Abstract

Fundo

As associações entre polimorfismos do gene RAD51 (G135C e G172T) e risco de câncer têm sido investigados, mas os resultados foram inconclusivos. Para se ter uma avaliação abrangente da associação acima, foi realizada uma meta-análise de estudos publicados.

Métodos

Uma pesquisa computadorizada da PubMed, Embase e Web de bases de dados de conhecimento para todos os estudos relevantes foi executada e os dados foram analisados ​​em uma meta-análise. O odds ratio geral (OR) com intervalo de confiança de 95% (IC 95%) foi calculado para avaliar a força da associação entre polimorfismos RAD51 e risco de câncer. Os dados foram analisados ​​utilizando o modelo fixo ou de efeitos aleatórios quando apropriado. análise de sensibilidade e teste de viés de publicação também foram estimadas.

Resultados

No geral, um total de 54 estudos de caso-controle foram incluídos na meta-análise atual, entre os quais 42 estudos com 19,142 casos e 20.363 controles para o polimorfismo RAD51 G135C e 12 estudos com 6.646 casos e 6.783 controles para o polimorfismo G172T. Para o polimorfismo G135C, os resultados reunidos indicaram que aumento significativo do risco foi encontrada em cancros gerais (modelo homozigoto: OR = 1,776, IC 95% = 1,288-2,449; modelo genético alélicas: OR = 1,169, IC 95% = 1,016-1,345; recessivo modelo: OR = 1,946, IC 95% = 1,336-2,835), especialmente no cancro da mama (modelo homozigoto: OR = 1,498, IC 95% = 1,026-2,189; modelo recessivo: OR = 1,732, IC 95% = 1,170-2,562) . Para o polimorfismo G172T, um risco de câncer diminuiu foi observado em câncer de cabeça e pescoço (modelo homozigoto: OR = 0,621, IC 95% = 0,460-0,837; modelo genético alélicas: OR = 0,824, IC 95% = 0,716-0,948; modelo recessivo: OR = 0,639, IC 95% = 0,488-0,837).

Conclusões

os nossos resultados sugerem que o polimorfismo G135C Rad51 é um candidato para a suscetibilidade a cânceres em geral, especialmente ao câncer de mama, e que o Rad51 G172T pode desempenhar um papel protetor no desenvolvimento de câncer de cabeça e pescoço

Citation:. Zhao M, Chen P, Dong Y, Zhu X, Zhang X (2014) Relação entre Rad51 G135C e G172T variantes e a susceptibilidade ao cancro: uma meta-análise envolvendo 54 estudos caso-controle. PLoS ONE 9 (1): e87259. doi: 10.1371 /journal.pone.0087259

editor: Bin He, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 29 de agosto de 2013; Aceito: 24 de dezembro de 2013; Publicação: 27 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zhao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo Priority Academic Programa de Desenvolvimento das Instituições de Ensino Superior Jiangsu (PAPD). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Cancro humano ainda é uma das principais causas de morte em todo o mundo, resultando em uma das questões mais desafiadoras globais de saúde enfrentados pela humanidade hoje. De acordo com estudos etiológicos, carcinogênese do câncer é um processo complexo, de várias etapas e multifatorial, em que muitos fatores genéticos e ambientais estão envolvidos. Nos últimos anos, tornou-se claro que a variação individual de origens genéticas podem levar a várias consequências após a exposição ambiental e pode, finalmente, contribuir para a patogénese do cancro e progressão de [1] -. [3]

vias de reparação do ADN é responsável por manter a estabilidade e integridade genómica e desempenham um papel central na protecção contra a mutações genéticas [4]. genes de reparo de DNA têm sido propostos como fatores consideráveis ​​na prevenção de danos genômica e monitorar continuamente cromossomos para corrigir lesões causadas por agentes exógenos tais como luz ultravioleta ou fumaça de cigarro e mutagénicos endógenos [5], [6]. Estudos recentes indicam que a variação genética nos genes de reparo do DNA pode causar a capacidade de reparo do DNA alterado, levando ao acúmulo de danos no DNA, seguido de morte celular programada ou crescimento celular desregulado e pode explicar, em parte, para o desenvolvimento de câncer [7].

