter uma suspensão combinada contendo uma mistura de células e proteínas derramado. Uma parte desta mistura foi submetida a centrifugação a 10.000 rpm utilizando uma mesa centrífuga Eppendorf durante 1 min. O sobrenadante foi recolhido como fracção vertente e o sedimento celular foi ressuspenso em tampão de fosfato 150 mM, pH 8,0 para o mesmo volume que a amostra antes da centrifugação, para se obter a fracção de células. O procedimento de demolição das células a partir do disco e processamento por centrifugação dose não resultar na liberação de matriptase ou HAI-1 das células. O procedimento foi concebido para gerar a célula e tampão condicionado sob condições idênticas, com respeito ao pH e força iónica no tampão de ensaio para a proteolítica. Para as duas células cancerosas hematológicas que crescem como culturas em suspensão, a proporção do número de células em relação ao volume do tampão de fosfato foi de 5 × 10

5 células /200 ul de tampão. A actividade matriptase em 195 ul das fracções vertente e celular foi avaliada através da medição 7-amino-4-metilcumarina libertação (AMC) a partir de um substrato sintético Boc-Gln-Ala-Arg-AMC (5 ul de uma solução stock de 5 mM) em microf luorescência com 96 poços placas de microtitulação pretas (Thermo Scientific). A clivagem do substrato fluorogénico sintético foi registado utilizando um Wallac 1420 Victor 2 leitor de microplacas com um comprimento de onda de excitação de 360 ​​nm e detectando a emissão a 480 nm.

imunodepleção

O mAb M69 foi acoplada covalentemente a Sepharose 4B, a 5 mg /ml de gel, como descrito anteriormente [28]. Para imunodepleção, as amostras (200 ul) foram incubados com 15 ul de M69-Sepharose rotativa na sala fria durante 2 horas. O sobrenadante foi separado das pérolas por centrifugação e recolhido como fracção não ligada. As esferas foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 1% de Triton X100 a quatro vezes, após o que as proteínas capturadas foram eluídas a partir das pérolas com tampão de glicina 0,1 M pH 2,4, seguido de neutralização com uma base de Trizma. 2 H

Western blotting

As células foram lisadas em PBS contendo 1% de DTNB Triton X-100 e 1 mM. DTNB foi adicionado ao tampão de lise para impedir a clivagem de ligações dissulfureto [30]. A concentração de proteína foi determinada pelo ensaio de proteína de Bradford e quantidades iguais de proteínas ou proporções iguais de lisados ​​celulares e tampões condicionados foram analisados ​​por Western blot. As amostras de proteína foram diluídas em tampão de amostra contendo 5 × nenhum agente redutor e incubou-se à temperatura ambiente durante 5 min. As proteínas foram resolvidas por 7,5% SDS-PAGE, transferidos para membranas de nitrocelulose, e depois sondado com os vários mAb. A ligação de mAbs foi detectada usando HRP anticorpos secundários conjugados, e visualizada utilizando Ocidental Lightening® Quimioluminescência Reagente Plus (Perkin-Elmer, Boston, MA).

Gelatina zimografia

géis de gelatina foram lançados pela adição de gelatina (concentração final de 1 mg /ml) para 7,5% de gel de poliacrilamida SDS. As amostras de proteína foram incubadas com tampão de amostra de SDS à temperatura ambiente durante 5 min na ausência de um agente redutor. Após a electroforese, os géis de gelatina foram lavadas com 2,5% de Triton X-100 /PBS três vezes e em seguida incubadas in100 mM de Tris pH 8,0 a 37 ° C durante a noite. Os géis foram então coradas com Coomassie Brilliant Blue.

Resultados

células cancerosas da mama MCF7 ativar constitutivamente matriptase mas o matriptase activa livre não permanece associado às células

