Abstract

mucinas transmembrana, MUC4 e MUC16 estão associados com a progressão do tumor e potencial metastático em pancreático humano adenocarcinoma. Descobrimos que o miR-200c interage com sequências específicas dentro da sequência de codificação de ARNm MUC4 e MUC16, e avaliada a natureza reguladora desta associação. linhas celulares de cancro do pâncreas S2.028 e T3M-4 transfectadas com miR-200c mostrou um 4,18 e 8,50 dobrar para baixo regulação do mRNA MUC4, e 4,68 e 4,82 dobrar para baixo regulação do mRNA MUC16 comparação com células transfectadas por simulação, respectivamente. Também foi observada uma redução significativa da expressão da glicoproteína. Estes resultados indicam que o miR-200c superexpressão regula mucinas MUC4 e MUC16 em células de cancro do pâncreas, visando directamente a sequência de codificação de ARNm de cada, resultando em níveis reduzidos de ARNm MUC4 e MUC16 e proteína. Estes dados sugerem que, além de regular proteínas que modulam EMT, influências miR-200C expressão de mucinas de superfície celular em câncer de pâncreas

Citation:. Radhakrishnan P, Mohr AM, Grandgenett PM, Steele MM, Batra SK, Hollingsworth MA (2013) MicroRNA-200c module a expressão das MUC4 e MUC16 por Diretamente voltadas às suas sequências codificantes em Câncer pancreático humano. PLoS ONE 8 (10): e73356. doi: 10.1371 /journal.pone.0073356

editor: Klaus Roemer, Universidade de Saarland Medical School, Alemanha |

Recebido: 31 de maio de 2013; Aceito: 19 de julho de 2013; Publicação: 25 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Radhakrishnan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos seguintes doações do Instituto Nacional do Câncer: SPORE (1P50CA127297), Detecção precoce Research Network (5U01CA111294), a Aliança dos Glycobiologist para detecção do câncer e Risco de Câncer (5U01CA128437), Tumor Microenvironment Network (CA163120 U54) e R01CA57362 . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os microRNAs (miRNAs) são pequenas (~ 20-22 nucleótidos) RNAs não-codificantes que regulam a expressão do gene, interagindo com ou ‘não traduzida (3’ a 3 UTR) ou a região de codificação de mRNAs alvo. A expressão de produtos de genes alvo são afectados pela degradação do mRNA induzido miARN ou inibição da tradução [1]. Altered expressão de miARN no cancro resulta em funções de promoção de tumores e supressores de tumores. atividades oncogênicos por exemplo, miR-155, miR-17-5p e miR-21 têm conhecido [2,3], que, miR-15a, miR-16-1, deixe-7 e miR-145 funcionam como supressores de tumor [ ,,,0],4-9]. Tem sido demonstrado que o miR-200c está expresso diferencialmente no cancro do pâncreas, onde expressão elevada foi associada a uma melhor sobrevivência e baixa expressão está associada a um pior sobrevivência [10]. A sobre-expressão de miR-200C inibe a invasão de células de cancro por factores moduladores importantes em EMT [10]. A expressão ectópica de miR-200c induz níveis mais elevados de E-caderina em mama e pancreáticas células cancerosas através da segmentação direta do fator de transcrição 8 (TCF8 /ZEB1), um regulador negativo da caderina-E [11-14]. Portanto, células com níveis elevados de miR-200 c têm um fenótipo mesenquimal mais epitelial e menos que possa ter impacto metástase. Recentemente, foi mostrado sobre-expressão de miR-200c para inibir a progressão do tumor melanoma e resistência às drogas [15].

