Abstract

Introdução

MicroRNAs (miRNAs) têm funções reguladoras importantes em processos celulares e têm se mostrado promissoras potencial como marcadores prognósticos para a evolução da doença em pacientes com câncer. O objetivo do presente estudo foi o de encontrar perfis de expressão de miRNA em sangue total que eram prognóstico para a sobrevida global (OS) em pacientes com câncer colorretal metastático (mCRC) tratados com cetuximab e irinotecano.

Métodos

de 138 pacientes com mCRC em 3

linha terapêutica rd com cetuximab e irinotecano em um estudo prospectivo de fase II, 738 miRNAs de pré-tratamento foram isolados e perfilados de sangue total usando a matriz v2.0 TaqMan MicroRNA. estado de mutação do

KRAS, BRAF e PI3KCA

era conhecido

Resultados

Após o ajuste Bonferroni, 6 miRNAs:. (MIR-345, miR-143, miR-34a *, miR-628-5p, miR-886-3p e miR-324-3p), foram encontrados associados a curto OS. miR-345 foi o mais forte prognóstico miRNA, significativa no grupo completo e, no

KRAS

população não-mutante. miR-345, como uma variável contínua em toda a coorte, resultou em uma taxa de risco (HR) de 2,38 por IQR (IC 95%: 1,8-3,1,

P

-valor = 2.86e-07, Bonferroni ajustado, análise univariável) e uma HR = 1,75 per IQR (IC 95%: 1,24-2,48,

P

-Wald = 1.45e-03) na análise multivariada ajustada por sexo, idade, KRAS, PI3KCA e performance status. miR-345 era prognóstico na sobrevida livre de progressão (PFS) com uma HR = 1,63 per IQR (IC 95%: 1,25-2,114,

P

-Wald = 2.92e-4) na análise multivariada. Além disso, a alta expressão de miR-345 foi associado com a falta de resposta ao tratamento com cetuximab e irinotecano.

Conclusão

Foram identificados miR-345 no sangue total como um biomarcador potencial para evolução clínica. MiR-345 era um único biomarcador de prognóstico tanto para OS e PFS em todos os pacientes e também na não-

KRAS

população mutante

Citation:. Schou JV, Rossi S, Jensen BV, Nielsen DL, Pfeiffer P, Høgdall E, et al. (2014) miR-345 em câncer colorretal metastático: um biomarcador não invasivo para Resultados Clínicos em-KRAS não Mutant pacientes tratados com 3

rd Linha cetuximab e irinotecano. PLoS ONE 9 (6): e99886. doi: 10.1371 /journal.pone.0099886

editor: Pierre Busson, Gustave Roussy, França |

Recebido: 03 de fevereiro de 2014; Aceito: 20 de maio de 2014; Publicação: 18 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Schou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas do Conselho de Investigação em Herlev Hospital, o Ministério do Interior e da Saúde, Merck-Serono Dinamarca /Suécia dinamarquês, ea União Europeia Sétimo Programa-Quadro [FP7 /2007-2013] ao abrigo do contrato de concessão não 222916 (dada a MK). ST é um investigador clínico sênior do Fundo de Investigação Científica Flandres e é suportado pelo Plano belga Nacional do Câncer. ST e RS também é apoiada pela Fundação Fournier-Majoie, FFMI, Bélgica. MD é suportado em parte pela Swiss National Science Foundation (SNF; https://www.snf.ch/E/; Grant No. 320030_135421); Krebsforschung Schweiz (KFS; https://www.krebsforschung.ch/; Grant No. 02697-08-2010); e pela Fondation Medic. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. MK empregado em AROS Biotecnologia Aplicada. A empresa não tem qualquer interesse financeiro e patentes envolvidas nesta publicação. Isto não altera a adesão dos autores para as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer colorretal (CCR) é a rd 3

câncer mais comum em todo o mundo. Vinte por cento dos pacientes com diagnóstico de CRC têm doença metastática e um adicional de 30-35% vai desenvolver metástases mais tarde durante o decurso da sua doença [1], [2].