A fim para começar a determinar se a actividade matriptase proteolítica associada com células de cancro da mama pode ser utilizado como um alvo para o desenvolvimento de drogas e /ou sondas de imagem, medimos a clivagem do substrato Boc-Gln-Ala-Arg-AMC pelo cancro da mama MCF7 células antes e após a indução da activação robusta matriptase zimogénio (Fig. 1A). Matriptase activação zimogénio aparentemente ocorre constitutivamente em células MCF7 uma vez que a 120-kDa matriptase-Hai-1 complexo foi facilmente detectada em adição ao 70-kDa matriptase zimogénio em lisados ​​de células antes da indução da activação do matriptase zimogénio (Fig. 1A pista 1) . Após a indução da activação do zimogénio matriptase por exposição das células ao tampão de pH 6 durante 20 min [27], [31], [32], a maior parte do zimogénio matriptase 70k-Da foi convertido para o 120-kDa matriptase-HAI- um complexo (Fig. 1A pista 4). A seguir, mediu a quantidade de actividade associada com tríptica MCF7 sob condições constitutivas ou induzidas por ácido, que dá os dois níveis diferentes de activação matriptase. Dada a possibilidade de que o HAI-1 pode ligar-se a e inibem a matriptase activo após ambas as proteínas foi libertada a partir da membrana celular, foi medida a actividade triptica associado com a superfície das células na ausência do detergente não iónico Triton X-100 . Sob estas condições, há apenas qualquer clivagem dos substratos fluorescentes por as células MCF7 se activação matriptase era constitutiva ou induzida por exposição robustamente ácido (Fig. 1B, a curva 1 e 4). Estes dados sugerem que estas células de cancro da mama não retêm livre, matriptase ativa, independentemente dos níveis de ativação matriptase zymogen.

A.

Células de cancro da mama humano MCF7 foram incubadas com um tampão de pH 6 para induzir a ativação matriptase zymogen (

a.

direita, Act.) ou com o tampão de pH 6 suplementado com NaCl 150 mM como um controle não-ativação (

a.

esquerda, não-ato .). Prepararam-se lisados ​​de células, e amostras retidas para análise (pistas 1 e 4). Os lisados ​​de células remanescentes foram submetidos a imunodepleção com o específico matriptase-activo mAb M69 imobilizado em esferas de Sepharose para esgotar a matriptase activados, predominantemente do complexo 120-kDa (pistas 2 e 5, e D). O matriptase activado anticorpo ligado foi recuperado por eluição com tampão de um pH de 2,4, seguido por neutralização de pH (Pista 3, E). Estas amostras foram então analisadas por espécies matriptase por SDS-PAGE (sem fervura das amostras ou utilizando agentes redutores) e por Western blot utilizando o mAb matriptase total de M24.

B.

Das células, os lisados ​​Imunodeprimido, e os produtos de eluição foram ensaiadas por clivagem tríptica actividade de um substrato fluorogénico sintético com Arg como local P1. Para o ensaio de tríptica, as células permaneceram intactas na ausência de Triton X-100. NA significa não activação; L para o carregamento de imunodepleção, D para a fração Imunodeprimido; E para o fraco elua; A para a activação; RFU para a unidade fluorescente relativa.

A falta de livre matriptase, ativo associado com as células é devido à rápida inibição da matriptase ativa por HAI-1. Anteriormente, gerado um anticorpo monoclonal que matriptase reconhece especificamente e liga-se à forma activada de matriptase (se é ou não é num complexo com HAI-1), sem-reacção cruzada com matriptase zimogénio [33], [34]. Utilizou-se este mAb, M69, acoplado a esferas, para remover qualquer matriptase activado que estava presente nos lisados ​​de células por imunodepleção. Como esperado, a 120-kDa matriptase-Hai-1 complexo foi eficientemente removido a partir dos lisados ​​celulares MCF7 por este processo (fig. 1A, comparando pistas 2 e 5 com pistas 1 e 4, respectivamente). O 70-kDa proteína matriptase banda presente em ambas as amostras não foi esgotada pelo mAb matriptase activado, o que indica que a banda de proteína de 70 kDa matriptase em ambas as preparações contém pouco ou nenhum matriptase activa e é matriptase zimogénio. Como esperado, as amostras Imunodeprimido não tinha actividade de clivagem contra o substrato fluorescente (Fig. 1B). As espécies activadas matriptase ligada às pérolas mAb M69-Sepharose usado para immunodeplete as amostras foram eluídas usando pH 2,4 tampão de glicina. Mostrámos previamente que este tampão de ácido provoca a dissociação da matriptase-Hai-1 complexo [33]. Neutralização tipicamente resulta na re-associação de algumas das IAH-1 e activa matriptase deixando o resto do matriptase activo dissociado na forma não complexada, após neutralização do eluato, com o resultado de que a matriptase activa foi detectada por análise de transferência de Western utilizando matriptase um total de mAb predominantemente como uma banda de 70-kDa. A intensidade desta banda matriptase activa 70-kDa foi proporcional à intensidade da 120-kDa matriptase-Hai-1 banda complexo detectado em ambas as situações (Fig. 1A, pistas 3 e 6). Esta actividade dissociado matriptase tríptica exibiu activo tal como avaliado por clivagem do substrato fluorogénico (Fig. 1B, a curva 3 e 6). As taxas de clivagem do substrato observado bem correlacionada com os níveis da matriptase activa detectada por análise de Western blot. Estas análises confirmam que as espécies matriptase associados a células 120-kDa é um complexo matriptase ativa inactivado e que a espécie eluída 70-kDa é realmente matriptase ativa.