RAD51 humano, uma das principais proteínas de recombinação homóloga, é essencial para a recombinação meiótica e mitótico e desempenha um papel crucial na reparação de recombinação homóloga de DNA double-strand breaks [8]. Ele funciona através da formação de filamentos nucleoproteína em DNA de cadeia simples, induzindo emparelhamento homólogo e mediação de reações de troca vertente entre o DNA único e de cadeia dupla durante a reparação [9]. O gene RAD51 está localizado em 15q15.1 cromossomo em seres humanos e pensado para participar de uma via de reparo ruptura de fita dupla comum. Nos últimos anos, os polimorfismos do gene RAD51 têm atraído a atenção difundida. Dois polimorfismos comumente estudadas do gene RAD51 são G135C (rs1801320), um G para C transversion na posição 135, e G172T (rs1801321), uma transversão G para T na posição 172. Ambos estão localizados na região 5 ‘não traduzida e parecem ser de importância funcional. Estes dois polimorfismos foram mostrados para afetar a estabilidade do mRNA ou a eficiência de translação, levando a níveis de produto polipeptídeo alterados e alterando a função de codificação de proteínas RAD51, e influenciou a capacidade de reparo do DNA, até certo ponto [10], [11].

na última década, uma série de estudos de epidemiologia molecular ter sido feito para avaliar a associação entre os polimorfismos do gene RAD51 (G135C e G172T) e risco de câncer em populações diversas, mas os resultados permanecem controversos. Portanto, para obter uma estimativa mais precisa da associação entre G135C RAD51 e polimorfismos G172T eo risco de câncer, foi realizada uma meta-análise. Para o melhor de nosso conhecimento, esta é a meta-análise mais abrangente sobre os polimorfismos RAD51 e risco de câncer.

Materiais e Métodos

Estratégia de busca e extração de dados

Todos estudos investigaram a associação entre os polimorfismos do gene RAD51 (G135C e G172T) e risco de câncer foram identificados por pesquisas abrangentes baseados em computador de PubMed, Embase e web de bases de dados de conhecimento (a última actualização de busca em 25 de agosto de 2013). A pesquisa foi realizada utilizando várias combinações de palavras-chave como ( “gene RAD51” OU “RAD51 gene da recombinase”) e ( “polimorfismo” OU “variante” ou “variantes”). A pesquisa exata está disponível a pedido dos autores. Estudos adicionais também foram identificados por uma revista manual de todas as referências dos artigos recuperados. A nossa busca era restrita a estudos publicados no idioma Inglês

Os critérios de inclusão e exclusão

Estudos incluídos na meta-análise atual teve que satisfaçam todos os seguintes critérios:. (1) estudos para investigar as associações entre os polimorfismos de G135C ou G172T em RAD51gene eo risco de câncer; (2) um alheios caso-controle ou coorte (3) dados suficientes (distribuições de genótipos para casos e controles) para calcular uma razão de chances (OR) com a sua IC 95%; (4) estudos publicados em Inglês; (5) distribuição dos genótipos da população de controle consistente com Hardy-Weinberg (HWE). Nós não considerar resumos ou relatórios não publicados. relatos de caso, editoriais, artigos de revisão e cartas foram excluídos. Os artigos também foram excluídos se não incluir uma população de controle e não determinar a freqüência do genótipo. Se os estudos com os dados iguais ou sobrepostos foram publicados pelos mesmos autores, o estudo com o maior tamanho da amostra foi selecionada. A lista de verificação PRISMA apoio está disponível como informação de apoio; veja Checklist S1.

Os dados de extração

Dois autores extraíram informações de todas as publicações elegíveis de forma independente de acordo com os critérios de inclusão listados acima. O desacordo foi resolvido por a avaliação de um terceiro revisor e discussão até que um consenso foi alcançado. As seguintes características foram coletadas de cada estudo: o primeiro autor, ano de publicação, país, etnia do paciente, tipo de câncer, fonte de grupos de controle (controles populacionais ou baseados em hospitais ou mista (composta de ambos os controles populacionais e hospitalares )), e freqüências genotípicas em grupos de estudo e controle. Enquanto isso, nós não definir qualquer número mínimo de casos ou controles para ser incluído em nossa meta-análise.

