Abstract

limitações atuais da quimioterapia incluem a toxicidade nos tecidos saudáveis ​​e multirresistência da maligna células. Um certo número de estratégias recentes anti-cancro visando determinar a maquinaria apoptótica mitocondrial para induzir a morte das células tumorais. Neste estudo, criámos protocolos para purificar mitocôndrias funcionais de várias linhas de células humanas para analisar o efeito dos compostos peptídicos e xenobióticos descritos para abrigar tanto Bcl-2 propriedades de inibição ou efeitos tóxicos relacionados com a mitocôndria. Mitocondrial permeabilização da membrana interior e exterior foram sistematicamente investigadas em mitocôndrias de células de cancro in

contra

mitocôndrias não-cancerosas. O (t-) proteína Bid truncado, peptídeos sintéticos BH3 de Bim e Bak, ea pequena molécula ABT-737 induziu um mitochondrio-toxicidade específica do tumor e OMP-restrito, enquanto os compostos como HA-14,1, YC-137, queleritrina, gossipol, TW-37 ou EM20-25 não o fez. Descobrimos que ABT-737 pode induzir a liberação Bax dependente de proteínas apoptóticos (citocromo c, Smac /Diablo e Omi /HtrA2 mas não FIA) de várias, mas nem todas as mitocôndrias de células de câncer. Além disso, ABT-737 além de mitocôndrias de células de cancro isolado induzida por oligomerização de Bax e /ou monómeros de Bak já inseridos na membrana mitocondrial. Finalmente immunoprecipatations indicou que ABT-737 induz a Bax, Bak e Bim desequestration de Bcl-2 e Bcl-xL, mas não a partir de Mcl-1L. Este estudo investiga pela primeira vez, o mecanismo de acção de ABT-737 como um agente único em mitocôndrias isoladas de células de cancro. Assim, este método baseado na MOMP (mitocondrial permeabilização da membrana externa) é uma ferramenta de triagem interessante, adaptado para a identificação de Bcl-2 antagonistas com perfil de toxicidade seletiva contra mitocôndria da célula cancerosa, mas desprovido de toxicidade contra mitocôndrias saudáveis ​​

Citation.: buron N, Porceddu H, Brabante H, Desgué D, Racoeur C, Lassalle M, et al. (2010) Uso de celular Lines câncer humano mitocôndria para explorar os mecanismos de BH3 Peptides e ABT-737 Induzida Membrana Mitocondrial permeabilização. PLoS ONE 5 (3): e9924. doi: 10.1371 /journal.pone.0009924

editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Canadá |

Recebido: 15 Janeiro, 2010; Aceito: 01 de março de 2010; Publicação: 31 de março de 2010

Direitos de autor: © 2010 Buron et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Agence Nationale pour la Valorização de la Recherche (https://www.agence-nationale-recherche.fr) para Theraptosis SA (https://www.theraptosis.com), por Theraptosis SA e Mitologics SAS (http: //www.mitologics.com). A Agence Nationale pour la Valorização de la Recherche teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

interesses concorrentes:. Autores ABS, NB e MP declarar competindo interesses financeiros devido à participação no Mitologics SAS. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A apoptose desregulação foi mostrado para underly diversas patologias incluindo câncer [1], [2 ]. Está bem estabelecido que diversos acontecimentos de sinalização dentro de apoptose convergem para as mitocôndrias que sofrem de permeabilização da membrana externa (OMP) que desencadeia a libertação de factores de apoptogénicas solúveis do espaço intermembranar, tais como citocromo C e uma série subsequente de activação de um conjunto de enzimas proteolíticas, a caspases que conduzem a desmontagem da estrutura celular apoptótica [3].

MOMP está sob o controlo de membros da família de proteínas Bcl-2, que inclui (1) proteínas anti-apoptóticas, como Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1 e A1 /Bfl-1 contendo todos os quatro Bcl-2 (domínios de homologia BH1-4), (2) as proteínas pró-apoptóticos tais como Bax, Bak, Bok sem o domínio BH4 e (3) pro- apoptótica BH3-somente proteínas como Bid, Bim, Bad, Bmf, Noxa e Puma [4] – [8]. No modelo de ativação direta, ou indução do BIM Bid é necessário para Bax ou Bak para oligomerizar e formar poros na membrana mitocondrial externa (MOM) [9], [10]. As proteínas anti-apoptóticas pode bloquear este processo no MOM sequestrando principalmente proteínas Bax /Bak [11] – [13]. No modelo de activação indirecta [14], [15], BH3-somente proteínas pode antagonizar o efeito anti-apoptótico e libertar proteínas Bax /Bak. Ainda é uma questão de debate se Bax e Bak podem interagir com proteínas como VDAC (tensão canal dependente ânion) e /ou ANT (translocator nucleotídeo adenina) para regular o poro de transição de permeabilidade (PTP) [16]. Ao nível mitocondrial, o citocromo c é distribuído em dois grupos distintos: 15-20% no espaço intermembranar e a fracção maior (80%) no espaço intracristae [17]. Assim, BH3 mimético de peptídeo precisa de remodelação da matriz para liberar a segunda piscina do citocromo c [18]. Outros factores apoptóticos como Omi /HtrA2 e Smac /DIABLO (effectors morte dependente de caspase) ou o fator FIA de indução de apoptose e EndoG (efetoras morte independente de caspase) são liberados após MOMP.