A proporção de matriptase ativa foi derramado para o meio extracelular

apesar da rápida inibição HAI-1-mediada do matriptase activo associado com a célula, matriptase livre activo foi, de facto, verter para o meio extracelular antes de HAI-1 de inibição (Fig. 2). Quando as células de cancro da mama MCF-7 foram transitoriamente exposto a tampão de pH 6,0, seguido por neutralização até pH 8,0, forte actividade tríptica contra o substrato fluorescente foi detectado na mistura de células e os tampões condicionados (derramado fracção) (Fig. 2A). Quando as células e as fracções foram separadas vertente, a actividade triptica foi apenas detectada nas fracções vertente (sobrenadante) e não associadas com os sedimentos de células. Estes dados indicam que, juntamente com a indução da activação do zimogénio matriptase, algumas proteases activas com actividade tríptica são derramadas para o meio extracelular. Para abordar a questão de saber se esta actividade proteolítica derramado é derivado de matriptase activo determinou-se se poderia M69-grânulos immunodeplete a actividade das amostras (Fig. 2B e C). Imunodepleção do material derramado a partir das células tratadas com controlo não resultou numa alteração significativa na intensidade da banda matriptase 70 kDa (Fig. 2B, pistas 1 e 2) e não matriptase foi detectado no material eluído a partir das drageias (Fig . 2B, pista 3), consistente com ausência ou baixo nível de galpão livre, matriptase activa nestas condições. Em contraste, após activação matriptase induzida por ácido, a depleção com os M69-grânulos reduziu significativamente os níveis do total matriptase presente na fracção barracão (Fig. 2B, comparar pista 5 a pista 4), e uma banda forte matriptase 70 kDa é presente no eluato a partir das drageias (Fig. 2B, coluna 6). Isto é consistente com a presença de livre, matriptase activa no buffer condicionado das células em que a activação matriptase tinham sido induzidas por exposição de ácido. Quando ensaiados quanto à actividade triptica utilizando o ensaio de substrato fluorogénico verificou-se que a actividade proteolítica foi dramaticamente reduzida após imunodepleção (Figura 2C, compare as curvas A-L e A-D), confirmando que a maioria da actividade tríptica presente na fracção vertente foi atribuível ao livre, matriptase ativa. A presença de matriptase activo na fracção vertente foi ainda confirmada pela detecção de uma actividade gelatinolítica 70 kDa na fracção barracão (Fig. 2D, faixa 1) e o esgotamento da gelatinase de 70 kDa por os grânulos de mAb matriptase activadas (Fig . 2D, faixa 2). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que, embora MCF7 células de cancro da mama constitutivamente activar matriptase sob condições normais, a grande maioria da matriptase activa é rapidamente inibida por HAI-1 embora uma pequena proporção de enzima activa pode ser rapidamente verter para o meio extracelular. O derramamento de matriptase activo para o meio extracelular, desta forma é consistente com a detecção de matriptase ativa nos meios condicionados de células de cancro da mama em nosso estudo anterior [35].

A.

As células MCF7 foram induzidas para activar matriptase por um tampão de pH 6,0, seguido por neutralização até pH 8,0. A mistura das células e o tampão (Combinar), as células peletizadas após centrifugação (celular), e o sobrenadante tampão (derramado fracção) sozinho (Shed) foram analisadas relativamente à actividade triptica por clivagem de um substrato fluorescente sintético com Arg como local P1 . RFU significa unidade fluorescente relativa. B. A vertente fracções recolhidas a partir de células MCF-7 após a indução da activação matriptase (Act.) E o controle não-ativação (Non-act.) Foram submetidos a imunodepleção com matriptase ativada esferas de mAb M69. As fracções vertente (L, pistas 1 e 4), as fracções empobrecido (d, pistas 2 e 5) e as fracções eluídas (E, pista 3 e 6) foram analisados ​​para espécies matriptase por Western blot utilizando o mAb M24.

C.

E

D.

A fração galpão coletadas de pH 6 células MCF7 expostos-tampão foi Imunodeprimido usando esferas M69. A fracção barracão (G, pista 1) e a fracção Imunodeprimido (D, pista 2) foram analisados ​​para a actividade tríptica (painel

C

) e actividade gelatinolítica por zimografia de gelatina (painel

D

, Gel. Zym.). RFU meios unidades fluorescentes relativas; A-G para activada de carregamento; A-D para-activated empobrecido.