A análise estatística

Foram analisados ​​primeira HWE nos controles para cada estudo utilizando bondade de teste -Fit (qui-quadrado ou teste exato de Fisher) e violação da HWE foi determinada pela P 0,05. odds ratio brutas (OR) com intervalo de confiança de 95% (IC) foram usadas para avaliar a força de associação entre os polimorfismos do gene RAD51 e suscetibilidade ao câncer. As RUP reunidos para o polimorfismo RAD51 G135C foram realizados sob modelo dominante (CC + GC vs. GG), modelo recessivo (CC vs. GG + GC), modelo de homozigotos (CC vs. GG) e modelo genético de alelos (C vs. G) . C e G representam o menor e o maior alelo respectivamente. Os mesmos métodos foram aplicados para a análise do polimorfismo G172T RAD51. foram conduzidas análises estratificadas em relação à etnia, tipo de câncer e fonte de controles.

A χ

2-baseado no Q-teste foi realizado para testar a heterogeneidade entre as comparações elegíveis, o que é considerado significativo se P 0,05. A variação causada pela heterogeneidade foi estimado pelo cálculo do índice de inconsistência I

2, com I

2 25%, 25-75% e 75%, representando baixo, moderado ou alto grau de inconsistência, respectivamente [12 ]. O pool ou foi calculado por um modelo de efeitos fixos (o método de Mantel-Haenszel) se o resultado do teste Q foi P 0,05, o que indicava que a heterogeneidade entre os estudos não foi significativo [13]. Caso contrário, foi utilizado um modelo de efeitos aleatórios (o método Der-Simonian e Laird) [14]. A análise de sensibilidade foi realizado através da remoção de cada estudo de cada vez para avaliar a estabilidade dos resultados obtidos em ambos os modelos genotípicas ou o modelo alélica. Além disso, o teste de Begg e teste de regressão linear de Egger por inspeção visual do gráfico de funil foram realizadas para resolver o viés de publicação potencial e P . 0,05 foi considerado como um indicador de viés de publicação significativa [15]

Todos estatística as análises foram realizadas utilizando o software STATA (versão 11; Stata Corporation, College Station, Texas). Dois lados valores de P inferiores a 0,05 foram considerados significativos.

Resultados

Estudos incluídos na meta-análise

A pesquisa bibliográfica inicial através de PubMed, Embase e Web of Knowledge bases de dados produziram 203 artigos publicados após duplicados foram removidos. Ao serem analisados ​​por títulos ou resumos, 115 registros não cumpriam os critérios de inclusão, deixando 88 estudos potencialmente relevantes que foram revistas em texto completo. Entre os restantes 88 artigos, 10 não estavam preocupados com G135C ou G172T polimorfismos em RAD51gene, 7 não foram estudos em humanos, 4 não foi publicado em Inglês, 6 não foram estudos de caso-controle, 5 não eram utilizáveis ​​dados relatados, 2 estavam reunidos resumos , 4 eram meta-análise, e 11 não estavam em HWE; Também foram excluídos destas publicações. Finalmente, um total de 54 estudos de caso-controle em 37 artigos foram identificados na meta-análise atual [16] – [54], entre os quais 42 com 19142 casos e 20363 controles para o polimorfismo RAD51 G135C e 12 com 6646 casos e 6783 controles para o polimorfismo G172T. distribuições de genótipos nos controles de todos os estudos selecionados estão de acordo com HWE. O fluxo de seleção do estudo é mostrado na Figura 1, e as principais características dos estudos elegíveis foram apresentados na Tabela 1 e Tabela 2.

Resultado-análise Meta

os resultados agrupados de meta-análise para a associação entre polimorfismos RAD51 (G135C e G172T) e suscetibilidade ao câncer são mostrados nas Tabelas 3 e 4. Tabelas

