Abstract
modelos de co-cultura estão actualmente a fazer a ponte entre as culturas clássicas e
In vivo
modelos animais. Explorando esta nova abordagem abre a possibilidade de imitar o microambiente do tumor
in vitro
, através do estabelecimento de câncer do estroma interações sinérgicas. Notavelmente, estes modelos organotípicas oferecer uma plataforma perfeita para o desenvolvimento e avaliação pré-clínica de nanocarriers candidatos carregados com drogas anti-tumorais em um modo de rastreio de alto rendimento, com menores custos e ausência de questões éticas. No entanto, esta avaliação foi até agora limitado a sistemas de co-cultura estabelecida com proporções celulares precisos, não abordando a heterogeneidade das células natural comumente encontrados em tumores diferentes. Portanto, aqui a eficiência nanocarriers multifuncional foi caracterizado por diversos sistemas de co-cultura de fibroblastos-MCF-7 que contêm proporções de células diferentes, a fim de desfazer os principais parâmetros de concepção que influenciam o desempenho nanocarrier e o resultado terapêutico. O estabelecimento bem sucedido dos modelos de co-cultura foi confirmada por a distribuição nos tecidos semelhante a das células diferentes em cultura. As nanopartículas de incubação nos vários sistemas de co-cultura revela que estes possuem nanocarriers segmentação especificidade para as células cancerosas, indicando a sua aptidão para ser utilizado nesta terapia de doença. Além disso, utilizando diferentes proporções de co-cultura, foram obtidos diferentes perfis de absorção de nanopartículas. Estas descobertas são de importância crucial para a futura concepção e otimização de novos sistemas de distribuição de drogas, uma vez que a sua capacidade real segmentação deve ser abordada nas populações de células heterogéneas, tais como aqueles encontrados em tumores
Citation:. Costa CE, Gaspar VM, Marques JG, Coutinho P, Correia IJ (2013) Avaliação de nanopartículas a captação de co-cultura modelos de cancro. PLoS ONE 8 (7): e70072. doi: 10.1371 /journal.pone.0070072
editor: Michiya Matsusaki, Universidade de Osaka, Japão
Recebido: 25 Janeiro, 2013; Aceito: 15 de junho de 2013; Publicação: 26 de julho de 2013
Direitos de autor: © 2013 Costa et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela Fundação Português para a Ciência e Tecnologia (FCT), SFRH /BD /80402/2011, PTDC /EME-TME /103375/2008, PTDC /EBB-BIO /114320/2009 e Pest-OE /EGE /UI4056 /2011. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
na última década, o desenvolvimento emergente da nanomedicina tem incentivado a sua aplicação rápida no desenvolvimento de várias estratégias para tratar doenças que prejudicam, que ainda são incuráveis [1]. Atualmente, os enormes avanços tecnológicos realizados na concepção e produção de sistemas nanoparticulados para a terapia de câncer se originou o resultado da eternidade nanocarriers proficientes e dirigidas a públicos específicos, que reduzem os efeitos colaterais associados com terapias anti-câncer clássicos e também aumentar a taxa de sobrevida do paciente [ ,,,0],2]. Muitas vezes composta por materiais inorgânicos ou orgânicos biocompatíveis, nanocarriers também são capazes de melhorar a biodistribuição e biodisponibilidade de fármacos, que de outra forma seria pouco disponível nos seus locais alvo [3]. A natureza flexível das nanopartículas está intimamente correlacionada com os vários materiais utilizados para a sua síntese, tais como metais (ouro e prata), cerâmica (hidroxiapatite), lípidos (colesterol e não-tóxicos fosfolípidos) e polímeros (alginato, quitosano, PEG,) [4]. Entre estes, o quitosano tem sido um dos mais extensivamente usado para a síntese de uma variedade de sistemas de administração de fármacos nanoparticulados, devido às suas propriedades únicas, como biocompatibilidade, estabilidade, facilidade de ser quimicamente modificado e baixa imunogenicidade [5]. Estas características únicas podem ser ainda adaptada pela funcionalização de superfície da partícula com moléculas específicas de células, tais como anticorpos, ácido fólico, biotina, ou aptâmeros [6], [7], que aumentam significativamente a especificidade nanocarrier em relação a células alvo, protegendo as células normais contra drogas -derived efeitos colaterais tóxicos [8].