Cetuximab, um anticorpo IgG1 monoclonal dirigido contra o Fator de Crescimento epidérmico Receptor (EGFR), tem demonstrado eficácia em combinação com quimioterapia em pacientes com câncer colorretal metastático (mCRC), embora não em pacientes com

KRAS

mutações, [3], [4] que são vistos em cerca de 40% dos pacientes com CCR. No entanto, apenas um subconjunto de pacientes com

KRAS

tipo selvagem (wt) serão beneficiados com cetuximab. Assim, há uma grande necessidade de identificar novos biomarcadores de resposta ao tratamento com cetuximab no subgrupo de pacientes com CCRm e

KRAS

.

Durante os últimos anos, tem havido um rápido crescimento interesse em microRNAs (miRNAs) como potenciais novos biomarcadores em pacientes com câncer. MiRNAs são pequenos RNAs não codificantes endógenos com 19-22 nucleótidos que regula a expressão do gene ao nível pós-transcricional. Até à data, mais do que 2000 sequências de miARN humano foram identificados, e o número está a crescer [5]. MiRNAs tem funções reguladoras importantes em processos celulares básicos e agir como oncogenes e genes supressores de tumores [6]. Os miRNAs estão envolvidos na predisposição ao câncer, desenvolvimento e progressão através da desregulamentação dos genes e /ou polimorfismo de nucleotídeo único. MiRNAs em um cenário de câncer podem ser classificados com base em suas funções principais:. Oncomir, metastamir, apoptomir, hypoxamir e angiomir

miRNAs circulantes podem ser facilmente coletadas e

parece muito estável sob condições adversas, a longo tempo de armazenamento e depois de vários ciclos de congelamento e descongelamento.

[7]

,

[8]

Além disso,

uma amostra de sangue é mais conveniente e menos invasiva para os doentes do que uma biópsia.

Além de ter um potencial de diagnóstico, [9], [10], [11] certas miARNs têm sido mostrados para ser prognóstico. Serum miR-141 foi sugerido como um biomarcador de prognóstico para pacientes com CRC [12] e soro miR-21 como um biomarcador de diagnóstico e prognóstico no CRC. [13]

O objetivo do presente estudo biomarcador prospectivo foi avaliar se a perfis de

miRNA no sangue total foram prognóstico para a sobrevida global e o resultado clínico em pacientes com mCRC antes de 3

rd linha tratamento com cetuximab e irinotecano.

Métodos

pacientes e tratamento

em um estudo prospectivo de fase II desenhado para avaliar a eficácia do cetuximab e irinotecano como 3

linha terapêutica rd em pacientes com mCRC, pré-tratamento expressões miRNA de sangue total foram medidos em 143 pacientes. Todos os pacientes eram resistentes a 5-FU, oxaliplatina e irinotecano e tratou-se com irinotecano (180 mg /m

2) e cetuximab (500 mg /m

2) a cada segunda semana [14]. Os pacientes foram incluídos de três hospitais dinamarqueses de outubro de 2006 a outubro de 2008 e tratados até progressão da doença e seguiu até a morte ou 1º de setembro de 2012.

Ética Declaração

Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito, e o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Regional no âmbito do Comité Nacional da Dinamarca sobre Saúde Ética em Pesquisa (VEK ref. KA-20060094, www.cvk.sum.dk).

KRAS

,

BRAF

e

PI3KCA

Mutation Estado

De todos os pacientes, foram selecionados fixados em formalina embebidos em parafina blocos (FFPE) de tecido, representando o tumor. Os tecidos FFPE foram cortadas em secções de 3-4 micrómetros e coradas com hematoxilina e eosina (H E) para avaliar e confirmar tecido tumoral no bloco de tecido seleccionado. Resumidamente, três secções de tecido foram tratados uma vez com xileno, seguido de uma lavagem em etanol. O pelete foi re-suspenso em ATL (tampão de lise do tecido) de tampão e tratadas com proteinase-K durante a noite a 56 ° C. Após inactivação de Proteinase K-aquecendo o DNA foi extraído utilizando o Kit QIAamp DNA Mini.

KRAS

mutações no códon 12 e 13 foram analisados ​​utilizando o TheraScreen

KRAS

kit mutação (DxS Ltd, Manchester, Reino Unido), que identifica 7 somática

KRAS

mutações. Os pacientes foram classificados de acordo com se uma mutação estava presente (

KRAS mutante

, mt) ou não (

KRAS

tipo selvagem, em peso). [15], [16] V600

BRAF

mutação análises com uma sensibilidade de 5% foram realizadas por pirossequenciao (Pyromark Q24) utilizando iniciadores como descrito por Richman et al [17].

