Abstract

O câncer colorretal (CCR) é a segunda causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer no mundo ocidental e as interacções entre factores genéticos e ambientais, incluindo a dieta, são sugeridos para desempenhar um papel crítico na sua etiologia. Foi realizada uma experiência de alimentação de longo prazo no ratinho para dirigir expressão do gene de metilação e alterações resultantes na mucosa de cólon histologicamente normal, predispondo-cancerosas eventos putativos disponíveis para a detecção precoce. A expressão de 94 genes crescimento-regulação anteriormente ligado a CRC humano foi estudada em dois momentos (5 semanas e 12 meses de idade) no heterozigoto

MLH1

+/-

ratos, um modelo animal para a síndrome de Lynch humana (LS), e do tipo selvagem

MLH1

+ /+

ninhada, alimentadas por qualquer estilo ocidental (WD) ou AIN-93G dieta controle. Nos ratos alimentados com WD, proximal mucosa do cólon, o local predominante de formação de câncer em LS, exibiu uma diminuição significativa expressão em genes supressores de tumor,

DKK1, Hoxd1

,

Slc5a8

, e

SOCS1

, os dois últimos apenas nos

MLH1

+/-

ratos. a expressão de ARNm reduzida foi acompanhada por um aumento da metilação do promotor dos genes respectivos. A diminuição mais forte expressão (7,3 vezes) em conjunto com um aumento significativo na sua metilação do promotor foi visto em

DKK1

, um antagonista da via de sinalização Wnt canónica. Além disso, a inativação de

DKK1

parece predispor a neoplasias no cólon proximal. Isso eo fato de que

MLH1

que mostrou apenas metilação modesta ainda foi expressa tanto em

MLH1

+/-

e

MLH1

+ /+

ratos indicam que a expressão diminui ea inactivação de

DKK1

em particular, é um marcador precoce de destaque para oncogênese cólon

Citation:. Pussila M, Sarantaus G, Dermadi Bebek D, Valo S, Reyhani N, Ollila S, et al. (2013) Alterações Gene Expression-Prevendo câncer no cólon Mucosa of Western Diet Fed

MLH1

+/- Mice. PLoS ONE 8 (10): e76865. doi: 10.1371 /journal.pone.0076865

editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 22 de maio de 2013; Aceito: 28 de agosto de 2013; Publicação: 08 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Pussila et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado financeiramente pelas bolsas do Conselho Europeu de Investigação (2008-AdG-232635), a Fundação Sigrid Juselius (https://www.sigridjuselius.fi/foundation), Câncer Organizações finlandesa (https://www.cancer.fi/pt /), a Academia da Finlândia (https://www.aka.fi/eng) e Biocentrum Helsínquia (https://www.helsinki.fi/biocentrum/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer colorretal (CRC) evolui como um processo de várias etapas, o que exige uma série de alterações genéticas e epigenéticas. O processo é acelerado em indivíduos com predisposição ao câncer herdada, e as interações entre fatores genéticos e ambientais, incluindo a dieta, parecem estar em posição-chave na sua etiologia [1,2]. A importância de alterações epigenéticas, tais como mudanças de metilação do DNA no início do CRC é hoje reconhecida [3,4], contudo, os primeiros eventos na mucosa do cólon normal, disponíveis para a detecção precoce e prevenção do câncer desenvolvimento continuam a ser elucidado.

Embora as mutações hereditárias no gene supressor de tumor (TSG) APC (adenomatous polyposis coli), um importante componente da via de sinalização /β-catenina Wnt, e a reparação de emparelhamentos incorrectos (MMR) genes (por exemplo,

MLH1

, mutL homolog 1), que controlam a taxa de mutação em uma célula [2] podem conferir um elevado risco de vida de cancro com um início precoce, cancro colo-rectal é uma doença dos claramente o aumento da idade [3,4]. Consequentemente, as mudanças de metilação de um pequeno subconjunto de ETG foram detectados no envelhecimento da mucosa do cólon de indivíduos saudáveis ​​normais, e isto envolve a metilação de genes que muitas vezes tornam-se mais substancialmente metilado em células neoplásicas [5-7], sugerindo o seu papel na iniciação e cancro progressão. Junto com o envelhecimento alguns compostos exógenos de fontes alimentares são modificadores importantes de padrões de metilação no cólon [8], provavelmente explicar porque populações ocidentais que consomem quantidades consideráveis ​​de carne vermelha, gordura saturada e açúcar, e apenas quantidades moderadas de fibras alimentares, vitaminas e minerais (por exemplo, cálcio, folato e vitamina D), bem como derivados de plantas nutrientes mostram as maiores incidências de CRC no mundo [1] (World Cancer Research Fund, www.dietandcancerreport.org). As mudanças epigenéticas, assim, proporcionar uma ligação potencial entre nutrição e câncer [9] e enfatizar a necessidade de esclarecer os efeitos da dieta sobre regulação gênica em mucosa intestinal.