A permeabilização da membrana mitocondrial ( processo MMP) é frequentemente alterados em células de cancro, possivelmente como resultado de sobre-expressão de PTP componente [19], a regulação positiva de membros anti-apoptóticos da família Bcl-2 e /ou infra-regulação de Bax [20]. Estas numerosas estratégias anti-cancro underly segmentação componentes da maquinaria de morte celular de núcleo de promover a morte de células de tumor [21], [22]. Essas estratégias são baseadas no uso de péptidos que mimetizam BH3 [14], [23], anti-sentido [24] ou de interferência de ARN [25] contra Bcl-2, e pequenas moléculas naturais ou sintéticas que se ligam especificamente a proteínas Bcl-2 family . Por exemplo rastreio abordagens utilizando ressonância magnética nuclear, concepção baseada na estrutura e síntese química combinatória, levou à identificação de ABT-737, um inibidor de molécula pequena das proteínas anti-apoptóticas Bcl-2, Bcl-XL e Bcl-W, mas não Mcl-1 e A1 /Bfl1 [26]. ABT-737 é considerado como sendo um mau-como BH3 mimética porque péptido tanto ABT-737 e Bad BH3 ligar o mesmo subconjunto de bcl-2 proteínas pró-sobrevivência [27] e induzem a libertação de citocromo c nas mitocôndrias obtidos a partir de “preparado para a morte “células tumorais [28]. No entanto, a fraca afinidade de ABT-737 para as proteínas pró-sobrevivência MCL-1 e A1 /Bfl1 [26] pode ser um determinante chave da resistência das células tumorais a este composto [29].

Criámos -se uma tela multiparamétrica de mitocôndrias purificadas para identificar compostos que induzem OMP de mitocôndrias isoladas a partir de linhas celulares de cancro, mas não de mitocôndrias isoladas de células não-cancerosas. Entre vários compostos (de química, peptídico ou origens protéicos) descreveu a meta mitocôndrias, descobrimos que apenas t-Bid, Bak BH3 e Bim BH3 peptídeos recombinantes, e ABT-737 apresentam um tumor específico mitochondrio-toxicidade direta e induzir relativamente grande OMP, devido à Bax e Bak oligomerização. Por exploração adicional de OMP induzida por ABT-737 ao nível mitocondrial isento de células, verificou-se que (1) as mitocôndrias de células de cancro a partir de fontes diferentes diferem na sua sensibilidade para ABT-737 correlacionando-se com diferentes padrões de (exterior) de Bcl associada à membrana membros da família -2 e as suas interacções, (2) ABT-737 induz a Bax, Bak, e Bim desequestration a partir de Bcl-xL e Bcl-2, mas não a partir de Bcl-w ou Mcl-1.

resultados

Isolamento e caracterização funcional de mitocôndrias saudáveis ​​e tumorais

As mitocôndrias de ambos os tecidos saudáveis ​​(fígado de rato) e tumor humano (PC-3, próstata) linha celular foram purificados por centrifugação isopícnica em gradientes de densidade de Percoll. As mitocôndrias isoladas foram encontrados altamente intacta como demonstrado pelo ensaio de acessibilidade citocromo c oxidase e análise de citometria de fluxo FSC SSC /[30]. Ultraestrutural estudos comparativos de mitocôndrias isoladas de fígado ou linha celular de tumor PC-3 revelaram uma organização de matriz /cristas relativamente semelhante, apesar de uma ligeira diferença em densidade entre o tumor (baixa densidade) e fígado (alta densidade) mitocôndrias (Fig. 1A). O cálcio (50 uM) induz uma grande ruptura da membrana do exterior em ambas as mitocôndrias de tecidos e linha de células tumorais saudáveis ​​seguido por um inchaço, que é inibida pela ciclosporina A (CsA), o que indica uma poro de transição da permeabilidade intactos e funcionais em ambos os tipos mitocondriais. investigações polarográficos foram próxima realizados no fígado e PC-3 mitocôndrias (Fig. 1B). Succinato de oxidação era essencialmente dependente da adição de ADP e de um índice de controlo respiratório (DIC), de 3 de oxidação associada com succinato indicada a integridade funcional das mitocôndrias, incluindo as isoladas a partir de células cultivadas de tumor. Da mesma forma, mitocôndrias isoladas de HT-29, linhas celulares de cancro Jurkat HCT-116 e e HME-1 A linha de células não-cancerosas apresentou elevado nível de integridade e funcionalidade (não mostrado).