PIK3CA

mutações foram detectadas utilizando o TheraScreen

PI3KCA

kit mutação (diagnóstico DXS), o teste para quatro mutações somáticas no exão 9 e no exão 20 do

PI3KCA

oncogene ( p.H104R, p.E542K, p.E545K /D). O p.H104R mutações, p.E542K, p.E545K foram detectados com uma sensibilidade de 1% e p.E545D foi detectada com uma sensibilidade de 2%.

A extracção de ARN a partir de ARN de sangue PAXgene tubos

amostras de sangue de pré-tratamento foram colhidas em tubos de ARN PAXgene Blood (Qiagen) e armazenado a -80 ° C de acordo com as instruções do fabricante. ARNs pequenos foram extraídos a partir dos tubos PAXgene de ARN de sangue em duas fracções. [18] Estes tubos foram processados ​​na BiorobotMDx (Qiagen, Hilden, Alemanha) utilizando um protocolo de personalização que se liga grandes ARN e resgata a execução através da placa de ligação de ARN . A condição vinculativa no run-through foi posteriormente modificado permitindo que o miRNA para ser purificada em uma placa RNeasy-96. A concentração das fracções de ARN pequenas foi avaliada por espectrometria de absorvância em um DTX 880 (Beckman Coulter).

miARN Expressão em sangue inteiro de

O perfil de miARN foi realizada em TaqMan matriz MicroRNA Humana Um cartões e B v2.0 (Applied Biosystems) utilizando os reagentes e as instruções do fabricante. RNA foi transcrito em cDNA em duas reações multiplex cada uma contendo 3 ul da preparação de RNA pequeno e quer Megaplex RT Primer uma piscina ou Piscina B e utilizando o TaqMan MicroRNA Transcrição Reversa Kit em um volume total de 14 mL. Antes da carga das matrizes de uma reacção de pré-amplificação ciclo 12 foi realizada utilizando 2,5 uL de ADNc numa reacção de 25 ul. Cada uma das matrizes foi carregado com 800 ul Universal PCR ensaio MasterMix contendo 1/40 da reação pré-amplificação e executado no 7900 HT Rápido Real-Time PCR System.

Análise Expressão Mirna

Qualidade avaliação.

As amostras com uma absorvância inferior a 1,8 foram descartados e valores com a detecção significa ciclos superiores a 29,5 foram considerados os valores em falta. Calculamos, para avaliar a qualidade dos dados, o número de miRNAs detectados por amostra (Figura S1 no arquivo S1) e a expressão miRNAs média por amostra (Figura S2 no arquivo S1). controles internos foram analisados ​​para avaliar reprodutibilidade

Normalização e filtragem

Os dados foram normalizados utilizando a média global de normalização [19] e alterações na expressão foram calculados utilizando a 2

.. – método de ΔCt. Os dados foram normalizados antes da análise. [20] Somente as 138 amostras com pelo menos 51% miRNAs expressos foram retidos. MiRNAs com mais de 21% (o ponto de corte é o nível estimado em que a percentagem de miRNAs retido atinge um patamar por cento) os valores em falta foram descartados: 402 de 768 foram retidos (372 miRNAs: apenas parte deles CRC específico e 30 sondas de controlo :. repetições de U6, RNU24, RNU43, RNU44, RNU48 e RNU6B)

Uma vez que as amostras vieram de três hospitais diferentes, foi realizada Análise de componentes Principais para verificar se há viés pelo hospital. Figura S3 no arquivo S1 mostra algumas diferenças por centro. Os dados foram ajustados pelo centro utilizando o algoritmo de combate lote de correção, [21] a partir da biblioteca sva Bioconductor, [22] veja a Figura S4 no arquivo de S1.