expressão aberrante de glicoproteínas de mucina está associada com a progressão do cancro do pâncreas metástase. As mucinas transmembranares, MUC4 e MUC16, são anormalmente sobre-expressos em muitos adenocarcinomas, incluindo o cancro pancreático humano [16-18]. O MUC4 mucina é uma glicoproteína grande expresso por células epiteliais numa variedade de tecidos. MUC4 não é expresso no pâncreas normais, mas é expressa de forma aberrante numa elevada percentagem de lesões pré-malignas e malignas pancreáticas [16,19]. MUC4 promove o crescimento do câncer e metástase em parte por meio da interação com o HER2 oncoproteína [20,21]. MUC16 (CA125) é uma glicoproteína de alto peso molecular de mucina normalmente expressas na superfície ocular, do tracto respiratório e órgãos reprodutivos contendo células epiteliais [22]. CA125, um epitopo em MUC16, é utilizado como um marcador de tumores para detecção do cancro do ovário no soro dos pacientes [23] e o crescimento do cancro do ovário e MUC16 influências metástase [24]. O aumento da expressão MUC16 também é observado no câncer pancreático humano [17,18], e nós mostramos recentemente que há aumento da expressão nas lesões metastáticas de pacientes com câncer pancreático [25].

Nós relatamos aqui que miR- 200c interage com sequências específicas dentro da sequência de codificação de ARNm MUC4 e MUC16 e regula os níveis de expressão. maior expressão de mucinas transmembranares e perda de miR-200c são altamente associados com características metastáticas de células cancerosas.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e cultura

células cancerosas pancreáticas humanas Capan-1 (American Type Culture Collection, ATCC), S2.007, S2.013, S2.020, S2.028 [26], HPAF (generosa oferta do RS Metzgar, Departamento de Microbiologia e Imunologia, Duke University Medical Center, Durham. North Carolina), e T3M-4 (simpática oferta do Tetsuro Okabe, Universidade de Tóquio, Japão) foram cultivadas em meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) (Hyclone, Logan, UT, EUA), suplementado com 10% de soro bovino fetal (Vale Biomedical Inc., Winchester, VA, EUA), 100 ug /mL de estreptomicina e 100 unidades /mL de penicilina (Mediatech Inc., Manassas, VA, EUA) e incubou-se a 37 ° C com 5% de CO

2 em numa incubadora humidificada.

microARN isolamento e análise em tempo real de-PCR (RT-PCR) de miR-200c

miARN foram extraídos a partir de células de cancro pancreático utilizando o kit de isolamento miRvana miARN (Ambion, Carlsbad, CA, EUA). Expressão de miR-200c foi quantificada utilizando o kit de ensaio TaqMan MicroRNA (ABI, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante.

miARN-200c a sobre-expressão em S2.028 e T3M-4 linhas de células de cancro do pâncreas e

oligonucleótidos do transcrito primário de miR-200c foram clonados em p

Silenciador

4,1-CMV plasmídeo (Ambion, Carlsbad, CA, EUA) (Tabela S1) para estabelecer um vector de expressão estável. As células foram semeadas a 75 x 10

3 células por poço (placa de 12 poços) no dia antes da transfecção, e um plasmídeo ug foi transfectado para as células no dia seguinte utilizando Lipofectamina LTX com (Life Technologies PLUS reagentes Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram colocadas sob selecção com G418 (200 ug /ml) 48 horas após a transfecção. Os clones foram subsequentemente recolhidas e analisadas quanto à expressão de miR-200 ° C na linha de células de S2.028 (clone 7), ao passo que uma população seleccionada policlonal foi utilizado para a linha de células de T3M-4. As células transfectadas com a sequência de mexidos contendo o vector a partir do kit (Ambion, Carlsbad, CA, EUA) serviu como um controlo negativo. Expressão de miR-200c foi quantificada utilizando o kit de ensaio de MicroRNA TaqMan (ABI, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. U6 rRNA foi usado como um controlo interno. A dobra-mudança na expressão foi calculada usando a

-ΔΔCt método 2 [27].