. Análise ultra-estrutural das mitocôndrias isoladas e sua capacidade de inchar. Eletromicrografias foram obtidos após a incubação de mitocôndrias isoladas de fígado de rato saudável, ou PC-3 linhas de células tumorais não tratadas (NT) ou tratadas com Ca

2+ (50 uM) ou com uma pré-incubação de 5 min com ciclosporina A (CsA ; 10? M) ou ruténio vermelho (RR; 1? M) antes da adição de cálcio. A percentagem de edema mitocondrial foi 10% no controlo e 80% 30 minutos depois de Ca

2+ adição (n = 3). As barras de escala 1 pM. Propriedades B. oxidativo do fígado isoladas e mitocôndrias PC-3. Traços representam o consumo de oxigénio pelas mitocôndrias isoladas (100 ug) após a adição dos reagentes indicados. Números ao longo do traçado são nmol de O

2 consumido por minuto por miligrama de proteína. O índice de controlo respiratório (DIC) é calculada para cada tipo de mitocôndrias, como indicado em Materiais e Métodos. C. Para avaliar inchaço mitocondrial e ΔΨ

perda m, mitocôndrias isoladas de ratos saudáveis ​​do fígado ou a linha de células PC-3 foram distribuídas em microplacas de 96 poços e incubadas durante 30 min, quer com Ca

2 + (100 uM) na presença (amarelo) ou ausência (rosa) de CsA (10 mM), com

m

ClCCP (turquesa, 50 mM) ou com t-Bid (roxo; 1 nM). Para a quantificação da libertação de citocromo c, as mitocôndrias isoladas foram tratadas com concentrações crescentes de proteína recombinante Bid-T e o sobrenadante mitocondrial foi submetido a ensaios de ELISA, dadas em percentagem de libertação em comparação com 20 ug /ml de alameticina (Ala; 100% de citocromo c release) (n = 3 ensaios independentes).

método de triagem multiparamétrica em mitocôndrias isoladas saudáveis ​​e tumorais

isolado mitocôndrias foram analisados ​​em uma plataforma de triagem que permitiu a quantificação da membrana mitocondrial permeabilização (inchaço; a Fig. 1C; painel esquerdo) mais transmembranar mitocondrial potencial (ΔΨm; a Fig. 1C, painel do meio) utilizando espectrofluorimetria em tempo real e a libertação do citocromo c por ELISA como um índice para MOMP (Fig 1C;. painel da direita). detecção ΔΨm em tempo real refletido alterações membrana interna e da cadeia respiratória, mas não permitiu observar adiada ΔΨm em resposta a compostos pró-apoptóticos. Quando incubada em soluções tampão hipotónico, mitocôndrias de células normais e tumorais fez inchamento (perda de D. O. a 550 nm) na presença de cálcio de uma maneira dependente da CsA. No entanto, a amplitude inchaço foi reduzida no caso das mitocôndrias do tumor de acordo com a sua densidade mais baixa em comparação com mitocôndrias de fígado. Cálcio e

m

ClCCP induziu uma perda rápida ΔΨm caracterizado por um aumento da fluorescência correspondente a rodamina-123 dequenching devido a uma diminuição da concentração do corante na mitocôndria despolarizadas. Nós portanto observado que a proteína recombinante t-Bid não teve efeito sobre o inchaço e ΔΨm mas induziu libertação de citocromo c especificamente em PC-3 (Fig. 1C), HT-29, HCT-116 e Jurkat (não mostrado) mitocôndrias de células em um modo dependente da concentração, tal como indicado por análise ELISA dos sobrenadantes.