Os modelos animais, especialmente roedores, fornecer um recurso valioso na área de meio ambiente epigenética incluindo estudos sobre alterações mediadas através de dieta [10]. Se os resultados sugerirem que a dieta de estilo ocidental (WD) induz tumores gastrointestinais em modelos de ratos para o câncer intestinal familiar e até mesmo no tipo selvagem (WT) ratos sem qualquer tratamento cancerígeno [11-14] nos levou a estudar os efeitos de exposições WD no gene regulação e metilação em mucosa de cólon normal com e sem herdou suscetibilidade ao câncer de cólon. Foram selecionados 94 genes crescimento-regulação anteriormente ligados ao CRC humana e estudou sua expressão no heterozigoto

MLH1

+/-

ratos análoga à síndrome de Lynch humana (LS), e WT

MLH1

+ /+

ninhada. Durante um experimento de alimentação de longo prazo que usamos nossa própria modificação de estilo ocidental de dieta (WD *), que muito se assemelha a nova dieta ocidental (NWD) mostraram induzir tumores benignos e malignos no cólon de /6 ratos normais C57Bl depois de um 18 experimento mês de alimentação [12]. A principal diferença entre NWD e WD * é a fonte de gorduras que no WD * foi alterado em grande parte a partir de óleo de origem animal (leite) de gordura e, assim, assemelha-se mais a gordura consumida por populações ocidentais. Aqui, cólon proximal, o local predominante de formação de câncer em LS [15], revelaram várias alterações significativas relacionadas à idade na expressão dos genes. Algumas mudanças foram potenciados pela WD * e alguns foram encontrados apenas em camundongos com predisposição ao câncer genética. Demonstramos ainda que as mudanças de expressão detectados a partir da mucosa normal histologicamente foram notavelmente ocorrendo de forma precoce antes da

APC

inactivação e o segundo hit no

MLH1

.

Métodos

ratos

Heterozigoto B6.129-

MLH1

tm1Rak

ratos (MLH1

+/-) (01XA2 estirpe) foram obtidos a partir de NCI -MMHCC; National Institutes of Health, Rato Repository, NCI-Frederick, MD. Em B6.129-

MLH1

tm1Rak

ratos, exão 2 está faltando em uma das duas

MLH1

alelos que levam a proteína MLH1 não funcional [16 ]. MLH1

+/- ratinhos apresentam um aumento da morbidade em comparação com os seus companheiros de ninhada WT e cerca de um terço desenvolver tumores tais como linfomas, bem como tumores do intestino delgado e grosso e um número de outros órgãos durante a sua vida útil [17]. O MLH1

+/- e MLH1

+ /+ camundongos foram genotipados usando DNA genômico extraído de earmarks de acordo com o protocolo publicado no site do mouse Repository (https://mouse.ncifcrf.gov/protocols.asp? ID = 01XA2 p_allele = MLH1% 3Ctm1Rak% 3E prot_no = 1) (ver Materiais e Métodos S1)

declaração Ética

os ratos foram criados e tratados de acordo com o protocolo de estudo aprovado pelo. Experimento animal Board nacional na Finlândia (ESLH-2008-06502 /YM-23). Os ratos foram humanamente eutanasiados com inalação de CO2.

Dietas

Na idade de 5 semanas (ponto de tempo 0, TP0),

MLH1

+ /- Comprar e

MLH1

+ /+

ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos alimentares (n = 8 /grupo, incluindo ambos os sexos) alimentados com AIN-93G ( AIN) dieta controle [18] ou de estilo ocidental (WD *) dieta (Harlan Teklad, Madison, WI) (Tabela 1, descrição detalhada das dietas e suas composições nutricionais estão na Tabela S1).