no entanto, antes da infinidade de nanodispositivos atualmente sob investigação tornar-se adequado para o uso clínico, eles têm de superar testes rigorosos estabelecidos pelas agências reguladoras como Food and Drug Administration (FDA ) e da Agência Europeia de Medicamentos (EMEA). Incluídas nas várias etapas de avaliação que têm de superar nanotransportadores, ensaios de segurança e de actividade biológica assumir importância crítica no desenvolvimento de tubulação de nanopartículas [9], [10].
Em particular, para estes efeitos de teste, culturas de células surgir como um excepcionalmente potente e econômica ferramenta, em comparação com
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modelos. Na verdade, eles oferecem uma plataforma de teste exclusivo para investigar os efeitos de diferentes formulações de medicamentos e design de nanopartículas, sob altamente controlado e condições reprodutíveis [11]. Além disso, as culturas de células fornecem uma maneira fácil de manipular inúmeras variáveis experimentais, de modo a reproduzir alguns dos
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condições, evitando questões éticas e legais associadas com a manipulação de animais [12]. No entanto, até agora a organização espacial de tecidos e interações célula-célula eram comumente ignorado na maioria do disponível
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modelos [12]. Para superar tais limitações uma nova categoria de culturas de células, designada por co-culturas, está actualmente a ser desenvolvidos [13]. Este novo conceito foi concebido com a finalidade de cobrir a falta de correlação entre culturas celulares clássicos e
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sistemas (Figura 1) [12]. Usando co-culturas é possível recriar algumas das
In vivo
tecido nichos [14], uma vez que as interações célula-célula são estabelecidos em contato próximo. Este parâmetro crítico é essencial para o estabelecimento de morfologia celular, fenótipo, o metabolismo ea proliferação, características que estão presentes
in vivo
[15], [16], [17], [18]. Além disso, a co-culturas também são uma ferramenta perfeita para analisar a especificidade alvo de sistemas de entrega de drogas para células tumorais [19].
A célula culturas são capazes de imitar
in vivo
tecidos sem as questões éticas e de custos associados à experimentação animal.
Atualmente, o câncer de mama é uma das doenças malignas mais investigado [13]. Esta doença é a causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer em mulheres em todo o mundo [20], [21]. microambiente O cancro da mama é constituído não apenas por células cancerosas, mas também por fibroblastos, adipócitos, capilares sanguíneos, células endoteliais, células do sistema imunitário e as proteínas da matriz extracelular (ECM) [13], como colagénio e elastina. Apesar de ser aceite que o cancro pode surgir em geral a partir de mutações genéticas [22], crescimento, invasão, metástase e não só são dependentes destes eventos mutagénicos. Na verdade, reconhece-se que todas as células presentes no microambiente tumoral ato sinergicamente para promover a proliferação do tumor e espalhamento [23], [24]. Além disso, foi recentemente relatado por Straussman et al., 2012, que as células estromais são recrutados por células cancerosas para solicitar tumor droga-resistência e proliferação [25].
Recentemente, várias terapias contra o câncer que visam também fibroblastos demonstraram impedir a progressão desta doença [26]. Estas células específicos são descritos como tendo um papel crucial no nicho tumoral [27], com populações heterogéneas e a composição relativa diferente existentes em numerosos tumores [26]. Estas células estão envolvidos no metabolismo da matriz extracelular, promovendo a integrina sinalização [28], [29]. Os fibroblastos também secretam e interagir com vários factores de crescimento [25], [29], como o factor de crescimento de hepatócitos (HGF), factor de crescimento de fibroblastos (FGF), factor de crescimento semelhante a insulina (IGF) e factor de crescimento epitelial (EGF), que são responsável pela activação de mecanismos que contribuem para a resistência à apoptose [30], [31], e promover a proliferação de células malignas [32]. Todas estas características deletérias, têm atraído pesquisadores atenção para desenvolver co-culturas que incluem estes tipos de células em uma tentativa de imitar o microambiente do tumor real [19], [33].