Rastreio de inibidores da família Bcl-2 putativos

seguinte avaliou o efeito de inibidores de Bcl-2 em mitocôndrias isoladas de fígado de rato, inchaço, ΔΨm e citocromo

c

liberação (Fig 2A.): células humanas (PC-3), utilizando 3 parâmetros não-cancerosos (HME-1) e canceroso. O induzido proteína libertação de citocromo c t-Bid recombinante (sem inchaço e perda ΔΨm) a partir de PC-3 mitocôndrias, mas não teve efeito sobre fígado e HME-1 mitocôndrias a 100 nM. Alguns peptídeos BH3 (derivados de Bak, Bim, Bax, Bad, Bid, Noxa e Puma) a partir de fontes humanas ou mouse também foram testados. Entre estes, apenas humano Bak BH3 e Bim BH3 (Fig. 2A) induzida mitochondrio-toxicidade para células tumorais (PC-3) mitocôndrias, sendo inativa a 100 mM no fígado e HME-1 mitocôndrias. sequências notável, até mesmo o rato correspondendo BH3 são inativos em mitocôndrias de fígado de rato, excluindo uma má interpretação, devido à especificidade de espécie (não mostrado). Em contraste com os outros inibidores de moléculas pequenas avaliadas neste estudo, apenas ABT-737 exibido mitocôndrias especificidade do tumor, induzindo a libertação de citocromo c de mitocôndrias PC-3, mas não a partir de fígado e HME-1 mitocôndrias. A libertação de citocromo c a partir de PC-3 mitocôndrias tratadas com t-Bid e ABT-737 ocorreu sem qualquer inchaço (Fig. 2A e microscopia electrónica, não mostrada) ou perda ΔΨm (Fig. 2A) durante um min-tratamento 45, o que indica que estas condições ocorre uma OMP específica. Em seguida, alargou o estudo de ABT-737 para efeitos mitocôndrias isoladas de HCT-116, HT-29 e linhas celulares de cancro Jurkat (Fig. 2B) e observou sensibilidade diferente para ABT-737. Com efeito, HT-29 mitocôndrias foram muito menos sensível a ABT-737 do que o PC-3, HCT-116 e Jurkat, estes três laters apresentando um nível similar de sensibilidade para ABT-737. Estes dados sugerem que a ABT-737 induz a liberação de citocromo c de vários, mas não todos mitocôndrias isoladas de células cancerosas.

A. Mitocôndrias isoladas de fígado de rato, células (PC-3) humanos não-cancerosos (HME-1) e cancerosas foram tratados com concentrações crescentes de t-Bid, Bak BH3, HA-14,1, YC-137, queleritrina, Gossypol, TW- 37, EM20-25 e ABT-737 antes da avaliação do edema mitocondrial e ΔΨ

perda de m. Alternativamente, o sobrenadante mitocondrial foi submetido a ensaios de ELISA para a quantificação da libertação de citocromo c. concentração eficaz que induz 50% do efeito máximo (CE

50) é dada por inchaço (100% de efeito, com 50? M de Ca

2+), ΔΨ

perda de m (100% de efeito com 50 uM

m

ClCCP) e a libertação de citocromo C (100% de efeito com 20 ug /ml de alameticina) (n = 3 expericias independentes). B. As mitocôndrias isoladas de fígado de rato ou HME-1, PC-3, HCT-116, HT-29 e linhas de células de Jurkat foram incubadas durante 45 min a 30 ° C com concentrações crescentes de ABT-737 e os sobrenadantes foram sujeitos a citocromo c imunotransferência (NT: sem tratamento; Ala: alameticina 20 ug /ml).

MOMP induzida por ABT-737 em mitocôndrias de células de cancro está associado com Bak e /ou Bak oligomerização

Nós investigado posteriormente se OMP induzida ABT-737 foi seletivo para o citocromo c ou pode permitir a liberação de outros fatores mitocondriais apoptogénicas (Fig. 3). fígado de rato isolado, PC-3 e mitocôndrias Jurkat foram tratadas com Bak BH3, ABT-737, ou t-Bid e os sobrenadantes submetidas a immunoblotting. Smac /DIABLO (23 kDa) e Omi /HtrA2 (37 kDa) foram libertados a partir de PC-3 e Jurkat mitocôndria enquanto que AIF (56 kDa) não foi (Fig. 3), o que sugere que estes compostos induziu uma mitocôndria remodelação não suficiente para FIA lançamento. A seguir, utilizado isolado mitocôndrias do Bax e /ou Bak knock-out linhas de células HCT-116 no qual ausência de Bax e /ou Bak foi verificada por immunoblot (Fig. 4A). Descobrimos que ABT-737 induziu a liberação de citocromo c de Bax +/- e Bak – /- mitocôndria, mas não de Bax – /- ou Bax /Bak dupla mitocôndrias knock-out (Fig 4B.). Estes dados indicou o papel crítico da Bax no mecanismo de acção de ABT-737. Além disso, t-Bid e MOMP induzida por ABT-737 foi controlada por um excesso de Bcl-XL (Fig. 4C) ou Bcl-2 (não mostrado) proteínas recombinantes, suportando a hipótese de a formação de um canal específico no exterior membrana [31]