Análise Estatística

Os dados foram analisados ​​com R versão 3.0.1. Mann-Whitney (se 2 grupos) ou Kruskal-Wallis (se mais de 2 grupos) testes seguido de

P -Valores

ajuste pela Benjamini método de Hochberg (FDR 5%) foram realizados para determinar miRNAs diferencialmente expressos entre as classes de amostras (

KRAS, BRAF, PI3KCA

, double peso, benefício clínico, performance status)

univariada e. sobrevida multivariada análises foram realizadas utilizando o riscos proporcionais de Cox de regressão (pacote de “sobrevivência” em R). Nós relatamos-teste único e Bonferroni ajustado

P

-Valores com base no número de miRNAs testados na sobrevida global univariável (OS) e modelos de regressão de sobrevivência livre de progressão (PFS). Um procedimento de inicialização (150 bootstraps como por padrão para este procedimento) a partir da estratégia de modelagem de regressão foi realizada para validar os miRNAs embutidos baseados modelos de sobrevivência de Cox (rms biblioteca R), as probabilidades de concordância foram calculados pela elaboração dos erros padrões (entre os outros disponíveis estatísticas) entre o modelo ajustado amostrado-re e do modelo original em cada etapa de inicialização. A medida de concordância representa uma probabilidade, ele mede o quão bem nosso modelo discrimina entre respostas diferentes, onde C = 0,5 implícitas nenhuma capacidade preditiva. . No nosso caso, C 0,5 significa que que os miRNAs específicos é um bom preditor

análise de sobrevida multivariada foi realizada com as seguintes variáveis: miRNAs (como variáveis ​​contínuas), sexo,

KRAS

,

PI3KCA

e idade (dicotomizado pela mediana = 63 anos).

BRAF

foi excluído da análise multivariada devido ao baixo número de pacientes mutados com eventos (n = 2). As expressões dos miRNAs contínuas foram dicotomizados em risco alto e baixo pela mediana dos valores de expressão para visualização nos gráficos de Kaplan-Meier. figuras de Kaplan-Meier foram relatados para cada modelo de sobrevivência equipada com, pelo menos, um miARN estatisticamente significativa. Os números de Kaplan-Meier também mostram taxas de risco (HR), intervalos de confiança (IC) e não ajustados Wald

P

-Valores a partir de modelos de regressão de Cox para comparações de pares específicos de interesse. taxas de risco de variáveis ​​contínuas são apresentados em unidades intervalo interquartil (IQR).

Meta e Análise de Caminho

Para identificar vias moleculares potencialmente alterados pela expressão de miRNAs únicos ou múltiplos, foi utilizada a Diana -mirPath software [23], uma ferramenta computacional baseada na web. O software realiza uma análise enriquecimento dos genes alvo de vários miRNAs, comparando-os a todas as vias KEGG.

As bases de dados utilizadas foram TarBase (www.microrna.gr/tarbase) ou microT-CDS (www.microrna. gr /microT-CDS).

resultados

características clínicas e Mutação Estado dos pacientes

Depois de avaliação da qualidade, amostras de cinco pacientes foram descartados. As características basais clínicas e distribuição de

KRAS, BRAF,

e

PI3KCA

estado de mutação dos restantes 138 pacientes com mCRC incluídos no presente estudo biomarcador são apresentados na Tabela 1. Todos os pacientes foram tratados sem conhecimento do seu estado mutacional.

miR-345 era prognóstico para a sobrevida global

cento e trinta e dois (95%) pacientes estavam mortos no momento do follow-up (em setembro 2012). sobrevida global mediana dos pacientes foi de 10,6 meses (95% CI: 2.1-38.2 meses). Não foi observada diferença na OS entre os 3 centros

Depois de ajustar com o método de Bonferroni, encontramos seis miRNAs prognósticos:. alta expressão de miR-345, miR-143, miR-34a *, miR-628- 5p, miR-886-3p e baixa expressão de miR-324-3p foram associados com curto OS (Tabela 2). Os gráficos de Kaplan-Meier para os seis miARNs prognósticos são mostrados na Figura 1.

Os pacientes foram dicotomizados pelo valor da expressão mediana para miR-345. baixa expressão miRNA (vermelho) e de expressão miRNA alta (azul). O

P

-valor refere-se ao teste de Wald

A lista completa de miRNAs prognóstico para OS antes da correção Bonferroni é fornecida na Tabela S1 no arquivo de S1; -. A total de 64 miRNAs em cada 372 foram prognóstico, 50 com a expressão mais elevada associada a um pior prognóstico e 14 com menor expressão associada a pior prognóstico, nenhum dos controles (U6, RNU24, RNU43, RNU44, RNU48 e RNU6B) foram prognóstico. A trama do vulcão, mostrando pontuação Z, calculado por análise de regressão Cox e um valor de p não corrigida, é mostrado na Figura S5 no arquivo S1

análise de sobrevida multivariada foi realizada com as seguintes variáveis:. MiR-345, miR- 143, miR-34a *, miR-628-5p, miR-886-3p, miR-324-3p, sexo,

KRAS, PI3KCA

e idade (dicotomizado pela mediana = 63 anos). Os resultados são apresentados na Tabela 3.