AIN93- g

WD *

fontes de gordura (g /kg)

a (g /kg)

bSoybean Oil70-anidro a matéria gorda láctea-133Canola Oil-55Sunflower Oil-12Carbohydrate SourcesStarch397306Maltodextrin13295Sucrose100116Protein Source200 ( caseína) 232 (caseína, a vitamina livre) o conteúdo total de energia (kcal /g) 3.84.6Kcal a partir de gordura (%) 17.239.2Kcal dos hidratos de carbono (%) 63.942.3Kcal de proteína (%) 18.818.5Vitamin D (UI /kg) ácido 1000100Folic (mg /kg) 20.2Calcium50.5Table 1. Dieta informação nutricional. Compra de composição detalhada das dietas experimentais ver Tabela S1.

a Se não for indicado de forma diferente

b Se não for indicado de forma diferente CSV Baixar CSV

a preparação da amostra

Oito ratos por cada grupo em TP0 (MLH1

+/-, MLH1

+ /+) e tp1 (12 meses de idade) (MLH1

+ /+ AIN, MLH1

+/- AIN, MLH1

+ /+ WD *, MLH1

+/- WD *) 48 ratos no total foram sacrificados e amostradas. Os estudos histológicos foram realizados no Centro Finlandês para Laboratório Patologia Animal (FCLAP), Universidade de Helsinki, na Finlândia.

Para DNA genômico e extrações de RNA total, a mucosa (6 x 4 mm) foi separado do subjacente submucosa e musculatura sob um microscópio de dissecação. As amostras para a extracção de ARN foram armazenadas em RNAlater (Qiagen, Valencia, CA) à temperatura de -80 ° C.

extracção de ARN e a transcrição reversa

As amostras de ARN total foram preparados utilizando o Kit RNeasy Plus ( Qiagen, Valencia, CA) com um tratamento adicional Dnase (Qiagen, Valencia, CA). A integridade do RNA foi analisado com o Agilent 2100 (tecnologias de Agilent, Santa Clara, CA) Bioanalyzer e apenas RNA de alta qualidade (número de integridade do RNA RIN 8) foi usado para reações de síntese de cDNA, que foram funcionaram como duplicatas e agregados para a RT -qPCR reações. A transcrição reversa a partir de qualquer 200 ng (amostras individuais para StellARray) ou 1600 ng (piscinas de oito amostras, 200 ng de cada um, a partir de oito ratinhos diferentes pertencentes a cada grupo TP1 para TaqMan RT-qPCR) de ARN total foi alcançada com o M-MuLV RNase H

+ (Thermo Scientific, Finlândia) ou Superscript III (Life Technologies, Carlsbad, CA), respectivamente, utilizando iniciadores aleatórios de acordo com as instruções dos fabricantes.

estudos de expressão RNA

as expressões de RNA de amostras de tecido histologicamente normais de mucosa do cólon proximal foram analisados ​​usando um costume quantitativa feita StellARray

plataforma de TM (Lonza Group Ltd, Bar Harbor biotecnologia). O StellARray incluiu 94 genes (73 ETG) previamente associados com o desenvolvimento de câncer colorretal e /ou documentada para expor CpG ilha (CGI) hipermetilação no CRC e outros cânceres humanos (Tabela S2).

APC

foi incluído na matriz como um indicador de carcinogênese em curso. Oito ratinhos de cada grupo de estudo foram analisados ​​separadamente para a expressão dos 94 genes de interesse (48 matrizes de RT-qPCR no total).

Cada poço da placa StellARray foi carregado com 20 ul de SYBR Green mistura principal contendo 8μl da amostra de cDNA específico e modificado

brockianus Thermus

DNA polimerase (Thermo Scientific, Finlândia). As matrizes de RT-qPCR foram corridos num ciclizador Mx3000P (tecnologias de Agilent, Santa Clara, CA) utilizando os seguintes parâmetros de ciclagem: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 7 min, 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, e 60 ° C durante 1 min. Os dados de fluorescência foi adquirida durante o passo C de hibridação /extensão de 60 °. A especificidade de primer foi monitorada através de uma análise da curva de fusão. As diferenças de expressão entre os diferentes grupos de rato foram analisados ​​utilizando o padrão global Recognition ™ (GPR) software (Bar Harbor Biotecnologia, Trenton, ME)

