Abstract
Objetivos
Para determinar o potencial associação entre a infecção pelo HPV eo componente de células escamosas de carcinoma urotelial (UC) da bexiga e para validar p16 superexpressão como um marcador substituto para HPV infecção nesses cânceres entre os coreanos.
Métodos
Analisamos a presença de infecção por HPV usando um chip do DNA-HPV ea expressão da p16 utilizando imuno-histoquímica em 47 indivíduos entre Julho de 2001 e Março de 2011. o grupo de estudo (n = 35) incluiu pacientes com diferenciação escamosa de UC da bexiga. O grupo controle (n = 12) incluiu pacientes com metaplasia escamosa da bexiga.
Resultados
As características basais dos grupos controle e estudo foram semelhantes. As taxas de detecção de ADN de HPV foi de aproximadamente duas vezes superior no estudo do que o grupo de controlo (17,1% [6/35] versus 8,3% [12/01], respectivamente), mas a diferença não foi estatisticamente significativa. superexpressão P16 foi detectada em 16/35 grupo de estudo (45,7%) e as amostras 1/12 (8,3%) do grupo controle (p = 0,034). Ambos HPV-positividade e p16 superexpressão estavam presentes em 3/35 (8,8%) amostras do grupo de estudo, mas nenhum do grupo controle (p = 0,295). No grupo de estudo, a percentagem de casos HPV-positivos que eram não-fumantes foi de 2 vezes maior do que a percentagem de casos de HPV-negativas que eram não-fumantes (66,7% [4/6] versus 31,0% [9/29 ], respectivamente); no entanto, a significância estatística não foi alcançada devido ao pequeno tamanho da amostra.
Conclusões
infecção pelo HPV pode estar associada a UC da bexiga com diferenciação escamosa, especialmente em não-fumantes. No entanto, a expressão de p16 não parece ser um forte marcador substituto para a evidência de infecção por HPV em este tipo de câncer
Citation:. Kim SH, Joung JY, Chung J, Parque WS, Lee KH, Seo HK ( 2014) Detecção de Infecção pelo Papilomavírus Humano e p16 imunohistoquímica Expressão em cancro de bexiga com diferenciação escamosa. PLoS ONE 9 (3): e93525. doi: 10.1371 /journal.pone.0093525
editor: Hari K. Koul, Louisiana State University Health Sciences Center, Estados Unidos da América
Recebido: 08 de outubro de 2013; Aceito: 06 de março de 2014; Publicação: 27 de março de 2014
Direitos de autor: © 2014 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da National Cancer Center (NCC-1110510), República da Coreia. No entanto, os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
O câncer de bexiga (BC) é responsável por 3.2-4% de todos os cânceres no mundo e aproximadamente 90% do BC são o carcinoma urotelial (UC). Embora UC da bexiga, muitas vezes tem diferenciação escamosa focal, que é diferenciada do carcinoma de células escamosas (SCC) de bexiga, que contém células de carcinoma unicamente a queratina que formam. BC composto por urotelial misto e fenótipos escamosas é chamado UC com diferenciação escamosa (UC /SCC) [1].
Entre os agentes cancerígenos conhecidos de UC da bexiga, o tabagismo é o fator de risco mais bem caracterizada. Ele é responsável por quase metade dos BCs [2]. Outros factores de risco para o CM incluem exposição a um número de aminas aromáticas; infecção relacionada à carcinogênese, como infecção esquistossomótica; e doses elevadas de certas drogas, incluindo ciclofosfamida e fenacetina [3]. No entanto, um grande número de BCs permanecem inexplicados.
Recentemente, o papel dos vírus tem recebido considerável atenção como potenciais agentes cancerígenos, especialmente o vírus do papiloma humano (HPV). O HPV é um circular vírus pequeno,, de cadeia dupla de ADN que infecta o epitélio escamoso estratificado e foi estimado ligado a quase 10% de todos os cancros a nível mundial, especialmente um subconjunto de CCEs da vulva, do pénis, ânus, e orofaringe [4] – [7]. Entre os diferentes tipos de HPV, certos tipos, como o HPV-16 e HPV-18, têm um papel etiológico no desenvolvimento estabelecida de cancros anogenitais. Embora o HPV-16 e /ou sequências genómicas -18 também foram identificados no tracto urinário de doentes do sexo feminino com recorrentes e persistentes uretrite e cistite [8], [9], uma série de estudos investigaram a possibilidade de que a infecção por HPV é um risco fator que contribui para UC da bexiga; no entanto, os seus resultados em conflito, de modo que não há conclusões definitivas são possíveis [10] – [13].