Em OS, miR-345 e miR-324-3p foram os dois únicos miRNAs que foram estatisticamente significativa tanto na análise multivariada ea análise univariável. performance status e

KRAS

também foram fatores significativos na análise multivariada, embora

KRAS

foi limítrofe significativa como um fator univariada (HR = 1,36, 95% CI: 0,94-1,97).

miR-345 como um único miRNA marcador para Resultados clínicos

miR-345 também foi preditivo para PFS, HR pelo IQR = 1,7, (IC 95%: 1,31-2,2, ajustado Bonferroni

P

-valor = 0,021). Além de ser significativo para OS em toda a coorte, miR-345 foi estatisticamente significativa em todos os modelos de sobrevivência para os subgrupos de pacientes com peso de

KRAS

,

BRAF

,

PI3KCA

e dê um duplo peso para as combinações,

KRAS

+

BRAF

e

KRAS

+

PI3KCA,

ver Tabelas S2-6 no arquivo de S1. miR-345 era prognóstico para OS no

BRAF

+

PI3KCA

peso do grupo e no grupo de peso triplo (

BRAF

wt +

KRAS

wt +

PI3KCA

em peso), mas não na do PFS em análises. Comparou-se o estado mutacional disponível em combinação com a expressão de miR-345 que diz respeito ao SO (Figura 2) e PFS (Figura 3).

Pacientes (A) foram dicotomizados por

KRAS

mutação status e miR-345. (B) Os pacientes foram dicotomizados pela

BRAF

estatuto mutações WT e miR-345. (C) Os pacientes foram dicotomizados pela

PI3KCA

estado de mutação e miR-345. (D) Os pacientes foram dicotomizados com um duplo estado de mutação em peso e miR-345. O

P

-valor refere-se ao teste de Wald.

Os pacientes foram dicotomizados pela baixa expressão de miR-345 (vermelho) e alta expressão de miR-345 (azul). Pacientes (A) foram dicotomizadas pelo valor da expressão mediana para miR-345. (B) Os pacientes foram dicotomizados pela

KRAS

status de mutações e miR-345. (C) Os pacientes foram dicotomizados pela

BRAF

WT status de mutações e miR-345. (D) Os pacientes foram dicotomizados pela

PI3KCA

status de mutações e miR-345. (E) Os pacientes foram dicotomizados com um duplo estado de mutação em peso e miR-345. O

P

-valor refere-se ao teste de Wald.

Os modelos de Cox equipados foram validadas pelo procedimento de reamostragem. O modelo montado no miR-345 e OS mostrou boa concordância, mais alto do que todos os outros miRNAs analisados ​​em OS (Figura S6 no arquivo S1).

Nós também verificado se miR-345 expressão foi associada com a resposta ao tratamento e benefício clínico. Pudemos ver que maior expressão foi associada com falta de resposta (Figura 4). Para analisar este ainda mais, restringimos nosso conjunto de pacientes para aqueles com uma resposta parcial (n = 24) e doença progressiva (n = 37), em resposta melhor no geral. Em seguida, comparou o número de pacientes com uma expressão menor e maior miR-345 de acordo com a expressão mediana de miR-345 e obteve uma relação significativa entre o miR-345 expressão e resposta à terapia com um odds ratio de 5,37 (

P

-valor = 0,004; IC 95%: 1,56-20,94)

Se restringirmos nosso conjunto de pacientes para aqueles com resposta parcial (n = 24) e doença progressiva (n = 37), a. relação significativa entre a expressão de miR-345 e resposta à terapia foi obtida com um odds ratio de 5,37, (

P

-valor = 0,004 e IC 95%: 1,56-20,94).