Os resultados de mudanças de expressão estatisticamente significativas em relação à WD * e /ou herdado predisposição ao câncer foram validados pelo tp1 usando ensaios TaqMan (Tabela S3). Em contraste com a RT-qPCR StellARray, a análise de RT-qPCR TaqMan foi feito a partir de amostras reunidas. Cada amostra reunida foi ensaiada em triplicado para os genes alvo, assim como os genes de referência endógenas utilizando os seguintes parâmetros de ciclagem: 1 ciclo de 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, e 60 ° C durante 1 minuto. ciclos térmicos e aquisição de dados de fluorescência foram realizadas com um termociclador StepOnePlus (Life Technologies, Carlsbad, CA) e os valores do QC foram chamados usando o auxiliar de dados software v2.0 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Os genes de referência uniformemente expressas (

HDAC1

e

Stk4

) foram selecionados usando o algoritmo GeNorm [19], de entre os 94 genes incluídos no StellARray.

MLH1

níveis de expressão em TP0 foram também quantificados usando ensaio TaqMan.

Se a quantidade de template foi demasiado baixo para se obter resultados fiáveis, a validação de RT-qPCR foi realizado utilizando ADNc pré-amplificado. Para cada grupo de TP1, amostras reunidas foram multiplex pré-amplificada utilizando 16 ng de ADNc com o kit TaqMan Master Mix PreAmp (Life Technologies, Carlsbad, CA) seguindo as instruções do fabricante. Os parâmetros dos ciclos foram como se segue:. Um ciclo de 95 ° C durante 10 min e 10 ciclos de pré-amplificação de 95 ° C durante 15 s, e 60 ° C durante 4 min

metilação do DNA análise

Para a análise de metilação do DNA, apenas os genes que tinham mostrado uma diminuição expressão de mRNA significativa (isto é candidato hipermetilado ETG), em associação com predisposição hereditária e /ou WD * foram selecionados, e os níveis de metilação de suas ilhas CpG (CGIs) foram avaliados individualmente para cada rato TP0 e tp1. O ADN genómico para a análise de metilação foi extraído utilizando DNeasy Blood Kit de tecido (Qiagen, Valencia, CA) a partir de amostras de tecido da vizinhança imediata das utilizadas para estudos de expressão RNA.

A análise de metilação quantitativa foi realizada com MassARRAY EPITYPER

TM sistema de Sequenom (Sequenom GmbH, Hamburgo , Alemanha), que é uma tecnologia baseada em bissulfato confiando na clivagem específica de bases de RNA e dessorção de ionização espectrometria de laser assistida por matriz de tempo-de-voo de massa (MALDI-TOF-MS) para determinar a extensão relativa de metilação em fragmentos de ADN contendo quer um ou vários locais CpG subsequentes, que são referidos como unidades CpG [20]. No espectro de massa, um padrão de sinal distinta resulta a partir da sequência alvo metilado e não metilado, e o software EPITYPER determina as proporções de metilação individuais (isto é, rácio de intensidade de sinal, como percentagem de metilado para sinais não metilados) com os de CpG sítios /unidade dentro uma sequência alvo. O sistema é capaz de detectar níveis de metilação tão baixas como 5%.

Os produtos de amplificação foram seleccionados em primeiro lugar para cobrir CGI anotado pelo navegador genoma UCSC e para ser sobrepostas com o local de início da transcrição e UTR 5 ‘ou seja na sua proximidade. Ao todo, doze amplicons diferentes foram analisados ​​(comprimentos entre 174 e 499 pb) dos quais oito pertenciam ao pré-validado mouse padrão EpiPanel e quatro eram ensaios de metilação do DNA de design personalizado usando software EpiDESIGNER da Sequenom (Sequenom GmbH, www.epidesigner.com), para os quais as sequências de iniciadores e locais alvo são fornecidos na Tabela S4. A fim de reduzir a variabilidade introduzida durante a metilação de PCR [21], três amplificações foram realizadas em duplicado e reunidos para análise de massa. Os dados de metilação inicial foi filtrada por Sequenom para excluir as medições de má qualidade. unidades CpG que produziram dados com mais de 75% das amostras passaram o controlo de qualidade inicial. A partir destes, as amostras que produziram dados com mais do que 80% para todas as unidades CpG dentro de um amplicão foram seleccionados para esse par amostra /fragmento amplificado. Para análise adicional, as unidades CpG que havia dados disponíveis para menos do que 50% de todas as amostras e as amostras que tinham dados disponíveis para menos do que 50% de todas as unidades CpG foram excluídos. Depois de controle de qualidade de 78% das unidades CpG analisados ​​(152 de 196) e todas as 48 amostras foram incluídas em futuras etapas de análise.