Uma questão relacionada envolve a possibilidade de que a proteína p16 é sobre-expressos em UC da bexiga. A expressão de p16 é bem conhecida por estar associada com a infecção pelo HPV de alto risco em cancro do colo do útero e cancro da cabeça e pescoço e tem sido sugerido como um marcador substituto qualificado para a identificação de infecção por HPV biologicamente activa [14] – [16]. No entanto, apesar de muitos estudos recentes enfocando o componente SCC de UC da bexiga, não fica claro se a sobre-expressão da proteína p16 está associada a oncogênese de UC da bexiga [5], [10], [17] – [19].
Portanto, o objetivo do presente estudo foi determinar a presença de infecção por HPV e para validar a possibilidade de sobre-expressão de p16 como um marcador substituto para a infecção por HPV em UC /SCC da bexiga em fumantes Coreanos e não-fumantes .
Materiais e Métodos
Após a aprovação do estudo pelo nosso Institutional Review Board, 47 pacientes foram selecionados a partir dos arquivos do hospital de julho de 2001 a março de 2011 (IRB No. NCCNCS-12 -643). Todos os pacientes desde verbal consentimento informado. A autorização por escrito não foi obtido porque o IRB do Centro Nacional do Câncer aprovado para isentar o procedimento de autorização por escrito. Nós examinaram amostras de tecido embebidos em parafina obtidos durante a ressecção transuretral da bexiga ou cistectomia. O grupo de estudo consistiu de 35 pacientes com misto UC /SCC da bexiga e do grupo controle consistiu de 12 pacientes com metaplasia escamosa da bexiga. Dos pacientes do grupo de estudo, 33 tinham evidência de Misturado UC /SCC e dois tiveram extensa SCC com uma história de UC. A UC dos espécimes da bexiga foram classificados de acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) e da Sociedade Internacional de Patologia (ISUP) critérios de classificação urológicas e encenado acordo com a versão TNM de 2010. Nenhum dos pacientes tinha conhecido ou histórias de infecção Schistosoma heamatobium, SCC colo uterino, ou cabeça e pescoço SCC suspeita.
Um componente SCC representante de cada amostra de bloco de parafina foi seleccionado com base na presença de qualidade e quantidade adequada de ADN extraído. O DNA foi extraído usando estação de trabalho Qiagen BioRobot M48 (Qiagen, CA) e a qualidade e a quantidade de ADN foi medida utilizando Nanodrop ND 1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). A presença de infecção por HPV foi analisado utilizando um chip de ADN-HPV. genotipagem de HPV foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante, utilizando uma reacção em cadeia da polimerase (PCR), sistema de microarranjos de DNA com base na (Greencross, Gyeonggi, Coreia), que consiste de múltiplas sondas da sequência de L1 de HPV [20]. Estas sondas incluídas sondas específicas para os tipos de HPV de alto risco (HPV-16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66 e 68) e HPV de baixo risco tipos (HPV-6, 11, 34, 40, 42, 43, 44, 54 e 70). Consenso produtos de PCR foram hibridadas com as sondas sobre o chip, digitalizada (scanner GX, Perkin Elmer, MA), e em seguida analisados. A amplificação por PCR foi realizada utilizando 10 ul de ADN purificado.
A imuno-histoquímica (IHC) coloração da proteína p16 foi realizada utilizando anticorpos específicos E6H4 (DAKO, Carpinteria, CA). IHC expressão de p16 foi marcado utilizando um sistema de pontuação semiquantitativo composto como se segue: (1) intensidade de coloração, definido como 0 para negativo, para 1+ fraca, 2+ para moderada, e 3+ forte para; (2) Área positiva, definida como a (10 X), fracção de células de tumor coradas em todo o tumor; e (3) Resultado expressão, definida como a intensidade de coloração multiplicada pela área positiva. A pontuação máxima possível era 30. A superexpressão do p16 foi definida como uma pontuação 20 (Figura 1)
A:. Os componentes de carcinoma espinocelular estão localizados abaixo do forro de urotelial. As células tumorais são fortemente positivas para p16 (x100). B: Este caso é um carcinoma papilar mista urotelial (superior esquerdo) e carcinoma de células escamosas. O componente de carcinoma de células escamosas é forte positivo para p16. C:. A metaplasia escamosa não mostra nenhuma expressão da p16
As relações entre a presença de infecção por HPV e os parâmetros clínico foram avaliados através de testes exatos e testes de Mann-Whitney de Fisher. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando STATA (versão 9.2, STATA Inc, Tex, EUA). Os resultados foram considerados estatisticamente significativos se o valor p de dois lados era . 0,05
resultados
características clínicopatológicos dos 35 pacientes do grupo de estudo UC /SCC e 12 pacientes do grupo controle metaplasia escamosas são mostrados na Tabela 1. foram observadas diferenças demográficas entre os grupos de estudo e controle, incluindo a idade (71,2 ± 7,7 vs 66,5 ± 10,1 anos, p = 0,246), rácio entre homens e mulheres (82,9% vs. 66,7%, p = 0,251) e história de tabagismo (62,9% vs. 41,7%, p = 0,311). No grupo de estudo, 4 (12,1%) pacientes apresentavam carcinoma de baixo grau e 29 (87,9%) tinham alto grau. Para os restantes 2 pacientes, as amostras disponíveis (obtidas por ressecção transuretral da bexiga) continha apenas um componente SCC, proibindo assim a atribuição de um grau.