Como para o polimorfismo G135C, a total de 42 estudos de caso-controle em 37 publicações com 19,142 casos e 20.363 controles foram identificados. No geral, o risco de câncer significativamente elevado foi encontrado em todos os modelos genéticos (modelo homozigoto: OR = 1,776, IC 95% = 1,288-2,449, Figura 2; alélicas modelo genético: OR = 1,169, IC 95% = 1,016-1,345; modelo recessivo: OR = 1,946, IC 95% = 1,336-2,835), exceto no modelo dominante (OR = 1,039, IC 95% = 0,942-1,146). A heterogeneidade foi significativa em todos os modelos genéticos e os dados pormenorizados estão apresentados na Tabela 3. Estes estudos elegíveis foram analisados ​​por análise estratificada. Na análise estratificada do efeito de tipos de câncer, uma associação significativa foi encontrada para o cancro da mama (modelo homozigoto: OR = 1,498, IC 95% = 1,026 -2,189; modelo recessivo: OR = 1,732, IC 95% = 1,170-2,562) . No entanto, não houve associação significativa com o risco de câncer foi demonstrada em população total com câncer de ovário, câncer colorretal, leucemia mielóide aguda, bem como cancros da cabeça e pescoço. Quanto à etnia, nossos resultados mostraram polimorfismo G135C foi associado com um risco aumentado de câncer entre todas as populações sob modelo homozigoto e modelo recessivo. Quando estratificados com base em fonte de controles, riscos significativamente aumentados também foram observados em ambos os subgrupos de controle de base populacional e subgrupos controle de base hospitalar (Tabela 3).

Com relação ao polimorfismo G172T, um total de foram selecionados 12 estudos de caso-controle em 9 publicações com 6.646 casos e 6.783 controles. Como mostrado na Tabela 4, os resultados combinados não revelou associação significativa entre o polimorfismo G172T e suscetibilidade ao câncer em todos os modelos genéticos (modelo homozigoto: OR = 1,014, IC 95% = 0,872-1,173; modelo dominante: OR = 0,980, IC 95% = 0,906-1,061, Figura 3; modelo recessivo: OR = 1,011, IC 95% = 1,241-14,879; modelo genético alélicas: OR = 0,993, IC 95% = 0,941-1,048). A heterogeneidade foi significativa em todos os modelos genéticos, exceto para o modelo dominante (P = 0,414). Analisamos também estes estudos elegíveis por análise estratificada. Como dividimos os estudos por tipo de câncer, o resultado sugeriu que um risco de câncer diminuiu foi encontrado em cânceres de cabeça e pescoço (modelo homozigoto: OR = 0,621, IC 95% = 0,460-0,837; modelo genético alélicas: OR = 0,824, 95% CI = ,716-,948; modelo genético recessivo: OR = 0,639, IC 95% = ,488-,837) No entanto, não encontramos associação significativa entre o polimorfismo G172T e câncer de mama e de ovário. Quando estratificados de acordo com a etnia, o resultado mostrou nenhuma evidência de que o polimorfismo G172T foi significativamente associada com um risco aumentado de câncer em populações caucasianas. Na análise de subgrupo por fonte de controles, não houve associação significativa com o risco de câncer foi observado em ambos os subgrupos de controle de base populacional e hospitalares (Tabela 4).

análise Sensitive

Uma vez que a heterogeneidade significativa entre os estudos para RAD51 G135C e polimorfismos G172T, o modelo de efeito aleatório foi utilizada para calcular os resultados agrupados se a heterogeneidade foi significativa. Enquanto isso, nós também realizada uma análise de sensibilidade para avaliar os efeitos de cada estudo sobre as RUP agrupados por omissão de estudos individuais. A análise de sensibilidade mostrou que, para cada polimorfismo, nenhum estudo mudou qualitativamente as RUP em pool, sugerindo que os resultados desta meta-análise foram estatisticamente estável e confiável (Figure_S1 e Figura _S2).

diagnósticos de viés de publicação

identificar melhor os potenciais vieses de publicação de literaturas por lote de teste e funil de Egger. Em todos os estudos, nenhuma assimetria gráfico de funil foi encontrado. Os resultados do teste de Egger para RAD51 G135C e G172T polimorfismos não mostram qualquer evidência de viés de publicação (t = -1,11, P = 0,275 para G135C sob modelo de comparação homozigoto, Figura 4; t = -0,09, P = 0,929 para G172T sob homozigoto modelo de comparação, a Figura 5).