Análise estatística

Em StellARray RT-qPCR, uma comum limiar foi estabelecido em todas as placas de 48 dentro da experiência. As diferenças de expressão entre os diferentes grupos foram analisados ​​utilizando o software padrão global Recognition ™ (GPR), que executa correção de eficiência e normalizações gene de referência e grupo controle (www.bhbio.com/BHB/dw/products.gpr.html~~number=plural). GPR também tira vantagem das réplicas biológicas para extrair alterações significativas na expressão de genes. O sistema StellARray não funciona com genes de referência definidos pelo usuário. Em vez disso, o algoritmo de software GPR determina o melhor conjunto de genes de referência dentro da experiência comparando a expressão de todos os genes incluídos no ensaio de entre as amostras de teste e de controlo, gera um padrão global de mudanças de expressão, e cria uma lista ordenada das significativa alterações [22]. Deste modo, a selecção de genes de referência é imparcial, uma vez que permite que os dados experimentais para definir os genes de referência expressos de forma estável.

Em ensaios TaqMan, as alterações de expressão de ARNm relativos foram analisados ​​utilizando o comparativo C

t (ΔΔC

T), o qual apresenta os dados como mudanças vezes na expressão de genes normalizados para os genes endógenos de referência e em relação ao grupo de controlo [23]. software v2.0 dados auxiliar (Life Technologies, Carlsbad, CA) foi usado para dados (CQ), e um método de permutação mediana [24] foi usado para determinar o significado da expressão dobrar mudanças de controlo de qualidade e normalização do ciclo quantificação em comparação com o grupo controle com nível de significância de

P Art 0,05.

A correlação entre os padrões de expressão StellARray de 5 semanas de idade

MLH1

+ /+ Comprar e

MLH1

+/-

camundongos foram estudados por meio de análise de correlação de Pearson (

R

valor) do sistema PASW Statistics 18.

software Chipster [25] foi usado para visualizar e analisar o dados de metilação. A ferramenta não-métrica Escala Multi-Dimensional (NMDS) foi usado para produzir mapas bidimensionais baseado em dissimilaridade amostra calculado utilizando distância euclidiana, ea ferramenta Dendrograma foi usada para criar dendrogramas de amostras utilizando dados normalizados com correlação de Pearson e método average linkage . Para Chipster análises, faltam valores de metilação de unidades CpG individuais foram definidos como o valor médio da unidade de CpG dentro do grupo especial mouse.

A comparação dos níveis médios de metilação entre os diferentes grupos de rato foi utilizado o teste de Mann-Whitney do sistema PASW Statistics 18.

Resultados

neoplasias do cólon desenvolvem predominantemente no WD * camundongos

no geral, um adenocarcinoma proximal e cinco adenomas /pólipos hiperplásicos foram observadas no 32 ratinhos em TP1. A importância da WD * sobre o risco de CRC em nossa série do rato é realçado pelo fato de que 5 de 6 ratos com neoplasias foram alimentadas com WD * e que WD * causado o desenvolvimento do tumor também em camundongos selvagens sem predisposição hereditária, ou seja, a única carcinoma e um adenoma foram encontrados no

MLH1

+ /+

WD * ratos (Tabela 2, Figura S1). A única AIN rato alimentado desenvolver neoplasia (pólipo hiperplásico) era portadora de mutação.

Tapete Grupo

DKK1

expressa (n = 16)

DKK1 não

expressa ( n = 16)

MLH1

+ /+

AIN62

MLH1

+/-

AIN3

a5

MLH1

+ /+

WD * 4

B4

c

MLH1

+/-

WD * 35

a, b, bdTable 2.