mitocôndrias isoladas de fígado de rato, células Jurkat PC-3 e não foram tratadas (NT) ou incubadas com alameticina (Ala; 20 ug /ml; controlo positivo)., péptido Bak BH3 (10 uM), ABT-737 (1 | iM) ou recombinante t-Bid (1 nM) durante 45 min. sobrenadantes mitocondriais foram submetidos a imunodetecção de citocromo c, Smac /DIABLO, Omi /Htra2 e FIA ​​(Western blot são representativos de 3 experiências independentes). Note-se que o citocromo c (15 kDa), Smac /DIABLO (23 kDa), e Omi /Htra2 (37 kDa), mas não AIF (56 kDa) são liberados das mitocôndrias de células de câncer.

A. extractos celulares totais de HCT-116 +/- Bax, Bax – /-, Bak – /- e Bax /Bak – /- (NSO) linhas de células foram submetidos a Bax e Bak imunotransferência para controlar o seu conteúdo Bax e Bak. B. As mitocôndrias isoladas de HCT-116 +/- Bax, Bax – /-, Bak – /- e Bax /Bak – /- (NSO) linhas de células foram incubadas com concentrações crescentes de ABT-737 e o sobrenadante foi sujeito a imunotransf erência detecção de citocromo C (NT: sem tratamento; Ala: alameticina 20 ug /ml). C. O citocromo c libertação induzida por t-Bid e ABT-737 é inibida por um excesso de recombinante Bcl-xL. PC-3 mitocôndrias foram incubadas com ABT-737 (1 | iM) ou t-Bid (1 nM) durante 45 min, após um pré-tratamento de 5 min com recombinante de Bcl-xL (100 a 400 nm) e o sobrenadante foi sujeito a anti- citocromo c imunotransferência (NT: sem tratamento; Ala: alameticina 20 ug /ml). Note-se que Bcl-xL reduz fortemente tanto t-Bid e induzida por ABT-737 libertação de citocromo c (n = 2 experiências independentes).

Tendo verificado que Bax permaneceu ligada à OM mitocondrial, mesmo após um lava-se com um tampão de homogeneização alcalina (pH 11,6) (não representada) sugerindo uma inserção de Bax na membrana [32], queríamos mais para examinar se ABT-737 pode induzir a oligomerização das piscinas Bax e Bak já associados a mitocôndrias de células tumorais . Semelhante ao t-Bid e péptidos Bim ou BH3 Bak, ABT-737, Bax induzida e /ou Bak oligomerização no PC-3 e Jurkat mitocôndrias, como, objetivou usando o agente de 1,6-bismaleimido-hexano de reticulação (BMH; A Fig. 5 ). Mutado [L78A; D83A] peptídeo Bak BH3 foi ineficiente para induzir a liberação de citocromo c e Bax /Bak oligomerização quando adicionado a PC-3 mitocôndrias (Fig. 5a). No PC-3 mitocôndrias, que contêm tanto Bax e Bak, um fraco oligomerização Bak ocorreu com peptídeos BH3 ou ABT-737, sugerindo um papel importante para Bax no desencadeamento de formação de canais nesta linha celular (Fig 5A;. Painéis de média). A seguir, utilizado (±) -1- (3,6-dibromocarbazol-9-il) -3-piperazin-1-il-propan-2-ol identificado por Bombrun e colaboradores [33] como um bloqueador do canal de Bax ( BCB) capaz de inibir a induzida por t-Bid libertação de citocromo c [33], [34] (Fig. 5A). O pré-tratamento das mitocôndrias de células de câncer com este BCB impediu a liberação de citocromo c desencadeada por Bak BH3, Bim BH3, t-Bid ou tratamento ABT-737 (Fig. 5A). Além disso, descobrimos que o BCB impedido Bax /Bak oligomerização em resposta a tratamentos com ABT-737, bem como t-Bid e peptídeos Bak ou Bim BH3 (Fig. 5A e 5B).

mitocôndrias isoladas de PC-3 (a) e Jurkat (B) as linhas celulares foram incubados ou não com o BCB, um bloqueador do canal de Bax (2 uM (±) -1- (3,6-dibromocarbazol-9-il) -3-piperazin 1-il-propan-2-ol) antes do tratamento com 1 uM de BH3 Bim, Bak BH3 10 uM, 10 ^ M de BH3 mutado Bak, 1 nM de t-Bid ou indicado de concentrações de ABT-737. Os sobrenadantes foram analisados ​​quanto à libertação de citocromo c (painéis inferiores; NT: não tratados, Ala: alameticina 20 ug /ml) e pelotas mitocondriais foram tratados com o agente de ligação cruzada irreversível BMH (1 mM). Quarenta microgramas de proteína de cada reacção foi efectuada em SDS-PAGE e imunotransferidas com anticorpos anti-Bax (A) ou anti-Bak (A, B). Bax /Bak oligomerização acompanha induzida ABT-737 libertação de citocromo c, que é inibida pelo BCB.