A partir deste ponto de vista, o presente estudo caracteriza a captação celular de nanocarriers funcionalizados em modelos de co-cultura, a fim de abordar a sua selectividade e atividade biológica de células cancerosas.
Materiais e Métodos
Materiais
estrogénios adenocarcinoma da mama humano dependente (MCF-7) foi obtida a partir de ATCC (Middlesex, Reino Unido) e fibroblastos dérmicos humanos normais primárias (hFIB) de Promocell (Heidelberg, Alemanha). A cultura de células frascos T foram obtidas a partir de Laranja Scientific (Braine-l’Alleud, Bélgica). plates celular foram adquiridos de Ibidi GmbH (Ibidi, Munique, Alemanha). Rodamina B isothiocianate (RITC), a tripsina, a cultura de células de Dulbecco modificado por Eagle Médium F-12 (DMEM-F12), colagénio do tipo I, L-histidina, L-arginina,
N
– hidroxissuccinimida (NHS),
N
– (3-dimetilaminopropil) –
N
-etilcarbodiimida (EDC) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Sintra, Portugal). Hoescht 33342® e CellLight 2.0® BacMam foram fornecidos por Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). cloridrato ultrapura quitosano (CH) (Protasan UP CL 113) foi obtida a partir de Novamatrix (Sandvika, Noruega). de soro bovino fetal (FBS) foi adquirido a partir de Biochrom AG (Berlim, Alemanha). (4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico) foi adquirido a partir de Tokyo Chemical Industry (TCI) (Tóquio, Japão). Todos os outros reagentes foram utilizados sem purificação adicional.
co-cultura Modelos
Para estabelecer diferentes células MCF-7 e hFIB modelos de co-cultura foram cultivadas em 75 cm
2 de células T frascos com meio DMEM-F12 suplementado com 10% (v /v) de FBS e 1% de estreptomicina e gentamicina. Todas as células foram incubadas a 37 ° C, numa atmosfera humidificada com 5% de CO
2. Ao atingir a confluência, ambas as células foram colhidas utilizando 0,18% de tripsina e EDTA 5 mM para se obter duas suspensões de células únicas. As células foram coradas com azul tripano a 4% e contadas utilizando um hemocitómetro. Posteriormente, co-culturas foram semeadas a 01:01, 01:03, 01:05 e 03:01 MCF-7 com as taxas de hFIB, em placas de 6 poços, com um número total de 2 × 10
4 de células por poço. Culturas de controlo de hFIB homotípicas e células MCF-7 foram semeadas, utilizando o mesmo número total de células por poço em poços separados. Co-culturas e culturas homotípicas foram mantidas em DMEM-F12 meio completo em todas as experiências. A evolução das co-culturas em termos de distribuição e morfologia celular foi analisada utilizando um microscópio óptico Olympus CX41 equipado com uma câmera digital Olympus SP-500 UZ.
Síntese e Caracterização de quitosana-histidina-arginina
Para a síntese do polímero multifuncional, CH foi quimicamente modificado com arginina (R) e histidina (H) por meio de acoplamento de EDC /NHS [34], [35]. Para este efeito, o quitosano foi dissolvido (10 mM de tampão de TEMED /HCl, pH 6,0) a uma concentração de 1% (w /v). Subsequentemente, NHS, EDC (0,6 mol: 1,5 mol) e L-histidina (0,7 mol: 1,0 mol de glucosamina) foram subsequentemente adicionados à solução de quitosano. A reacção foi realizada durante 24 h, à temperatura ambiente. O polímero funcionalizado, em seguida, foi dialisada contra água desionizada (MWCO de 12 000-14 000 Da). O polímero de quitosano-H purificado foi, em seguida, recuperado por liofilização. A espinha dorsal do polímero CH-H foi posteriormente modificada com L-arginina como acima mencionado, para produzir CH-RH.