DKK1

inactivação e cólon neoplasias em diferentes grupos rato

um pólipo hiperplásico.;

b adenoma;

c adenocarcinoma;

D não confirmado histologicamente CSV Baixar CSV

MLH1

+/- e MLH1

camundongos + /+ mostram padrões de expressão de mRNA semelhantes desde o início

No início da alimentação experimental período (TP0), o MLH1

+/- e MLH1

camundongos + /+ mostrou uma notável boa correlação (Pearson

R

= 0,989,

P Art 0,01) entre os padrões dos 94 genes incluídos no costume StellARray RT-qPCR array (Figura S2A) expressão de mRNA. No entanto, diferente dos outros genes, mas de acordo com os diferentes genótipos, a expressão de

MLH1

foi aproximadamente 50% inferior nos murganhos heterozigóticos do que nos ratinhos WT (Figura S2B). No geral, um fundo isogênico no início fez justifica a razão que as diferenças de expressão que aparecem entre os diferentes grupos de ratos mais tarde foram adquiridos e não o resultado da constituição genética hereditária.

WD * e /ou predisposição hereditária estão associados com a expressão diferencial de genes em vários TP1

na idade de 12 meses (TP1), foi encontrada a expressão de vários genes de ser aumentada ou diminuída, em comparação com TP0 (Tabelas 3 e 4). Todos os resultados de GPR (

P

-Valores e dobre alterações) de diferenças de expressão entre os diferentes grupos ratos para todos os 94 genes estão na Tabela S5. Nove dos 94 genes mostrou estatisticamente significativa (

P Art 0,05) mudanças de expressão entre TP0 e tp1 em todos os grupos de ratos (MLH1

+ /+ AIN, MLH1

+/- AIN, MLH1

+ /+ WD *, MLH1

+/- WD *) (Tabela 3). A redução dos níveis de mRNA foram observados em

CCND1

(ciclina D1),

CDH1

(Caderina 1), e

Mal

(mielina e proteína de linfócitos, proteína diferenciação de células T), enquanto que o aumento da expressão foi visto em

Axin2

,

Cdx1

(caudal tipo homeobox 1),

Fzd10

[homólogo Frizzled 10 (

Drosophila

)],

Mbd2

(metil-CpG ligação às proteínas de domínio 2),

Mbd4

(ligação metil-CpG proteína do domínio 4), e de nucleotídeos guanina

Rasgrf2

(específico da proteína Ras liberando fator 2). Uma vez que estas mudanças não dependem de predisposição ou WD herdada * que pode ser atribuível ao envelhecimento.

MLH1

+ /+

AIN

MLH1

+/-

AIN

MLH1

+ /+

WD

MLH1

+/-

WD

subregulado GenesFold Change (

P

) Dobre Change (

P

) Dobre Change (

P

) Dobre Alterar (

P

)

CCND1

3,3 (0,003) 3,8 (0,000) 4,3 (0,001) 3,6 (0,000)

CDH1

5,4 (0,002) 4,9 (0,000) 5,9 (0,002 ) 8,4 (0.000)

Mal

3,4 (0,025) 3,4 (0,014) 3,2 (0,034) 2,7 (0,028) regulada GenesFold Change (

P

) Dobre Change (

P

) Dobre Change (

P

) Dobre Change (

P

)

Axin2

2,6 (0,005) 3,0 (0,002) 1,8 (0,039) 1,6 (0,028)

Cdx1

4,1 (0,002) 5,6 (0,000) 3,4 (0,002) 5,4 (0,000)

Fzd10

4,8 (0,002) 7,6 (0,000) 3,4 (0,021) 5,0 (0,000)

Mbd2

3.3 (0,004) 4,7 (0,000) 3,2 (0,003) 5,7 (0,000)

Mbd4

3,0 (0,005) 6,0 (0,000) 3,0 (0,004) 3,3 (0,000)

Rasgrf2

2,3 (0.002) 1,8 (0,006) 2,3 (0,001) 1,5 (0,040) Tabela 3. Genes que mostram estatisticamente significativo (

P

0,05) diferenças de expressão de mRNA entre TP0 e tp1 em todos os quatro grupos de ratos; no grupo controle (MLH1

+ /+ AIN) e os três grupos de estudo (MLH1

+/- AIN, MLH1

+ /+ WD, MLH1

+/- WD).