azul de metileno de Proliferação Celular Ensaio

A proliferação celular foi testada usando um corante azul de metileno como celular previamente descrito [28]. S2.028 e T3M-4 de controlo e miR-200C células que expressam foram contadas e colocadas em placas a 2000 células por poço numa placa de 96 poços e 200 uL de volume total, a oito réplicas para cada intervalo de tempo. Em cada ponto de tempo (24, 48, 72 e 96 horas), os meios foram removidos e as células foram lavadas uma vez com 150 ul de PBS de Dulbecco e fixadas com 150 ul de 10% de formalina durante 30 minutos à temperatura ambiente. A formalina foi removido e as células foram coradas durante 2 horas com 80 uL de 1% de azul de metileno (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) diluída com tampão borato 0,01 M, pH 8,5. As células foram lavadas com 150 ul de tampão de borato de 0,01, pH 8,5, quatro vezes. O azul de metileno foi extraído com 100 mL de HCl 0,1 N /etanol (1: 1) e incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente. A absorvância a 650 nm foi determinada por análise espectrofotométrica. Two Way ANOVA foi utilizado para analisar a diferença estatística entre os grupos. Um valor p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

PCR em tempo real (RT PCR) análise da mucina expressão

O RNA total foi isolado a partir S2.028 e T3M-4 células usando Reagente TRI (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O ADNc foi sintetizado utilizando o kit de ADNc Verso (Thermo, Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). A análise dos níveis de MUC1, MUC4, MUC16 e ARNm GAPDH foram realizadas com SYBR Green PCR master mix (ABI, Carlsbad, CA, EUA). Os seguintes iniciadores foram utilizados para RT-PCR: MUC-1, F-5-CTGCTCCTCACAGTGCTTACAGTTG-3; R-5- TGAACCGGGGCTGTGG CTGG-3; MUC4, F-5-GCCCAAGCTACAGTGTGACTCA-3; R-5-ATGGTGCCGTTGTAATT TGTTGT-3; MUC16, F-5-ACATCAACTCCTGCCTTCCCAGAA-3; R-5-ACCAGTGGGCAT TCCAGAAAGAGA-3; GAPDH, F-5-TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3; R-5-ACCAA ATCCGTTGACTCCGACCTT-3. Cada experiência foi efectuada em triplicado. As diferenças na expressão de genes de mucina, expressos como vezes de mudanças, foram calculados utilizando a 2

-ΔΔCt método utilizando GAPDH como controle interno.

A análise de imunotransferência de mucinas

eletroforese em gel

SDS-agarose foi usada para analisar a expressão de mucina tal como descrito anteriormente [29]. As células que expressam o miR-200c ou um controlo scrambled foram colhidas e a proteína foi extraída utilizando NP-40 de células de tampão de lise (NaCl 150 mM, Tris 50 mM-HCl, 1% de NP-40, pH 8,0) suplementado com inibidores de protease (Promega, Madison, WI, EUA). Os lisados ​​celulares (50-100 ug de proteínas) foram resolvidas em SDS (0,1%) – agarose (2%) de electroforese em gel e transferidos para uma membrana de PVDF. As membranas foram bloqueadas em leite magro seco em pó a 5% em solução salina tamponada com Tris (NaCl 150 mM, Tris-HCl 50) com 0,1% de Tween 20, pH 7,4. As membranas foram incubadas com os anticorpos primários seguintes: MUC1 (AR20.5-IgG de rato, a Quest PharmaTech Inc, Edmonton, Alberta, CA), MUC4 (8G7- rato IgG, amável do Dr. Surinder K Batra, do Departamento de Bioquímica e A biologia molecular, UNMC), MUC16 (AR9.6R333 IgG de rato, a quest PharmaTech Inc., Edmonton, Alberta, CA) e α-tubulina (IgG de rato, hibridoma banco estudos do desenvolvimento, Iowa, EUA) (1: 1000 com 5% diluições não -fat leite em pó seco em TBS-T), durante a noite à temperatura ambiente. As membranas foram subsequentemente lavadas (3 x 10 minutos) com TBS-T a temperatura ambiente e sondaram-se com 1: 5000 diluído HRP de cabra-anti-rato conjugado de anticorpo secundário (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EUA) durante 1 h à temperatura ambiente e lavou-se 3 x 10 min, com TBS-T. O sinal foi detectado com Super sinal