A inclusão de aminoácidos no esqueleto de quitosano foi analisada por meio de ressonância magnética nuclear protónica (
1H RMN ) espectroscopia usando um Bruker Avance 400 MHz espectrómetro III (Bruker Scientific Inc., Nova Iorque, EUA). Todas as amostras foram dissolvidas em 1 mL de DMSO-d
6 através de uma extensa sonicação e o
1H espectros foram recolhidos com um programa de pulso com base em gradiente (zgesgp, Bruker), a 298 K, utilizando uma janela espectral de 9 kHz . Os espectros de RMN foram processados e analisados com o software TOPSPIN 3,1 (Bruker Scientific Inc., N.Y., EUA). Além disso, o acoplamento de aminoácidos também foi verificada por meio de reflectância total atenuada-Fourier Transform Infrared Spectroscopy (ATR-FTIR) (Protocolo S1 no ficheiro S1 e S1 Figura). O grau de substituição total da espinha dorsal do polímero CH original foi determinada por ATR-FTIR, como anteriormente descrito elsewere [36] (média ± D.P. .: 43,84 ± 6,67%;
N
= 3). Além disso, o grau de substituição foi também determinada por análise de RMN, através da integração da histidina (δ = 8,1 ppm), arginina (δ = 7,41 ppm) e quitosano (δ = 1,3 ppm) picos característicos (rácio Histidina = 1,14; Arginina ratio = 0,39).
nanopartículas Formulação e caracterização físico-química
para garantir a existência de material genético para encapsulamento em nanocarriers, o plasmídeo pVAX1-LacZ foi inicialmente amplificado em bactérias recombinantes e recuperado como anteriormente relatado [37]. Resumidamente, para a formulação de nanopartículas de quitosano-histidina-arginina /pDNA (CH-H-R /pADN), o polímero foi dissolvido em tampão de acetato (pH 4,5) na concentração desejada. Todos os amino nanopartículas CH-H-R foram formuladas numa amina previamente optimizado à relação de fosfato de (N: P = 60). As nanopartículas foram sintetizados pelo pADN adição à solução de polímero a 01:04 (v /v). A mistura foi em seguida vigorosamente a mistura durante 1 min. Em seguida, os complexos foram estabilizadas à temperatura ambiente e recuperado por centrifugação a 18 000 g, durante 30 min.
tamanho de nanopartículas e potencial zeta foram determinados usando um instrumento Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, RU) como o nosso grupo anteriormente descrito [37]. Todas as experiências foram realizadas a 25 ° C, com células capilares descartáveis dobradas, no modo automático. Os dados foram processados no programa Zetasizer (v 6,2). Além disso, o potencial Zeta de nanopartículas também foi exibido numa gama de pH diferente de (5,0 a 7,4), a fim de resolver ainda mais o comportamento responsivo pH deste sistema sob várias condições. O rastreio do pH foi realizado por ressuspensão das nanopartículas em tampões com uma capacidade tamponante adequada (tampão de acetato, 10 mM, pH 5,0; tampão de citrato 10 mM, pH 6,0 e pH 6,5; tampão HEPES 10 mM, pH 7,0 e pH 7,4). Todos os tampões foram filtrados previamente por meio de um filtro de 0,22 um.
As nanopartículas fabricados foram também analisadas por microscopia electrónica de varrimento (MEV). Antes da análise SEM, as amostras de nanopartículas foram coradas com ácido fosfotúngstico 0,1% e ultra-sons. Depois a suspensão de nanopartículas foi disperso em tocos de alumínio, e descarga eléctrica revestido com ouro, após secagem à temperatura ambiente. amostras de nanopartículas foram então visualizadas em um Hitachi S-2700 (Tóquio, Japão) microscópio eletrônico configurado com configurações mais eficientes para materiais de imagem de tamanho nano.