CSV Baixar CSV

MLH1

+ /+

AIN

MLH1

+/-

AIN

MLH1

+ /+

WD

MLH1

+/-

WD

regular negativamente GenesFold Change (

P

) Dobre Change (

P

) Dobre Change (

P

) Dobre Change (

P

)

DKK1

2,0 (0,110) 5,1 (0,012) 6,2 (0,003) 7,3 (0,003)

Slc5a8

1,3 (0,078) 1,7 (0,041) 1,3 (0,224) 1,5 (0,032)

Hoxd1

1.1 (0,348 ) 2,0 (0,075) 2,1 (0,019) 1,5 (0,191)

SOCS1

1,6 (0,460) 2,7 (0,067) 1,0 (0,485) 3,1 (0,026) regulada GenesFold Change (

P

) Dobre Alterar (

P

) Dobre Change (

P

) Dobre Change (

P

)

Dkk2

2,2 (0,108) 2,2 (0,037) 1,7 (0,329) 1,0 (0,637)

RPRM

1,4 (0,442) 2,0 (0,017) 1,1 (0,725) 3,3 (0,019)

Acaa1b

2,4 (0,120) 1,8 (0,140) 3,5 (0,124) 9,4 (0,000) tabela 4. Os genes que mostram estatisticamente significativa (

P Art 0,05) diferenças de expressão de mRNA entre TP0 e tp1 em pelo menos um dos grupos de estudo, mas não no grupo de controle (MLH1

+ /+ AIN).

CSV Baixar CSV

mudanças de expressão estatisticamente significativas entre TP0 e tp1 associada a predisposição ao câncer herdado (MLH1

+/-) e /ou WD * foram observados em sete genes (Tabela 4, Tabela S5); diminuição da expressão no

DKK1

[Dickkopf homólogo 1 (

Xenopus laevis

)]

, Slc5a8

[(soluto família portadora 5 (transportador iodeto), membro 8]

, Hoxd1

(homeobox D1), e

SOCS1

(supressor de citocina sinalização 1), e aumento da expressão em

Dkk2

[Dickkopf homólogo 2 (

Xenopus laevis

)],

RPRM

(Reprimo, TP53 dependente prisão G2 mediador candidato), e

Acaa1b

(acetil-coenzima A aciltransferase 1B).

A diminuição mais forte expressão (7.3 vezes) foi observado no gene supressor de sinalização Wnt

DKK1

entre o MLH1

+/- ratinhos alimentados com WD *. em ratos alimentados com heterozigotos AIN e em ratinhos WT alimentados com WD *, o decréscimo foi 5,1 e 6,2 vezes, respectivamente. Curiosamente, o gene homeobox

Hoxd1

mostrou uma diminuição de expressão relacionada com a idade (2,1 vezes) apenas no MLH1

+ /+ WD * grupo, ea diminuição estatisticamente significativa relacionada a WD * foi ainda observada quando esse grupo foi comparado com o grupo controle (

MLH1

+ /+

AIN) a tp1 (1,9 vezes) (Tabela S5). A diminuição do transportador de butirato de expressão

Slc5a8

associado apenas com o

MLH1

heterozigosidade (1,5 e 1,7 vezes nos grupos WD * e AIN, respectivamente), enquanto que

SOCS1

, uma citocina regulador de sinalização, foi significativamente baixo regulada (3,1 vezes) somente se ambos os fatores de risco estavam presentes, ou seja, no

MLH1

+/-

WD * grupo.

a expressão de

Dkk2

, outro modulador de sinalização Wnt, foi aumentado significativamente no MLH1

+/- grupo AIN (Tabela 4), de modo que pelo tp1,

Dkk2

expressão entre MLH1

+/- murganhos foi significativamente mais baixa (2,2 vezes) no grupo WD * em comparação com o grupo de AIN (Tabela S5).

RPRM

mostrou um aumento de expressão relacionada com a idade estatisticamente significativa em associação com

MLH1

heterozigosidade (3.3 e 2.0. Vezes em WD * e AIN, respectivamente).

Acaa1b

mostrou um aumento de expressão significativa no MLH1

+/- WD * camundongos (9,4 vezes) e os níveis de expressão revelou uma diferença significativa (5,0 vezes) quando o

MLH1

+/-

ratos WD * foram comparados com o

MLH1

+/-

AIN grupo no tp1 (Tabela S5).

Não houve amostras de tecido disponíveis /extrai para validar os resultados ao nível da proteína. Portanto, TaqMan RT-qPCR foi utilizado para validar as mudanças de expressão associadas com o MLH1

mutação

predispondo-o cancro e /ou * WD. O fundo isogênico e nossos próprios resultados que os ratos apresentaram padrões de expressão de mRNA semelhantes no início (Figura S2A, S2B) fez que se justifica para combinar as amostras individuais (n = 8) de cada grupo em piscinas para uma posterior utilização nos experimentos de validação. A figura 1 ilustra as diferenças observadas entre os grupos de estudo e o grupo controle no tp1.