Em conjunto, esses dados sugerem que ABT-737 provocou a liberação de proteínas apoptogénicas das mitocôndrias de células de câncer por formação de canais multiméricas Bax /Bak como mostrado pela correlação entre Bax e Bak oligomerização e a libertação do citocromo c (Fig. 5).

MOMP induzida por ABT-737 em mitocôndrias de células de cancro está associada com determinadas perturbações complexas, dependendo do tipo mitocondrial

Como se observaram diferenças na sensibilidade entre os vários tipos de mitocondriais utilizadas neste estudo, foi analisada a pró e membros da família Bcl-2, anti-apoptóticos associados às membranas mitocondriais (Fig. 6). Entre as proteínas anti-apoptóticas, Bcl-2 foi apenas presente em PC-3, Jurkat e HCT-116 mitocôndria, enquanto a Bcl-w, Bcl-xL e A1 foram detectados em todos os tipos mitocondrial (Fig. 6A). Curiosamente, a Bcl-xL foi quantitativamente mais importante em mitocôndrias de células de cancro do que em sua contraparte saudável. Anti-apoptótica de Mcl-1 L estava presente em grande quantidade na mitocôndria Jurkat PC-3 e e em quantidade menor em HT-29 mitocôndrias. No que diz respeito as proteínas pró-apoptóticas, enquanto Bak estava presente em todos os tipos mitocondriais, Bax estava presente em PC-3, HT-29, HCT-116 e HME-1 mas não as mitocôndrias em células Jurkat e mitocôndrias de fígado. Entre os activadores de BH3-somente, Bim foi encontrada na mitocôndria de células de cancro, mas não nos que a partir de 1-HME e fígado (Fig. 6B), enquanto lance não pode ser detectada em qualquer um destes tipos mitocondriais (não mostrado). Entre as únicas BH3 sensibilizadores, Bad foi detectado no PC-3, HT-29 e Jurkat membranas mitocondriais (Fig. 6B), enquanto Puma, Noxas, HRK, Bik, Bok e Bmf não foram (não mostrado). Bcl-2, Bcl-XL e BH3 apenas sensibilizadores (ex BIM) pode muito bem ser actores-chave, mesmo que seja difícil de tal análise proteômica para explicar as diferenças de sensibilidade à ABT-737. Na verdade, é digno de nota que HME-1 mitocôndrias têm nem Bim, nem Bcl-2 e apenas baixo nível de Bcl-x, que pode distingui-las das mitocôndrias de células cancerígenas sensíveis.

extractos celulares totais (TE) e mitocondrial extractos (M) de HCT-116 linhas celulares de cancro de PC-3, HT-29, células Jurkat e ou de-um HME linha celular e do rato saudável do fígado foram analisados ​​por Western blot para detecção do anticorpo anti-apoptótica (a) de Bcl-2 , Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1D e A1 proteínas e proteínas pró-apoptótica (B) Bak, Bax, Bim, ruim e MCL-1S.

Como ABT-737 é deliberando por perturbação complexa entre pró e proteínas anti-apoptóticos, o próximo investigado algumas perturbações complexas por co-imunoprecipitação no PC-3, HT-29 e mitocôndrias Jurkat tratados com ABT-737 (Fig. 7). Qualquer que seja a linha celular foram detectados ligações semelhantes: Bcl-xL de Bak e Bax, Bcl-2 e Bax e fracamente a Bak, Mcl-1 apenas para Bak (Fig. 7) e Bcl-w a Bax (não mostrado). Observou-se que induzida por ABT-737 de libertação do citocromo c está correlacionada com a Bax, Bak (Fig. 7) e Bim (não mostrado) a libertação do Bcl-xL e Bcl-2. No entanto, ABT-737 não teve efeito sobre Bak e Bim por sequestro de Mcl-1 (Fig. 7), ou por Bax sequestro Bcl-w (não mostrado), estes complexos remanescentes após o tratamento. Estes resultados sugeriram que a Bax, Bak e Bim libertação a partir de Bcl-2 e Bcl-xL em resposta a ABT-737 foi responsável pela formação de canais e libertação de citocromo c em PC-3 (Fig. 8) e mitocôndrias Jurkat. Em contraste, HT-29 mitocôndrias contendo menos Bim e sendo privadas de Bcl-2 foram menos sensíveis à ABT-737 de tratamento, o que sugere um papel importante para a sensibilidade de Bcl-2 e bim em ABT-737.