DNA do HPV foi detectado em 6 dos 35 (17,1%) amostras do grupo de estudo, e uma das amostras de 12 (8,3%) do grupo de controlo (Tabela 2). Todos os HPVs foram tipo 18, com exceção de amostra do grupo 1 estudo, que foi o tipo 35. A superexpressão do p16 foi detectada em 16 (45,7%) amostras do grupo de estudo e 1 (8,3%) da amostra grupo controle (Tabela 2). Ambos positividade HPV e superexpressão de p16 estavam presentes em apenas 3 (8,8%) amostras do grupo de estudo e nenhuma amostra grupo controle.
Para o grupo de estudo, não houve diferenças de idade, sexo, estágio ou grau entre HPV-negativo e casos HPV-positivos. Dos 29 casos HPV-negativos, 20 (69,0%) eram fumantes ou ex-fumantes, enquanto que dos 6 casos HPV-positivos, apenas 2 (33,3%) eram fumantes ou ex-fumantes. Para os fumantes ou ex-fumantes, o percentual com BC HPV-negativo foi de aproximadamente 2 vezes superior à percentagem com BC HPV-positivos. Por outro lado, as amostras BC de não-fumantes demonstrou um aproximadamente 2 vezes maior porcentagem de HPV-positividade de HPV-negatividade (Tabela 3).
Discussão
Além de tabagismo, exposição ocupacional a aminas aromáticas, e uso de drogas específicas, tais como a ciclofosfamida e a fenacetina, como factores de risco conhecidos de BC, a infecção pelo HPV, também tem sido sugerido como um potencial agente causador da UC da bexiga [21], [22 ]. A prevalência de HPV em UC da bexiga relatada em estudos anteriores variou de 0% a 81,3% [23] – [25]. A disparidade é provavelmente devido a problemas de amostragem, a contaminação, a sensibilidade dos sistemas de detecção e variação geográfica [26].
Youshya et al. [21]. relatou que 60% dos pacientes foram positivas para a expressão da proteína da cápside L1 de HPV por imunocoloração, mesmo que PCR utilizando consenso GP5 + /6 + iniciadores não conseguiu detectar ADN do HPV. A razão sugerido para a disparidade de taxas de detecção de HPV foi de anticorpos que foram utilizados e a sensibilidade de análise para a detecção de ADN [27]. Neste estudo, utilizamos o sistema de chip de microarranjo de DNA HPV. O sistema de HPV oligonucleótido micromatriz é uma biotecnologia recentemente desenvolvido que pode ser aplicado na prática clínica para a detecção e genotipificação do HPV. O microarray chip DNA HPV mostrou maior sensibilidade para a detecção do DNA do HPV de PCR sozinho no bloco de tecido [28], [29].
O HPV tem uma afinidade para células escamosas e sua associação com a SCC humana de do colo uterino, cabeça e pescoço, e do ânus tem sido bem estabelecida [7]. No estudo atual, a taxa de detecção do DNA do HPV foi de 2 vezes maior no grupo de estudo com misto UC /SCC da bexiga (17,5%) do que o grupo controle com displasia escamosa (8,3%). No entanto, não foi possível confirmar um aumento estatisticamente significativo no risco de infecção por HPV no grupo de estudo, provavelmente por causa do tamanho da amostra relativamente pequena (Tabela 2). Os nossos resultados são consistentes com outros estudos nos quais o DNA do HPV foi detectado em ambos UC da bexiga e SCC da bexiga [30].