A expressão relativa em diferentes grupos de estudo (MLH1

+/- AIN, MLH1

+ /+ WD * e MLH1

+/- WD *) é comparado com o grupo controle (MLH1

+ /+ AIN). Cada amostra é uma mistura de oito amostras de ARN a partir de oito ratinhos TP1 diferentes pertencentes a cada grupo de rato. Os dados são apresentados como média ± EPM (erro padrão da média) (n = 3), * Diferença significativa em comparação com o grupo de controlo. método de permutação mediana,

P Art 0,05. (A)

MLH1

mostra a mesma diferença de expressão de 50% entre os genótipos quanto no ponto de partida o estudo. (B)

DKK1

é significativamente baixo regulada nos grupos de estudo com WD * e /ou

MLH1

heterozigosidade. (C)

Slc5a8

não apresenta diferenças significativas de expressão em tp1. (D)

Hoxd1

é regulada negativamente em associação com WD * em ambos os genótipos; a regulação para baixo sendo especialmente forte no

grupo + /+ WD MLH1. (E)

SOCS1

não apresenta diferenças significativas de expressão em tp1. (F)

Dkk2

é regulada negativamente em associação com WD * em ambos os genótipos.

Os ensaios TaqMan confirmou a observação de que

DKK1

é um dos mais candidatos proeminentes com expressão na mucosa do cólon alterado em associação com a predisposição ao câncer herdado e WD *. Devido aos baixos níveis de

DKK1 mRNA, RT-qPCR foi realizada em ADNc pré-amplificado (valor uniformidade amplificação de -0,76).

níveis DKK1

mRNA foram significativamente menores em comparação com o grupo controle (

MLH1

+ /+

AIN) em todos os grupos de estudo [MLH1

+ /+ WD *, 1,5 vezes (intervalo de 1,4-1,7); MLH1

+/- AIN, 1,4 (1,3-1,5); MLH1

+/- WD *, 1,2 (1,1-1,2)] (Figura 1B). A expressão de

Hoxd1

foi significativamente não diminuiu apenas em MLH1

+ /+ WD * camundongos [1,9 (1,7-2,2)], um achado já observada em StellARray, mas também no MLH1

+/- WD * grupo [1,3 (1,2-1,3)] (Figura 1D), destacando-se o efeito da WD * na expressão

Hoxd1

. O TaqMan RT-qPCR também confirmou a importância da WD * na expressão de

Dkk2

, onde em StellARray uma diminuição estatisticamente significativa foi observada em MLH1

+/- WD * camundongos [1.2, (1.2- 1.3)], mas agora também em ratinhos WT alimentados com WD * [1,2 (1,2-1,3),

P

= 0,053] (Figura 1F). A expressão de

Acaa1b

também foi encontrado para ser aumentado significativamente tanto no MLH1

+/- WD * e MLH1

+ /+ WD * camundongos [2,6 (2,3-2,8) e 1,7 ( 1,7-1,8), respectivamente] (Figura S3). Os níveis de

Slc5a8

e

SOCS1

não diferiu entre o grupo controle e os grupos de estudo (Figura 1C, E).

Notavelmente, não há idade ou dieta significativa expressão mudanças de expressão relacionados foram encontrados em

Apc

ou

MLH1

. Como no início, a expressão de

MLH1

foi aproximadamente 50% menor nos ratos heterozigotos em comparação com ratinhos WT, indicando que a segunda batida de inactivação de

MLH1

ainda não tinha ocorrido por tp1 ( Figura 1A). A expressão de

Apc

foi semelhante em ambos os genótipos (StellARray).

aumentos significativos nos níveis de metilação do DNA acompanham reduzida expressão de genes

Os níveis de metilação do CGIs do genes que manifestaram diminuição estatisticamente significativa na expressão de mRNA em associação com

MLH1

heterozigosidade e /ou WD * (

DKK1, Slc5a8, Hoxd1

, e

SOCS1

; Tabela 4 ) foram analisados ​​individualmente para cada rato TP0 e tp1 usando MassARRAY EPITYPER

TM sistema de Sequenom. Além disso,

MLH1

, e

Sfrp1

que mostrou diminuição relacionada com a idade expressão de significância limítrofe (1,4 vezes,

P

= 0,06) no MLH1

+ 0,05.