In vitro
nanopartículas celular Captação
O
in vitro
nanopartículas captação nos vários sistemas de co-cultura (1:01, 1:03, 1:05, 3:01) foi analisada por microscopia confocal de varrimento laser (CLSM). Para distinguir as células hFIB de células MCF-7, o último foram marcadas com o 2.0® BacMam Actina-verde proteína fluorescente (GFP) CellLight sonda, seguindo o protocolo do fabricante. Antes da sementeira de células, as placas de imagiologia foram superfície revestida com colagénio I, durante 30 min, tal como recomendado pelos fabricantes. Após o aparecimento da expressão da GFP, várias células MCF-7 /GFP para hFIB proporções foram sub-cultivadas em 8 μ bem-Slide Ibidi placas a uma densidade de 2 × 10
4 células por poço. As células foram cultivadas em meio DMEM-F12 suplementado com 10% (v /v) de FBS, a 37 ° C em atmosfera humidificada com 5% de CO
2. Após o primeiro dia de co-cultura, as células foram incubadas com nanopartículas CH-H-R carregados com pADN RITC-marcado (1? G /cm
2) durante 4 horas [38]. As nanopartículas foram também incubadas em monoculturas de hFIB, MCF-7 e actina-GFP células MCF-7. Além disso, as células MCF-7 coradas com GFP e incubadas com nu RITC-pADN foram utilizados como controlos (Figura S2). Após um período de incubação de 4 h, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% (PFA), durante 15 min, extensivamente lavadas com PBS e coradas com sonda nuclear Hoechst 33342® à temperatura ambiente. imagens de células foi realizada em uma Zeiss LSM 710 varredura a laser microscópio confocal (Carl Zeiss SMT Inc., EUA), utilizando um plano de Apochromat 40 × /1,4 Óleo DIC objectivo. As imagens das amostras foram adquiridos no modo Z-pilha com uma espessura de fatia de 0,23 uM. corte ortogonal e reconstrução 3D dos vários z pilhas foi realizada no software Zeiss LSM Zen (2010).
Análise de Citometria de Fluxo de Absorção de nanopartículas
O efeito das diferentes razões em co-cultura sobre a extensão e a especificidade de captação de nanopartículas foi analisado através de citometria de fluxo utilizando um citómetro de fluxo BD FACSCalibur (Becton Dickinson Inc., EUA). Resumidamente, nas experiências de incorporação, co-culturas foram semeadas em placas de cultura de 6 poços com um total de 2 × 10
5 células por poço. As células foram cultivadas durante 24 h em DMEM-F12-10% de FBS a todas as experiências anteriores. Além disso, co-culturas e monoculturas de hFIB e MCF-7 foram utilizados como controlos para estabelecer os parâmetros de propagação e de aquisição de correcção no FL-1 (530/30 nm (GFP)) e FL-2 (585/42 nm ( RITC)) canais (figura S3). Para a análise da utilização de nanopartículas nas várias co-culturas nanopartículas CH-H-R foram preparados com recém-rotulados RITC pADN (1? G /cm
2) e incubadas com as células durante 4 h. Em seguida, as células foram extensivamente lavadas com PBS arrefecido em gelo e colhidas com tripsina 0,18% /EDTA 5 mM (ácido etilenodiamina tetra-acético). Para análise de citometria de fluxo, as células foram resuspendend em 600 ul de PBS fresco. A aquisição de dados foi realizada no software CellQuest ™ Pro, onde 8 × 10
3 eventos foram registrados nas regiões bloqueadas de interesse atribuídos a hFIB e células MCF-7. Citometria de fluxo de dados foi analisado na versão de avaliação do FCS expressa v.4 software de edição de pesquisa (De Novo Software, Ontario, Canadá). Para o cálculo da percentagem de células numa região fechado que varia de 10
1-10
4 foi usada. Esta região é delimitado por um marcador nos histogramas e corresponde ao quadrante R2 nos gráficos de pontos. Todos os histogramas dos controlos não tratados foram subtraídos aos histogramas obtidos para as diferentes proporções.
Resultados
Co-culturas de células MCF-7 e hFIB
Inicialmente, diferente modelos de co-cultura de câncer de mama foram estabelecidos utilizando várias relações de células que foram previamente descritos na literatura como sendo descritiva da
in vivo
-mimicking condições, ou seja, 01:01; 01:03; 01:05; 03:01, MCF-7 de células de hFIB [19], [39], [40], [41], [42]. A evolução dos modelos de co-cultura estabelecida é apresentado na Figura 2.
Co-culturas de células MCF-7 para hFIB de relação: 1:01 (A1-A5), 1:03 (B1-B5) , 01:05 (C1-C5), e 03:01 (D1-D5). As monoculturas de MCF-7 (E1-E5) e hFIB (F1-F5) foram utilizados como controlos. Ampliação original x 100.