mitocôndrias isoladas de PC-3 (a), HT-29 (B) e Jurkat (C) As células foram não tratadas (NT) ou tratada com t-Bid (bid; 2 nM) ou ABT-737 (ABT; 1 uM) antes de ser imunoprecipitados pelos anticorpos dirigidos contra a proteína Bcl-2, Bcl-xL e Mcl-1 proteínas anti-apoptóticas. extratos mitocondriais total (TE; controlo positivo de immunoblot; 25 ug) foram utilizados como controle, enquanto um ligado mitocondrial foi submetido a processo de imunoprecipitação sem anticorpo (C; controle negativo de imunoprecipitação). Assim, a análise por Western blot foi realizada para determinar as ligações entre proteínas anti-apoptóticas e pro-apoptóticas Bax e Bak proteínas (Western blots representativos de 3 expericias independentes).

a. Bax, Bak e Bim são seqüestrados por Bcl-2, Bcl-xL e Mcl-1 na membrana mitocondrial externa. B. Em resposta a ABT-737, proteínas Bax, Bak e Bim são libertados a partir de Bcl-2 e Bcl-xL, mas não a partir de Mcl-1L. Assim Bim pode melhorar diretamente Bax e Bak oligomerização provocando a formação de MOMP (C) e liberação de proteínas pró-apoptóticos tais como citocromo c no citosol.

Discussão

Neste estudo, usamos alta qualidade mitocôndrias isoladas controladas para comparar os efeitos de inibidores putativos de Bcl-2 e tenta explorar o mecanismo de acção de ABT-737. Utilizou-se cinco parâmetros diferentes para avaliar a sua integridade e Funcionalidades de: acessibilidade c citocromo oxidase de citocromo exógeno C (não mostrado), os valores de controlo respiratório, de capacidade de inchamento da matriz, os valores de potencial de membrana e libertação de factores apoptogénicas tais como citocromo C (OMP) (Fig . 1). Comparação de compostos efeito sobre cada tipo mitocondrial exige igualmente elevados níveis de pureza e intactness de preparações mitocondriais independentemente das respectivas fontes (células cultivadas ou tecido saudável). Isto foi resolvido por culturas de células em larga escala e purificação de mitocôndrias por centrifugações diferenciais além de gradiente de densidade de Percoll. Usando este método, ambas isoladas de fígado de rato e de células de cancro mitocôndrias presente qualidade e de resposta ao cálcio semelhante (Fig. 1).

Surpreendentemente a maioria dos compostos identificados como inibidores da proteína Bcl-2 foi encontrado para agir em mitocôndrias saudável, pelo menos em um parâmetro de integridade. Por exemplo, observamos que HA-14,1, queleritrina, Gossypol e EM20-25 induzida MMP em mitocôndrias de fígado de rato, enquanto que outros inibidores da família Bcl-2 foram encontrados para ser inativo (YC-137 e TW-37). Appart de t-Bid, Bak BH3, Bim BH3 que são de origens protéicos, apenas a ABT-737 demonstrou tumor seletivo mitochondrio-segmentação indicada por OMP e liberação de fatores pró-apoptóticos (Fig. 2). Observações anteriores têm demonstrado que ABT-737 pode induzir OMP ou quando as mitocôndrias são originários a partir de células “activadas” por sinais de morte (por exemplo, linfócitos de IL-3-carenciadas [28], ou em células HeLa pulsadas-TNF [35]), ou quando mitocôndrias isoladas são co-tratados com o péptido de BH3 (por exemplo, com Noxas BH3 em mitocôndrias MEF [13]). Pela primeira vez, foi demonstrado que ABT-737 em si pode induzir OMP em mitocôndrias isoladas de linhas de células tumorais não imunizadas. No que diz respeito t-Bid, o nosso isolado fígado e HME-1 mitocôndrias saudáveis ​​não foram sensíveis à proteína recombinante t-Bid. Esta ausência de efeito sobre mitocôndrias do fígado poderia ser explicado pelo elevado grau de pureza e a estabilidade da nossa preparação mitocondrial. proteínas Bcl-2 Family detectado em ambos os normais e células cancerosas mitocôndrias (Fig. 6) lembrar presente após lavagens alcalinas (não mostrado), indicando que elas não estão associadas por interacção electrostática com as membranas mitocondriais e não são provenientes de citosol residual ou retículo endoplasmático .