Para determinar se outras células de cancro da mama que expressam matriptase também regulam matriptase de uma maneira semelhante para as células MCF-7, foram analisadas amostras geradas utilizando MDA-MB-468 e SK células BR-3 do cancro da mama, em condições normais de crescimento e, quando submetidos a activação zimogénio matriptase induzida por ácido. espécies matriptase e atividade proteolítica foram avaliadas como antes através de uma combinação de teste de fluorescência de clivagem do substrato, imunodepleção e análises de imunotransferência (Fig. 3). Semelhante a células MCF7, células MDA-MB-468 activar constitutivamente matriptase (Fig. 3a, via 1), e pode ser induzido para ativar de forma robusta matriptase seguido pela rápida inibição HAI-1-mediada, em resposta à exposição celular ao tampão levemente ácida (Fig . 3a, via 2). O 120-kDa matriptase-Hai-1 complexo é especificamente Imunodeprimido utilizando as esferas activadas mAb matriptase (Fig. 3a, via 3) e a maioria do matriptase activa livre dissociada-ácido foi eluida e permaneceu não complexado seguinte neutralização (Fig. 3 pista 4 ). actividade triptica foi detectada apenas nas fracções vertente e não nas fracções de células (Fig. 3B), a maioria das quais foi Imunodeprimido com a matriptase activado mAb M69 (Fig. 3C), confirmando a presença de matriptase activo no meio extracelular. As células terceiro câncer da mama, SK-BR3 assemelha MCF7 e MDA-MB-468 com respeito à activação matriptase induzida por ácido (Fig. 3D, pista 1), imunodepleção, e a eluição da matriptase activado não complexado a partir das pérolas de mAb matriptase activados ( Fig. 3D, pistas 2 e 3). Mais uma vez, a actividade triptica gerado juntamente com a indução da activação do zimogénio matriptase foi derramado e não retida com as células (Fig. 3 E), e a maioria da actividade tríptica derramado foi derivado de matriptase activo (Fig. 3 F).

a

e

D

: MDA-MB-468 e SK-BR-3 células de câncer de mama humano foram induzidos para ativar matriptase (ou não) pelo pH 6 (ou controlo) tampão-exposição. Os lisados ​​celulares preparados a partir das células foram sujeitas a imunodepleção para remover matriptase activado. Os lisados ​​de células de controlo não activação (n), células activadas por ácido (A), o M69 empobrecido lisados ​​(D), e a fracção eluída (E) foram analisados ​​por total de espécies matriptase por imunotransf erência usando o matriptase mAb M24.

B Comprar e

E

. MDA-MB-468 (

B

) e SK-BR-3 (

E

) foram tratadas com tampão de pH 6,0 para induzir activação matriptase. Após a neutralização, mistura das células e o tampão (Combinar), as células peletizadas após centrifugação (celular), e o sobrenadante tampão (derramado fracção) sozinho (Shed) foram analisadas relativamente à actividade triptica.

C Comprar e

F

. Os lisados ​​celulares SK-BR-3 MDA-MB-468 e, por indução de activação pós preparados matriptase foram Imunodeprimido utilizando o mAb M69. Os lisados ​​celulares (A-L) e as frações Imunodeprimido (A-D) foram analisadas para a atividade tríptica.

Regulamento do matriptase na próstata e células de cancro do ovário

matriptase também é expresso no cancro da próstata, e as três linhas de cancro da próstata mais vulgarmente utilizados, DU145, PC3 e LNCaP todos expressam matriptase embora DU145 expressa muito menos do que as outras duas linhas (Fig. 4A, esquerda, pistas 1, 3 e 5). Todas as três linhas de activar matriptase em resposta à exposição ao ácido extracelular, conforme indicado pela presença do kDa matriptase-Hai-1 complexo 120 (Fig. 4A, esquerda, pistas 2, 4 e 6), que também é detectado quando as amostras são imunotransferidas usando a-activadas específicas matriptase mAb M69 (Fig. 4A, direita, pistas 2, 4 e 6). Ácido exposição das células também induziu a excreção de actividade tríptica para o meio extracelular pelas células PC3 e LNCaP, mas não por células DU145 (fig. 4 B-D). Tal como com as linhas celulares de cancro da mama, a maioria da actividade tríptica derramado derramado a partir de, o PC3 e LNCaP de células, confirmou-se ser associado com matriptase activo por imunodepleção como descrito acima (dados não mostrados). A falta de atividade tríptica detectável derramado pelas células DU145 aparece devido ao baixo nível de expressão matriptase nesta linha celular. Estes dados sugerem que as células de câncer de próstata se assemelham a células de câncer de mama em relação à inibição rápida HAI-1 mediada por matriptase ativo celular e para o derramamento de alguns níveis de matriptase activa livre para o meio extracelular.