Por meio da análise da Figura 2, que é claramente visível que as células são aderentes e capaz de permanecer em co-cultura durante vários dias, sem separação ou morte celular anormal. Curiosamente, em co-culturas que foram estabelecidas com mais fibroblastos do que as células de cancro da mama (Figura 2 B1-B5 e C1-C5), células MCF-7 desenvolveram uma ligeira tendência para formar aglomerados rodeados por fibroblastos. Esta aglomeração é particularmente evidente após 8 dias de co-cultura (Figura 3) e está associada com as características fenotípicas de células cancerosas da mama que são organizadas em estruturas acinares [43].
Co-culturas de MCF- 7 e hFIB 1:01 (A, B) e 01:05 (C, D). Ampliação original x 100.
Síntese e caracterização de CH-H-R multifuncional Polímeros
A adição de resíduos de aminoácidos para a coluna vertebral de quitosano foi confirmada por
espectroscopia de 1H RMN. Os resultados na Figura 4 A e B demonstram a presença de picos de protões adicionais no δ≈1.5 ppm (-CH
2-, L-arginina e L-histidina, número 1) e δ≈2.8-3.0 ppm (-CH
2NH, L-arginina, número 2), em comparação com os espectros da quitosana sozinha. Os sinais que correspondem a C
3-C
6 carbonos de quitosano são mascaradas por picos de solvente. O sinais de carbono anomérico de quitosano são obtidas entre δ≈4.6-4.9 (número 7 e 7 *) [44]. O sinal de protão a δ≈1.9 ppm (número 6) corresponde ao grupo -CH
3 grupos ligados às porções de quitosano acetamido [44]. A existência da característica de pico de protão δ≈7.41 ppm (-NHCH = NHNH
2, o número 3) atribuído ao grupo funcional de guanidina [45] presentes em L-arginina sugere a inclusão bem sucedida deste aminoácido. Além disso, o aparecimento de picos de protões característicos da L-histidina anel imidazol ppm δ≈8.0-8.5 (-N = CH-NH-, número 5) também indica a sua inclusão no polímero de quitosano. Histidina também apresenta picos de protões a ppm δ≈7.1-7.2 que correspondem ao átomo de hidrogénio H2 (HN-CH-C, número 4) no anel de imidazole. Estes resultados estão de acordo com aqueles obtidos pela análise ATR-FTIR (Figura S2).
1H NMR espectros de CH não modificada (A) e CH-H-R (B e D). potencial Zeta (C) e análise de SEM (D) de nanopartículas CH-AR /pADN, respectivamente.
nanopartículas formulação e Caracterização físico
A síntese de CH-HR nanopartículas /pADN foi promovido pelo estabelecimento de forças eletrostáticas atrativas entre a espinha dorsal de polímeros carregados positivamente e as biomoléculas pADN carregados negativamente. tamanho de nanopartículas caracterização através de espalhamento de luz dinâmico (DLS) revelou que os nanodispositivos fabricados por este processo tem tamanho sub-celular na faixa de nano-escala (Figura 4C), uma característica valiosa se aplicações terapêuticas são previstos. MEV também demonstrou que as partículas apresentam uma morfologia esférica semelhante (Figura 4D). Além disso, a análise do potencial zeta revelou que a carga de superfície das nanoparticulas é altamente positiva e no intervalo de estabilidade da partícula,
i.,
Não foi observada agregação das partículas (Figura 4 C e D). A modificação do potencial Zeta de nanopartículas com pH ambiental também foi investigada de forma a apoiar adicionalmente a aquisição de um comportamento responsivo de pH quando as porções de aminoácidos foram enxertados em quitosano nativo (Figura 5). Os resultados obtidos mostram que as nanopartículas possuem uma elevada carga positiva na gama de pH lisossomal (pH 5,0 a 6,0). Curiosamente, a pH mais elevado, a carga de superfície das nanopartículas diminui, ilustrando a desprotonação das aminas primárias de quitosano e de o grupo imidazol de histidina carregado positivamente (Figura 5).