Embora a infecção por HPV tem sido associado com BC em muitos estudos, é importante perceber que tal associação não é equivalente à causalidade. Nenhum dos estudos anteriores têm demonstrado a existência de uma relação directa entre a infecção pelo HPV e carcinogênese em BC, embora a possibilidade de um papel causal tem sido sugerido por causa da semelhança com cervical e os cânceres de cabeça e pescoço, para o qual uma relação causal tem sido estabelecida [19] [31], [32]. Para abordar esta questão, tentamos validar p16 superexpressão como um marcador substituto para a infecção pelo HPV activo no BC; no entanto, não fomos capazes de detectar uma forte associação entre a superexpressão de p16 e infecção por HPV em UC /SCC da bexiga (Tabela 2)
HPV codifica duas oncoproteínas:. E6 e E7 [33]. proteína E6 liga-se ao tipo selvagem (wt) p53, provocando assim a degradação mediada por ubiquitina do p53 ou inactivação de p53 wt directamente por formação de complexos [34], [35]. E7 se liga a pRb e liberta o do factor de transcrição E2F, o que facilita a proliferação de células posteriormente. P16 é uma cinase dependente de ciclina (CDK) inibidor que a fosforilação de pRb e G1 a progressão subsequente S blocos de CDK4-mediada. células infectadas por HPV sobre-expressar p16 numa tentativa de compensar a perda induzida por E7 de pRb. Devido a estes mecanismos de feedback negativo entre pRb e p16, superexpressão de p16 agora é frequentemente usado como um marcador substituto de expressão oncogene HPV. Neste estudo, o p16 foi sobre-expresso em 45,7% de amostras UC /SCC; No entanto, ambos HPV-positividade e p16 superexpressão esteve presente em apenas 8,6%. Esta constatação mostra, assim, que a expressão p16 pode não ser um forte marcador substituto para a evidência de infecção por HPV em UC /SCC, o que é consistente com os resultados de Alexander et al. [10].
Os resultados adicionais de interesse neste estudo foram os tipos de HPV e o maior percentual de não-fumantes no grupo de HPV-positivos do que no grupo de HPV-negativo. Quase todas as amostras HPV-positivos no grupo de estudo eram do tipo 18. A única excepção era uma amostra com HPV tipo 35, que tem sido considerada uma variante do HPV 16 e que não tenha sido previamente isolada a partir da bexiga [36]. Como é bem sabido que os tipos de HPV 16 e 18 são categorizados como HPV de alto risco para uma das principais causas de cancro entre os vários tipos de HPV [7], [16], [37], [38], o resultado com os tipos de HPV 18 e 35 pode ser apoiado nossa hipótese de infecção por HPV em associação com a carcinogênese de cancro da bexiga. Embora o aumento da probabilidade de HPV-positividade em não-fumantes não atingiu significância estatística devido ao pequeno tamanho da amostra, esta constatação sugere que a infecção pelo HPV pode ainda ser associado com o desenvolvimento de Misturado UC /SCC da bexiga urinária, especialmente em não- fumantes por causa de sua duas vezes maior o percentual de positividade de HPV do que o de fumantes (p = 0,286, Tabela 3).
Este estudo teve algumas limitações. Um estudo retrospectivo com um número relativamente pequeno de amostras limitado o seu poder estatístico e vícios potenciais. A serologia para HPV sugerido por Badawi não poderia ser realizada devido à concepção do estudo, embora a resposta de anticorpo (imunoglobulina [Ig] G) para L1 cápsides poderia ser usado como um marcador de HPV exposições cumulativas [9]. O grupo controle apresentou metaplasia escamosa, ao passo que um grupo de controle com urotélio normal pode ter sido mais apropriado para mostrar uma forte associação entre a infecção pelo HPV e carcinogênese de UC /SCC. No entanto, este estudo é importante na determinação da relação da infecção pelo HPV com prevalência de BC como um dos fatores etiológicos do cancro de bexiga e este é o primeiro estudo que descreve a importância clínica da possível associação entre a infecção pelo HPV e câncer de bexiga em não fumadores.
Conclusão
com base nas conclusões deste estudo, a infecção pelo HPV parece estar associado com o desenvolvimento de misturado UC /SCC da bexiga urinária, especialmente em não-fumantes entre os coreanos. No entanto, o papel da infecção por HPV no desenvolvimento deste tipo de cancro pode não ser tão significativo como a SCC do colo do útero ou da cabeça e pescoço. Além disso, a expressão de p16 não parece ser um forte marcador substituto para a evidência de infecção por HPV em UC da bexiga com diferenciação escamosa.