Discussão

é bem relatado que danos ruptura de fita dupla é a lesão mais perigoso observado em células eucarióticas, pois pode causar morte celular ou constituem uma séria ameaça para a viabilidade celular e estabilidade do genoma. Ele tem a potencialidade para prender permanentemente progressão do ciclo celular e pôr em perigo a sobrevivência das células [55]. Uma vez que os mecanismos de reparação do ADN é essencial para manter a estabilidade e funcionalidade genómico, defeitos na reparação do ADN pode resultar no desenvolvimento de aberrações cromossómicas que podem conduzir a um aumento da susceptibilidade para o cancro [4], [56], [57]. A recombinação homóloga e não homóloga final uni� têm sido extensivamente estudada como duas vias distintas na reparação de quebras de cadeia dupla em células de mamífero. A recombinação homóloga é um processo de alta fidelidade, que utiliza sequência de ADN, um cromatídeos irmãos ou cromossoma homóloga em estreita proximidade com a quebra como um modelo [58] – [60]. Neste processo de reparação, um procedimento inicial é a ressecção das 3’ends dos LAP para formar caudas de cadeia simples que invadem o DNA homóloga dupla hélice intacta formando uma junção Holliday [61], [62]. RAD51, um tipo de proteína de troca de cadeias ubíqua, é conhecido por ser uma enzima envolvida na central de ADN de cadeia dupla reparação de quebras por recombinação homóloga. Pode polimerizar para ADN e pesquisas de cadeia simples para a homologia de uma molécula de ADN duplex dador, normalmente o cromatídeos irmãos [63]. Recentes pesquisas têm sugerido dois polimorfismos comuns (G135C e G172T) localizados na região não traduzida 5 ‘parece ser de relevância funcional. Além disso, muitos estudos funcionais revelou que estes polimorfismos poderia afectar a estabilidade do mRNA ou a eficiência de translação, resultando em alterações em ambos os níveis de produto polipeptídico e a função de codificação de proteína RAD51, e, assim, influenciado a capacidade de reparação do ADN, em certa medida [10], [11] . Além disso, a associação de Rad51 variantes (G135C e G172T) eo risco de câncer tem sido extensivamente estudada em diferentes populações. No entanto, os resultados destes estudos foram inconsistentes. Portanto, realizamos uma meta-análise para resumir os efeitos da variação Rad51 sobre o risco de câncer.

Nesta meta-análise, foram realizados 54 estudos de caso-controle (42 para o polimorfismo G135C, 12 para o polimorfismo G172T) para fornecer a avaliação mais abrangente da relação entre polimorfismos RAD51 e risco de câncer. Para o polimorfismo G135C Rad51, o alelo C do polimorfismo G135C teve associação significativa com a suscetibilidade ao câncer para o modelo homozigoto, modelo genético alélicas e modelo genético recessivo em populações em geral. No entanto, os resultados sugerem que o polimorfismo Rad51 G172T não foi associado com o risco de câncer em geral, quando todos os estudos foram acumulados juntos. Considerando-se o possível papel das diferenças étnicas em origens genéticas, foi realizada subgrupo análise com base na etnia. Consequentemente, associação significativa foi encontrada em ambos os caucasianos e asiáticos para o polimorfismo G135C Rad51, mas não para o polimorfismo G172T. Quando estratificados pela fonte de controles, os nossos resultados encontraram evidências de uma associação entre o risco de câncer e polimorfismo G135C em ambos os controles de base populacional e hospitalar à base, enquanto que nenhuma associação significativa foi indicada em ambos os controles baseados em hospital de base populacional ou para G172T polimorfismo. Na análise estratificada por tipo de câncer, nossos resultados indicam fortemente que o polimorfismo G135C Rad51 foi associado com um risco aumentado de câncer de mama, enquanto o polimorfismo G172T com a diminuição da cabeça e risco de câncer de pescoço.

anteriores meta-análises foram realizadas para avaliar o efeito do polimorfismo G135C Rad51 em ambos o risco de cancro da mama ou leucemia aguda [64], [65]. Comparando com eles, nosso estudo tem algumas melhorias. Em primeiro lugar, este é o primeiro relatório não só para analisar dois polimorfismos no gene Rad51 (G135C e G172T) eo risco de câncer em formas diferentes de câncer, mas também para identificar o polimorfismo G172T como um fator de risco para câncer de cabeça e pescoço. Em segundo lugar, nós fornecemos uma análise de dados mais abrangente, calculando quatro modelos genéticos diferentes e realizando análise de subgrupo com base na etnia, tipos de câncer e fonte de controles. Em terceiro lugar, foram excluídos os estudos em que as distribuições de genótipos nos controles não estavam de acordo com HWE, porque eles poderiam influenciar os resultados.