Representação esquemática de redução como potencial zeta uma função do pH. Os dados são apresentados como média ± DP
Efeito do índice de célula na Eficiência de nanopartículas Incorporação celular
Depois de confirmar a síntese bem sucedida dos sistemas e nanoparticulados que o MCF-7-hFIB células permaneceu estável em co-cultura, os rácios de células diferentes foram, então, criada em co-cultura com o objetivo de fornecer uma plataforma para avaliar eventos de captação celular de um sistema de nanopartícula multifuncional composta por CH-RH e pDNA. absorção celular das nanopartículas foi inicialmente caracterizado por meio de microscopia confocal para avaliar a sua capacidade de internalização celular. A análise da reconstrução 3D de modelos de co-cultura demonstram que os nanotransportadores são amplamente presente no citoplasma (Figura 6 A). As nanoparticulas carregadas com pADN também estão localizados no núcleo da célula, como mostra em fatias ortogonais (Figura 6 B, B1, B2, setas brancas) e secções nucleares (Figura 6 C, as setas brancas). Além disso, uma análise de co-localização também foi realizada para confirmar esses achados. Como mostrado na Figura 6 D (canal de colocalização – cor cinzenta) há uma co-localização visível entre os nanotransportadores RITC-marcados e o compartimento intracelular (seta roxa). Além disso, a co-localização nuclear também ilustra a existência de nanocarriers no compartimento nuclear.
imagens microscopia confocal de células cancerosas da mama MCF-7 após 4 h de incubação com nanocarriers (A, B), de corte ortogonal em XY eixo (B1, B2), a reconstrução em 3D do núcleo da célula (C). Co-localização dos canais verde (D) Vermelho e. Co-localização dos canais vermelho e azul. canal vermelho – RITC marcado pDNA /CH-H-R; canal verde – coloração de actina-GFP de MCF-7 Blue Channel – Hoechst 33342® coloração nuclear. canais de Grey:. análise de co-localização
nanodevice capacidade de segmentação também foi avaliada nos diferentes modelos de co-cultura por microscopia confocal e citometria de fluxo, rotulando o pDNA presentes em nanopartículas com RITC e também células cancerosas com uma GFP sonda de actina. Com esta abordagem fomos capazes de distinguir a absorção de nanopartículas em ambos os tipos de células (Figura 7). Analisando as várias imagens CLSM, observa-se que para os diferentes proporções de co-cultura, a internalização de nanopartículas é marcadamente mais elevada em células MCF-7 em comparação com hFIB (Figura 7). Na verdade, de citometria de fluxo de análise confirma as observações de imagens CLSM. A Figura 8 mostra que as nanopartículas CH-R-H /pADN entrar preferencialmente em células de cancro MCF-7, em detrimento de hFIB, para todas as proporções de co-cultura. Esta constatação enfatiza uma possível seletividade deste sistema no sentido de células malignas em microambientes heterogêneos. Além disso, experiências de incorporação de nanopartículas em monocultured células MCF-7 e hFIB indicam que os nanotransportadores são mais internalizado em células malignas do que em células normais (Figura S4), enfatizando ainda mais os resultados obtidos para as experiências de co-cultura.
co-culturas de células MCF-7 para hFIB em proporções de: 1:01 (a-C), 1:03 (D-F), 1:05 (G-I) e 03:07 (J-l) após 4 h de incubação com nanopartículas. canal vermelho – nanopartículas pDNA /CH-H-R RITC marcado; canal verde – coloração de actina-GFP de MCF-7; Azul Canal – Hoechst 33342® coloração nuclear; Cinza Canal: DIC; Fundiram -. A superposição de todos os canais
parcelas representativas do ponto de captação de nanopartículas nas diferentes relações de co-cultura (A-D). O quadrante R2 foi usada como uma porta para a análise de histograma. histogramas representativos de absorção de nanopartículas em populações de células MCF-7 (E-H) e hFIB (I-G) com diferentes proporções de co-cultura, após 4 h de incubação com RITC-rotulados nanopartículas /CH-RH pADN.