A

. As células humanas de cancro da próstata DU145, (DU), PC3 (PC3) e LNCaP (LN) foram expostos a pH 6,0 (ou controlo) para induzir activação de tampão matriptase. Os lisados ​​celulares de células de pH 6-expostas (A, pistas 2, 4 e 6) e as células de controlo não activação (N, pistas 1, 3 e 5) foram analisados ​​para espécies matriptase totais (esquerda), utilizando o mAb M24 e ativado matriptase usando o mAb M69 (direita).

B

,

C

, e

D

. As células humanas de câncer de próstata, DU145 (

B

), PC3 (

C

) e LNCaP (

D

) foram tratados com tampão pH 6,0 para induzir activação matriptase. Após a neutralização, a combinação da célula e as fracções (combinar vertente), as fracções de células apenas (célula), e a fracção vertente sozinho (derramado) foram analisadas relativamente à actividade triptica. RFU meios unidades fluorescentes relativas.

Duas linhas celulares de cancro do ovário que expressam matriptase, OCAR3 e OV2008, também foram estudados e revelaram características idênticas no que diz respeito à activação matriptase induzida por exposição a tampão de pH 6,0 com o a rápida formação de complexos matriptase-Hai-1 activadas, que foram esgotados pelo mAb M69 (Fig. 5A). Nem a linha de células reteve actividade tríptica associada às células mas derramar a actividade no buffer, o que foi verificado ser derivado de matriptase activo por imunodepleção utilizando o mAb M69 (Fig. 5 B e C). O matriptase galpão apresentaram atividade gelatinolítica, que novamente foi esgotada pelo mAb M69 (Fig. 5D).

A

. células cancerosas do ovário humano OVCAR3 foram induzidas para activar matriptase pelo pH 6.0 (ou controlo) tampão. Os lisados ​​celulares foram Imunodeprimido com o mAb M69. Os lisados ​​celulares de células de controlo não activação (N, pista 1), as células activadas pH 6 (A, pista 2), e a fracção Imunodeprimido (D, pista 3) foram analisados ​​quanto à espécie matriptase por Western blot utilizando o mAb M24 .

B

. e C. As células frações (celulares), as frações de galpão (lançar) e as frações galpão depleção de matriptase ativados (empobrecem) de OVCAR3 (

B

.) e células OV2008 (

C

.) foram analisadas relativamente à actividade triptica. RFU meios unidades fluorescentes relativas.

D.

Células de cancro do ovário humanos foram induzidos OV2008 para ativar matriptase pelo pH 6.0. A fracção barracão (pista 1) e a fracção vertente empobrecido-matriptase activado (pista 2) foram analisados ​​para a actividade gelatinolítica matriptase por zimografia em gelatina.

A maioria da matriptase activado derramado por células cancerosas é hematológicas derramado como livre activo matriptase

matriptase também é expressa em células de câncer hematológico, mas, em contraste com as células de origem epitelial, eles não expressam ou níveis muito baixos de HAI-1 [36], [37]. Para explorar a activação matriptase ea dinâmica derramamento em cânceres deste tipo que transitoriamente expostos RPMI 8226 células de mieloma múltiplo humanos e de células de linfoma de Burkitt Ramos para pH 6,0 tampão seguido pelo ajuste do pH 8 com tampão Tris como tínhamos feito com os cancros epiteliais. Altos níveis de actividade tríptica foram detectados na mistura de células e o tampão (derramado fracção) (Fig. 6A), e quando as células e verter fracções foram separadas por centrifugação, a actividade triptica foi apenas detectada na fracção de abrigo, e não foi associada com as células. Além disso, a actividade triptica foi completamente removido quando as fracções vertente foram esgotados usando os grânulos mAb matriptase activados, confirmando que matriptase activa é a fonte da actividade tríptica detectado.

Um

e

B.

células de linfoma de Burkitt Ramos humanos (

a

) e RPMI 8226 células de mieloma múltiplo humano (

B

) foram tratados com tampão de pH 6,0 para induzir activação matriptase. Após a neutralização, a combinação da célula e a fracção barracão (combinar), a fracção de célula sozinho (célula), e a fracção vertente sozinho (derramado) foram analisadas relativamente à actividade triptica.

C Comprar e

D

.