® substrato West Pico quimioluminescente (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA). A quantificação densitométrica das bandas de proteína MUC4 e MUC16 foram realizadas utilizando o programa ImageJ (NIH). A mudança vezes na intensidade da banda de proteína (unidades arbitrárias por cento) foi calculada dividindo a densidade proteína de miR-200c expressando células por a densidade de proteína das células de controlo do vector. Detecção de alfa tubulina foi utilizada como um controlo de carga.

Vector constrói

regiões ORF de ARNm MUC16 e MUC4 que foram previstos para interagir com miR-200 ° C foram sintetizados e inserido PMIR-RELATÓRIO

TM Reporter miARN sistema vector de expressão (ABI, Carlsbad, CA, EUA) utilizando os locais de restrição Spel e HindIII (New England Biolabs, Ipswich, MA, EUA). sequências de tipo selvagem e mutante MUC4 e MUC16 /miR-200C interações foram sintetizados e utilizados neste estudo (Tabela S1). As mutações dentro dos sítios de ligação potencial de miR-200C foram gerados por substituição de nucleótidos da sequência de tipo selvagem para inibir a ligação de miR-200c. A inserção e orientação do fragmento foi confirmada por análise da sequência. Os plasmídeos foram designados PMIR-REPORT

TM-selvagem (MUC16 e MUC4 peso) e PMIR-REPORT

TM-mutante (MUC16 e MUC4 mt) (Tabela S1).

transfecção e ensaios de luciferase

de cancro do pâncreas (células S2.028 e T3M-4) foram cultivadas numa placa de 6 poços e transfectadas transitoriamente a 60-80% de confluência com os plasmídeos indicados acima, utilizando a lipofectamina

reagente TM 2000 (Invitrogen life Technologies, Carlsbad, CA, USA), conforme as instruções do fabricante. A actividade da luciferase foi medida por meio de sistemas de ensaio de luciferase Repórter (Promega, Madison, WI, EUA), 48 h após a transfecção. Os ensaios de luciferase foram efectuados de acordo com as instruções do fabricante num leitor de placas de 96 poços (Estrela Polar Optima Leitor de Microplacas, Offenburg, Alemanha). Todos os valores foram apresentados como média ± SEM de unidades relativas de luciferase (RLU) de três experiências independentes realizadas em triplicado. Foi realizado um teste t não pareado (de duas caudas) para análise estatística utilizando o programa GraphPad PRISM® Versão 5.0. Diferenças com um valor p 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

miR-200c:. Perfil de expressão e sobre-expressão em linhas celulares de cancro pancreático

Nós investigamos a expressão de miR-200c em 7 câncer de pâncreas linhas celulares por quantitativo em tempo real de RT-PCR. Como mostrado na Figura 1A, 5 linhas de células de cancro do pâncreas, incluindo Capan-1, S2.007, S2.013, S2.028, e T3M-4, expressam níveis mais elevados de miR-200c do que as células S2.020 e HPAF.

(A) A expressão de miR-200c em sete células cancerígenas pancreáticas foram determinadas por PCR em tempo real. Cada amostra foi executado em quadruplicado e de erro barras representam SD. S2.028 (B) e células T3M-4 (c) que expressam estavelmente o transcrito primário de miR-200c foram avaliados quanto à expressão de miR-200c por PCR em tempo real. Cada medição foi realizada em triplicado. Estes valores foram normalizados com o controle interno rRNA U6. O aumento de vezes nos níveis de transcrito mais de controlo de vector é expresso como média ± S.D. O valor de p foi determinada por meio do teste t de Student. Diferenças com um valor p 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

A sequência madura de miR-200c foi sintetizado e clonado num vector de expressão tal como descrito acima (p