Discussão
Atualmente, a necessidade de melhorar a eficiência de terapias anti-câncer tem incentivado o desenvolvimento de sistemas de nanoescala proficientes que são capazes de reduzir os efeitos colaterais localizadas e sistêmicas de quimioterápicos convencionais [8]. Estes nanodispositivos possuem um conjunto de propriedades únicas que melhoram o perfil farmacocinético e farmacodinâmico de moléculas bioativas, aumentando sua biodisponibilidade em locais-alvo [6]. Na verdade, devido à sua versatilidade, nanocarriers pode ser manipulado para reconhecer selectivamente alvejar as células tumorais e evitar o metabolismo de primeira passagem, a fagocitose ou a depuração rápida do sangue, diminuindo a probabilidade de eventos fora do alvo [3]. Além disso, uma vez localizada dentro do compartimento celular, nanocarriers proteger a sua carga de mecanismos naturais de resistência a drogas em células tumorais, tais como as que dependem da transportadores ABC, e também orientar as moléculas terapêuticas para os seus alvos intracelulares [46]. Todas estas características principais são altamente dependente das diferentes fases de concepção e montagem nanocarrier. Portanto, uma avaliação adequada durante o processo de desenvolvimento de nanopartículas é crucial para a sua aplicação bem sucedida
in vivo.
Na verdade, a avaliação de novos sistemas de distribuição devem estar completamente realizada, a fim de evitar qualquer risco de saúde riscos e identificar características óptimas [9]. Em geral, a avaliação pré-clínica do desempenho biológico de uma nanodevice é realizada tanto
in vitro
, utilizando culturas de células, e
in vivo, jogue com modelos animais. No entanto, a demanda atual para reduzir a experimentação animal devido às questões éticas e económicas associadas levou ao desenvolvimento de abordagens alternativas, tais como culturas de células. No entanto, a fim de desbloquear o potencial completo de modelos de cultura de células e obter resultados mais realistas, a diferença entre culturas de células simples e
In vivo
tecidos tem de ser reduzida. Por conseguinte, o desenvolvimento de novos modelos baseados em co-culturas suscitou a possibilidade de imitar tecidos de tumor de tal maneira que o ambiente fisiológico encontrado
In vivo
pode ser replicado
In vitro
. Testando candidatos nanocarrier nestes sistemas co-culturas, fornece resultados mais precisos, uma vez que estas se reproduzem a progressão do tumor, resistência aos medicamentos e também a comunicação célula-célula [47]. Todos estes acontecimentos, em última análise afectar o desempenho biológico de um dado sistema nanocarrier e suas moléculas bioactivas carregados.
Por isso, torna-se valiosa para caracterizar a captação celular de nanopartículas em modelos de co-cultura para avaliar a sua especificidade de direccionamento. No entanto, uma vez que a acção de nanopartículas pode mudar de acordo com as características do microambiente do tumor, avaliando várias condições é um requisito crucial no desenvolvimento pré-clínico. Através desta análise, a acção de nanoparticulas funcionalizadas contra células malignas pode então ser ajustado de acordo com o nicho de tumor e as suas células normais circundantes. Para isso, torna-se essencial para desenvolver vários modelos de co-cultura que reproduzem ambientes dinâmicos. Assim, as nanopartículas de quitosano aqui funcionalizados foram testados em co-culturas com rácios de células malignas do normal diferentes. Para realizar estes ensaios, foram usadas diferentes rácios de hFIB e células de cancro da mama (MCF-7). Estes modelos foram estabelecidas, tendo em conta os relatórios anteriores onde estes rácios de células particular, foram utilizadas para mimetizar ambientes cancerosas [19], [39], [40], [41], [42]. A Figura 2 mostra a elevada taxa de proliferação de ambos os tipos de células, sem morte celular anormal, em comparação com os seus homólogos de monocultura. Além disso, os resultados apresentados na Figura 2 confirmam as boas interações entre células MCF-7 de cancro da mama e hFIB e, portanto, o sucesso da criação destes modelos de co-cultura.
Em relação morfologias celulares, as imagens ópticas (Figura 2 ) demonstram que ambos os tipos de células preservar as suas características fenotípicas. As células cancerosas mantiveram a sua morfologia epitelial, com uma forma poligonal [48], [49].