A heterogeneidade entre os estudos deve ser indicada, pois pode afetar os pontos fortes da meta-análise. Na meta-análise atual, foi observada significância heterogeneidade tanto para Rad51 G135C e polimorfismos G172T. Assim, modelos de efeitos aleatórios foram utilizados se heterogeneidade significativa foi identificada. Enquanto isso, a diminuir a heterogeneidade, foi realizada análise de subgrupo com base na etnia, tipos de câncer e fonte de controles. Os resultados indicaram que a heterogeneidade reduzida ou desapareceu em subgrupos. Também foi realizada análise de sensibilidade para determinar a origem primária da heterogeneidade. A análise mostrou que nenhum estudo materialmente alterado as RUP em pool, sugerindo que os resultados desta meta-análise foram estatisticamente estável e confiável. não foi observado o viés de publicação para a associação entre estes dois polimorfismo eo risco de câncer.

Algumas limitações do presente meta-análise deve ser levado em conta na interpretação dos resultados. Primeiro de tudo, apenas estudos publicados e artigos escritos em Inglês foram pesquisados ​​nesta meta-análise, foram negligenciados alguns estudos ou estudos inéditos escritos em outra língua que possam também atendem aos critérios de inclusão. Em segundo lugar, em alguns estudos, a informação detalhada tais como idade e sexo no caso e controlo de diferentes genótipos não estavam disponíveis, o que limita ainda mais estimativas para um certo ponto. Em terceiro lugar, a meta-análise atual não considerou interações gene-gene e gene-ambiente, devido à falta de dados suficientes. Mais estudos são necessários para avaliar as possíveis interações gene-gene e gene-ambiente na associação entre polimorfismo do gene Rad51 e susceptibilidade ao câncer. Em quarto lugar, a maioria dos pacientes em nosso estudo foram caucasianos, o que pode limitar a aplicação geral dos nossos resultados. Apesar destes, o nosso presente meta-análise também teve algumas vantagens. Em primeiro lugar, analisar dois polimorfismos do gene RAD51 com um total de 54 estudos de caso-controle tem um muito maior poder estatístico comparado com qualquer único estudo. Em segundo lugar, foram excluídos os estudos em que freqüências genotípicas nos controles não estavam em conformidade com HWE, fornecendo elementos de prova suficientes para tirar conclusões seguras sobre a associação entre os polimorfismos RAD51 e risco de câncer. Em terceiro lugar, a estabilidade ea credibilidade da presente meta-análise foi confirmada por análises de sensibilidade e análises vieses de publicação. Por último, os resultados destacam a associação entre polimorfismos do gene RAD51 e desenvolvimento do cancro e irá fornecer direções para futuras pesquisas sobre o mecanismo molecular do câncer.

Conclusões

Nossas investigações sugerem que o polimorfismo G135C Rad51 é um candidato para a suscetibilidade a cânceres em geral, especialmente ao câncer de mama, e que o polimorfismo G172T está significativamente associado à diminuição do risco de câncer de cabeça e pescoço. Mais estudos são necessários, com grande tamanho da amostra e avaliação mais profunda sobre o efeito do gene-gene e interações gene-ambiente na Rad51 polimorfismos e risco de câncer.

Informações de Apoio

Figura S1. análise

Sensibilidade do resumo ou da associação entre Rad51 polimorfismo G135C e suscetibilidade ao câncer no modelo homozigoto

doi:. 10.1371 /journal.pone.0087259.s001

(TIF)

Figura S2. análise

Sensibilidade do resumo ou da associação entre Rad51 G172T polimorfismo e suscetibilidade ao câncer no modelo homozigoto

doi:. 10.1371 /journal.pone.0087259.s002

(TIF)

Checklist S1.

PRISMA Checklist

doi:. 10.1371 /journal.pone.0087259.s003

(DOCX)