Silenciador

4,1-CMV-miR-200c) e expressa de forma estável em S2.028 células e T3M-4. A análise por RT-PCR quantitativa da expressão do miR-200c em células S2.028-miR-200C mostraram um aumento para o dobro 3,68 e células T3M-4-miR-200C mostrou um aumento de 2,6 vezes na maduras níveis de miR-200C em comparação com células de controlo transfectadas vetor (Figura 1B e 1C). Confirmou-se que a forma madura recombinante do miR-200C era activo observando-se a regulação negativa da expressão de ZEB1, um alvo conhecido para miR-200 ° C, em ambos os S2.028 e T3M-4 células (Figura S1).

também examinaram as mudanças nas propriedades de proliferação celular de miR-200c expressando células de câncer pancreático S2.028 e T3M-4. Uma redução significativa na taxa de crescimento de S2.028 miR-200c foi observada às 72 e 96 horas (*** p 0,0001) quando comparado com células de controlo do vector (Figura S2.028 S2a). No entanto, nenhuma alteração foi observada quando T3M-4 miR-200c foi comparado com as células de controle de vetores em qualquer ponto de tempo testado (Figura S2B).

MUC4 e expressão MUC16 é suprimida por miR-200c

Nós avaliamos a capacidade de miR-200c para regular membrana mucinas ligadas ao expressar miR-200c (p

Silencer

4.1-CMV-miR-200c) em linhas celulares de cancro do pâncreas S2.028 e T3M-4. Houve uma redução dramática da proteína em células MUC4 S2.028-miR200c (1,7 vezes) e T3M-4-miR-200c (4,46 vezes) em relação às células de controlo (Figura 2A e 2B). De igual modo, houve uma redução significativa na proteína MUC16 (isoformas de elevado e baixo peso molecular) na S2.028-miR200c (18,1 e 5,9 vezes, respectivamente) e T3M-4-miR-200c (5,2 e 6,1 vezes, respectivamente), as células, em comparação com as células de controlo (Figura 3A e 3B).

Os lisados ​​a partir de (A) S2.028 e (B) T3M-4-miR-200c e respectivas células transfectadas de controlo do vector foram separados em electroforese em gel de SDS-agarose, sujeito a western blot, utilizando um anticorpo anti-MUC4 (painéis da esquerda) e os sinais foram quantificados por densitometria e analisados ​​utilizando o programa ImageJ (painéis da direita). O miR-200c células expressando mostraram uma redução significativa de proteína MUC4 em comparação com células de controlo em (A) e (B S2.028) T3M-4 células. Detecção de alfa tubulina foi utilizada como um controlo de carga.

(A) S2.028 e (B) T3M-4-miR200c e respectivos lisados ​​de células transf ectadas de controlo do vector foram separados por electroforese em gel de SDS-agarose e submetidas a transferência de western utilizando um anticorpo anti-MUC16 (painéis da esquerda). intensidade da banda foi quantificada por densitometria e analisados ​​utilizando o programa ImageJ (painéis da direita). Foram observadas reduções significativas de ambos peso MUC16 isoformas da proteína de alta e baixa moleculares no miR-200c expressar S2.028 (A) e as células T3M-4 (B) do que em comparação com células de controlo de vector. α-tubulina foi utilizada como um controlo de carga.

alvos miR-200C transcricionalmente mucinas ligadas à membrana MUC4 e MUC16

Também observamos uma redução significativa de ambos os níveis MUC4 e MUC16 de mRNA em miR200c linhas celulares que expressam. MUC4 transcritos foram reduzidos 4,18 e 8,50 vezes em S2.028-miR200c e T3M-4-miR200c respectivamente (Figura 4A e 4B) em comparação com células de controlo. transcrições MUC16 foram reduzidos de 4,68 e 4,82 vezes em S2.028-miR200c e T3M-4-miR200c respectivamente, em comparação com células de controlo (Figura 4C e 4D). Estes resultados indicam que o miR-200c regula a expressão oncogénica de MUC4 e MUC16 transcrição e tradução.