a proteína t-Bid recombinante, Bak BH3, Bim BH3 e ABT-737 provocou uma liberação de proteínas apoptogénicas de PC-3 e Jurkat mitocôndrias pela formação de canais de grandes o suficiente para liberar proteínas, como Omi /HtrA2 (37 kDa) (Fig. 3). OMP parece independente na PTP, uma vez que não é inibida por inibidores de PTP conhecidas como ADP, a ciclosporina A e ácido bongkrékico (não mostrado). A ausência de alterações da membrana mitocondrial (sem inchaço e perda de ΔΨm) (Fig. 2A) e a libertação dos menores factores apoptóticos em tratamento (Fig. 3) sugeriu que ABT-737 induziu a formação de um canal específico e não uma membrana mitocondrial ruptura, de forma semelhante ao Bax [53-86] peptídeo BH3 em Polster

et al.

[36]. Por conseguinte, a libertação de factores discriminativo apoptogénicas já foi demonstrado em mitocôndrias isoladas HeLa tratadas com t-Bid [37]. Este achado é compatível com a descrição anterior de um ciclo dependente de apoptossomo onde caspases a jusante devem ser activados para desencadear a liberação mitocondrial de FIA ​​e EndoG, secundária à libertação de citocromo c, Omi /HtrA2 e Smac /DIABLO [37]. No modelo celular, perda ΔΨm e a libertação de citocromo c foram detectados simultaneamente em resposta a ABT-737 [38], [39] ao contrário do que foi observado com as nossas condições no sistema isento de células. O nosso método de rastreio parece ser um processo em tempo real que permite a detecção de efeitos directos e início dos compostos na mitocôndria, sem interferências induzidas por compartimento citosólico.

Mostrámos também que (1) HCT-116 Bak- /-, mas não Bax – /-, as mitocôndrias são sensíveis a ABT-737, (2) a libertação do citocromo c induzida por ABT-737 em PC-3 mitocôndrias são controlados por um excesso de Bcl-xL (Fig (Fig. 4A). 4C) e (3) inibição da Bax e Bak oligomerização pelo BCB é suficiente para bloquear a libertação do citocromo c (Fig. 5A e B). Estes resultados indicam que o equilíbrio entre membros pró-apoptóticos e anti-apoptóticos da família Bcl-2 desempenha um papel essencial no mecanismo de ABT-737 de acção.

Temos assim demonstrado que a oligomerização de Bax e Bak no PC-3 de membrana mitocondrial é induzida por péptidos de Bak e Bim BH3, t-Bid ou ABT-737 tratamentos (Fig. 5A), Bax e Bak, sendo ambos inseridos como uma forma monomérica em normal não tratada (HME-1) e tumoral (PC -3) mitocôndrias da célula. No entanto, numerosos estudos foram realizados mostrando oligomerização Bax e inserção na membrana posterior utilizando mitocôndrias ou lipossomas recombinantes Bax e isolados [40] – [42]. Estes estudos levaram a conclusões opostas sobre a cinética da activação do Bax poros. No entanto, mais recentemente, tem sido mostrado que a oligomerização de Bax ocorre ao nível mitocondrial em vez de no citosol [43] – [45]. Assim, utilizando células nulas c-myc, Annis e colaboradores mostraram que o Bax induzida mitocondriais resultados permeabilização de oligomerização de monómeros transmembranares em vez de inserção pré-formados como oligómeros [43].

Algumas proteínas Bcl-2 family, tais como o activador de BH3 única Bim ou as proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e de Mcl-1D são especialmente presentes em mitocôndrias de células de cancro. Em contraste com as observações anteriores [28], [29], [46], expressão Mcl-1L na mitocôndria não foi suficiente em nossas mãos para evitar a formação de MOMP em resposta a ABT-737. Por exemplo, PC-3 e Jurkat mitocôndrias são sensíveis a baixas concentrações de ABT-737, apesar de um elevado teor de Mcl-1 L (Figuras 2 e 6), enquanto HT-29 mitocôndrias com baixo nível de Mcl-1L são relativamente resistentes à ABT- 737. Mostramos aqui que, ao nível molecular, ABT-737 permite que as proteínas pró-apoptóticos Bcl-2 e Bcl-xL, mas nem Mcl-1L nem Bcl-w para libertar a Bax, Bak e Bim (Figuras 7 e 8).