análise de qRT-PCR de MUC4 (A e B) e MUC16 (C e D) foram realizadas no controlo de vector e miR -200C transfectadas S2.028 (A e C) e as células T3M-4 (B e D). A expressão relativa de MUC4 e MUC16 foi avaliada pela 2

-ΔΔCt método utilizando GAPDH como um controlo interno. As células expressando o miR-200C (S2.028 e T3M-4) mostraram níveis significativamente reduzidos de ARNm MUC4 em comparação com células de controlo do vector (A e B). Expressão de MUC16 transcrição foi reduzida em miR-200c expressando S2.028 e células T3M-4 (C e D). Todas as medições foram realizadas em triplicado. O aumento vezes nos níveis de transcrição sobre o controle de vetores foram expressos como média ± S.D. Um valor de p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Previsão de sequências em MUC4 e MUC16

Potencial miR-200c segmentação regiões do MUC4 ligação miR-200c e transcrições MUC16 foram identificados usando o servidor web previsão alvo RegRNA MicroRNA (https://regrna.mbc.nctu.edu.tw/index1.php). RegRNA predição miARN alvo identificado alta probabilidade para o miR-200c a ligação a sequências de codificação de MUC4 entre os pares de bases 820-842 (Exon-1) (Figura 5A) (Figura S3) e dez diferentes regiões incluindo nove exões diferentes dentro sequência de ARNm MUC16 (Figura 5B) (Figura S3). Estes dados nos levou a determinar se miR-200c poderia alvejar diretamente MUC4 e MUC16 transcrições dentro das regiões traduzidas.

Possível miR-200c segmentando regiões em MUC4 e MUC16 foram identificados usando o servidor web previsão alvo RegRNA MicroRNA ( https://regrna.mbc.nctu.edu.tw/index1.php). Um, RegRNA miARN alvo previsão mostra que o miR-200c liga-se entre os pares de bases 820-842 do primeiro exão de MUC4. B, Em mRNA MUC16, o miR-200c está previsto para ligar nove exons diferentes, incluindo E1, E3, E19, E39, E44, E49, E54, E64 e E73. Os números indicam a região de mRNAs que interagem com miR-200c.

miR-200c atinge diretamente as sequências codificadoras de MUC4 e MUC16

Avaliamos ligação de miR-200c ao sequência alvo putativo por clonagem das regiões que contêm as sequências de codificação humanas MUC4 e MUC16 no vector repórter PMIR-luciferase (PMIR-MUC4 e MUC16 em peso). Os controlos negativos foram produzidos em que o PMIR-MUC4 e MUC16 sequências foram mutada nos locais de ligação putativos para miR-200c e as mucinas (PMIR-MUC4 e MUC16 MT) (Figura 6A). células S2.028 e T3M /4-miR-200C foram transitoriamente transfectadas com os ADN de plasmídeo que codifica apenas o vector, de tipo selvagem MUC4 e MUC16 sequências no vector, e do tipo mutante MUC4 e MUC16 sequências no vector. Observou-se que a actividade repórter da luciferase foi suprimida de forma significativa tanto para MUC4 e MUC16 em S2.028 e células de miR-200C T3M-4 transfectadas com vectores de sequência de tipo selvagem em comparação com células transfectadas de controlo do vector (*** p 0,0001, MUC4-WT , MUC16-peso vs controle de vetores) (Figura 6B-E). No entanto, as células transfectadas com a sequência mutante contendo vectores mostraram significativamente o aumento da actividade repórter da luciferase (*** p 0,0001, MUC4-WT vs MUC4-mt; MUC16-WT vs MUC16-MT)., (Figura 6B-E)

(a) de tipo selvagem e mutantes de sequências de MUC4 e MUC16 foram clonados no vector de luciferase PMIR-(PMIR-MUC4 em peso e MUC16 em peso) e (mt PMIR-MUC4 e MUC16 MT), respectivamente. Os vectores que expressam PMIR-Luc, PMIR-MUC4 em peso, PMIR-MUC16 em peso, MUC4 PMIR-MT e PMIR-MUC16 MT foram transfectados em S2.028miR-200c (B e D) e células T3M-4miR-200C (C e E) e a actividade da luciferase foi quantificada 48 horas após a transfecção. Os resultados foram expressos como a actividade de luciferase relativa (média ± SEM de três determinações independentes). O valor de p foi determinada utilizando o teste t de Student (

Discussão

No presente estudo, demonstramos pela primeira vez que um peso molecular metas MIRR-200C alta mucina por direccionamento a sua sequência de codificação para a degradação ou a inibição de translação. Especificamente, o miR-200c como alvo sequências MUC4 e MUC16 exão para regular os níveis de ARNm e proteína para cada um destes mucinas. Nós mostramos que o miR-200c é expresso diferencialmente em células de cancro pancreático. Yu et al observaram uma taxa de sobrevivência significativamente maior em doentes com cancro pancreático com níveis mais elevados de miR-200c, em comparação com aqueles com níveis mais baixos de miR-200c [10]. trabalhos anteriores também mostraram que as células de câncer de pâncreas superexpressão de miR-200c exposição reduzida invasão e aumentou níveis de mRNA da caderina-e, sugerindo que miR-200c desempenha um papel inibitório no crescimento do cancro do pâncreas e da invasão [10]. a sobre-expressão de miR-200c aumentou a taxa de proliferação de terno-2, PANC-1 e KP-3 câncer de pâncreas células [10], no entanto, observou-se a proliferação celular reduzida de células S2.028 miR-200C expressar, o que sugere que as propriedades de crescimento de células diferencialmente regulados pelo miR-200c são dependentes de contexto. MiR-200c tem sido descrito como o principal regulador poderoso do epitelial-a-mesenquimal transição nos cancros da mama e células de cancro do ovário, através alterando a expressão de ZEB1 e E-caderina através da ligação a 3 ‘UTR e a degradação de condução ou de bloqueio a tradução do ARNm alvo [11-14]. Restauração de expressão de miR-200c em células de câncer de mama e de ovário altamente agressivos reduziu significativamente invasão, migração e resistência aos medicamentos destes tipos de tumor [30,31]. Estes relatos sugerem que a introdução de miR-200c em células cancerosas poderia reverter a progressão do tumor e fornecem uma nova estratégia de tratamento

A maioria dos relatórios mostram que miARN alvo da 3’UTR não codificante do ARNm.; no entanto, relatórios recentes demonstraram que também pode miARN alvo sequências de codificação de genes de mamífero. Relatamos aqui que as metas miR-200C exão sequências de codificação em transcrições de alto peso molecular mucina MUC4 e MUC16 e reduz a expressão de mRNA e proteína. Da mesma forma, Huang et ai, relataram que o miR-181 ° -A tem como alvo um grande número de genes de dedo de zinco por ligação para as suas sequências de codificação [32] e Duursma et al relataram que as regiões [miR-148 alvos de DNA humano metiltransferase 3b (DNMT3B) aminoácido codificante ,,,0],33]. Deixe-7 miARN alvo a região de codificação da enzima de processamento miARN, Dicer [34]. genes murino Nanog, Oct4 e Sox2 contêm numerosos sítios de ligação em sequências codificantes de exão de miRNAs que ocorrem naturalmente [35]. Estes relatórios sugerem que miRNAs alvo famílias de genes específicos dentro de regiões codificantes.

Regulamento do MUC4 e MUC16 por miR-200c pode ser através dos efeitos sobre qualquer transcrição ou tradução. Em ambas as linhas celulares estudadas aqui, os níveis de proteína MUC16 foram reduzidos em maior medida do que MUC4. Este aumento da segmentação de MUC16 por miR-200c pode ser devido à presença de dez regiões de ligação de miR-200c diferentes no ARNm MUC16 em comparação com a região de ligação única na sequência MUC4 codificação, levantando a possibilidade de que o número de sítios de segmentação numa transcrição influencia a sensibilidade desse transcrito à regulação miRNA.

recentemente, Ponnusamy et al relataram que a superexpressão de MUC4 resultado em epitelial para mesenquimal através de regulação negativa da e-caderina e aumento da migração de células cancerosas e invasão no câncer de ovário células [36]. Estes resultados são consistentes com nosso estudo, o que mostra que a superexpressão do mesenquimais para epiteliais promover miR-200c baixo regula ZEB1 e MUC4 em células de câncer de pâncreas.

MUC16 é altamente sobre-expressos em câncer de ovário e moderadamente sobre-expressos em câncer de pâncreas , mas o papel de MUC16 na progressão do cancro pancreático não tem sido extensivamente estudada. O nível significativamente reduzido de MUC16 observada em miR-200c células que sobre-expressam, juntamente com o papel bem documentado de miR-200c em várias fases da progressão do cancro sugere que MUC16 pode ter um papel no crescimento celular do cancro do pâncreas e metástase. Estes estudos indicam que a sobre-regulação de mucinas e a regulação negativa do miR-200c melhorar as propriedades malignas de células de cancro e, assim, induzir o crescimento do cancro do pâncreas e metástase.

Vários estudos têm mostrado que a expressão aberrante e aumento de MUC4 e MUC16 ocorre durante a progressão do cancro do pâncreas à metástase [17-19,25]. Recentemente, Mohr et al mostraram expressão de miR-200c foi reduzida em tecidos de tumores pancreáticos primários em comparação com alguns locais metastáticos [37]. Estes resultados geralmente suportam a hipótese de que as flutuações no miR-200c contribuir para a regulação da expressão de MUC4 e MUC16 durante a progressão do tumor pancreático e metástases.

Em conclusão, nosso estudo apresenta a primeira evidência de que MUC4 e MUC16 são reguladas pelo o nível pós-transcricional por um miRNA, miR-200c, que visa diretamente MUC4 e MUC16 dentro de suas regiões de aminoácidos de codificação. Estes resultados indicam que miR-200c pode ter um papel inibidor potencial no crescimento do câncer de pâncreas e metástase e estudos adicionais são necessários para delinear a relação regulatória entre mucinas ligadas à membrana e miR-200c.

Informações de Apoio

Figura S1. análise

qRT-PCR de ZEB1. A sobre-expressão de miR-200 ° C reduziu significativamente a expressão de ZEB1 em ambos (a) e (b S2.028) T3M-4 células. O aumento vezes nos níveis de transcrição sobre o controle de vetores foram expressos como média ± S.D. Um valor de p inferior a 0,05 considerado estatisticamente significativo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0073356.s001

(EPS)

Figura S2.

ensaio de proliferação celular. S2.028 (A) e T3M-4 (B) (miR-200c e controlo de vector) a proliferação de células em diferentes pontos de tempo foram medidos por ensaio de azul de metileno. Two Way ANOVA foi utilizada para obter significância estatística (***, p 0,001; ns, não significativa)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0073356.s002

(EPS)

Figura S3 .

Predição de miR-200c sites em mucinas vinculativo. locais potenciais miR-200C ligação na mucinas ligadas à membrana (MUC4 e MUC16) transcrições foram identificados usando o servidor web alvo preditor RegRNA MicroRNA

doi:. 10.1371 /journal.pone.0073356.s003

(EPS)

Tabela S1. : Lista de oligonucleótidos utilizados para a expressão de miR-200c e sistema de ensaio da luciferase.

doi: 10.1371 /journal.pone.0073356.s004

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Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. David Kelly para assistência técnica especializada no ensaio de luciferase

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