Caminho e Análise alvo

para identificar vias moleculares associadas à expressão dos miRNAs seis prognósticos para oS (miR-345, miR-143, miR-34a *, miR-628-5p, miR-886- 3p, miR-324-3p), testamos caminhos KEGG. Entre os estatisticamente significativas, o cancro colorectal (KEGG via hsa05210) estava presente devido às interações previstos entre estes miRNAs e os seguintes genes-alvo:. TCF4, APC, SMAD4, MAPK8, PIK3CG, PIK3CD, DCC, PIK3CG, PIK3CA e MAPK1

Discussão

em primeiro e posteriores linhas de tratamento de pacientes com mCRC a adição de cetuximab à quimioterapia pode ser benéfica em pacientes sem mutações no

KRAS Comprar e

BRAF

[24], [25], [26]. No entanto, estudos mais recentes com cetuximab em primeira linha CCRm, não pôde confirmar um benefício na PFS e OS em

KRAS

pacientes wt. [27], [28]. Há uma necessidade de biomarcadores ou painéis de biomarcadores mais precisos. O presente estudo biomarcador prospectivo foi conduzido para identificar miRNAs prognósticos em sangue total de pacientes com mCRC tratados com 3

cetuximab linha rd e irinotecano.

Nosso estudo sugere um papel potencial dos miRNAs circulantes para servir como biomarcadores para o resultado clínico em pacientes com mCRC. Descobrimos que miR-345 era prognóstico para OS em todos os nossos pacientes com mCRC e no

KRAS

pacientes em peso, com alta expressão associada com menor sobrevida. A análise multivariada demonstrou que miR-345 foi um forte fator que adicionou informação prognóstica para as outras variáveis ​​clínico-patológicas e mutação disponíveis. Carga tumoral é uma combinação do tamanho do tumor e número de metástases. Os dados referentes tamanho do tumor não estava disponível para nós, e, portanto, a carga tumoral não puderam ser incluídas na análise multivariada. Nós, no entanto, incluem uma lista representativa de co-variáveis ​​que são consideradas como fatores de prognóstico para pacientes com mCRC tratados com cetuximab.

miR-345 foi estatisticamente significativa para todos os subgrupos wt analisados. Uma vez que todos os pacientes foram tratados com cetuximab, não podemos deduzir se miR-345 era um biomarcador de prognóstico (independente do tratamento, os pacientes receberam) ou um biomarcador previsão de sensibilidade ao tratamento com cetuximab e irinotecano, mas achamos que a sua expressão mais elevada foi associada com a falta da resposta à terapia. No grupo isolado de respondedores versus não-respondedores, uma elevada expressão de miR-345 foi significativamente associada com um 5 vezes o risco de doença progressiva como uma resposta melhor no geral. Estes resultados são novos achados e sugerem que este miRNA é prognóstico e pode ser um potencial biomarcador de resposta em pacientes com mCRC tratados com cetuximab e irinotecano.

circulando miR-345 tem a nosso conhecimento, não previamente foi descrito em conexão com CRC, mas Tang e colegas relataram que um baixo nível de miR-345 no tecido CRC é associada com metástases dos nódulos linfáticos, pior tipo histológico e é sobre-regulada em linhas celulares de cancro colorrectal após o tratamento com 5-aza-DC [29 ]. Além disso, os níveis de ADN-metilação da região do promotor de miR-345 são mais elevados no tecido do CCR em comparação com o tecido do cólon normal e correspondente tecido não-cancerosas, sugerindo que este miARN é um supressor de tumor sensível metilação [29].

em amostras de tecido, miR-345 é prognóstico em pacientes com câncer de mama [30]. Embora a validação em coortes externos não foi estatisticamente significativa, miR-345 foi o único miRNA permanecer prognóstico em um modelo de múltiplas variáveis, representando parâmetros clínicos fundamentais [30].

Não se sabe porque é que há uma discrepância entre expressão miRNA em tecidos e no sangue de pacientes com CRC. Poucos estudos compararam a expressão miRNA em amostras de tecido e de sangue correspondente. Pouca sobreposição é visto entre miRNAs na diferenciação das amostras de câncer de pulmão a partir de amostras de tecido pulmonar normal e miRNAs plasma diferenciação pacientes com agressiva contra o câncer de pulmão não-agressivo. [31] miR-345 foi encontrada diminuição no tecido CRC em um estudo relativamente pequeno de 26 CRC amostras de tecido em que apenas 5 pacientes tinham doença metastática. [29] Uma baixa concentração de miR-345 no tecido CRC predominantemente localizada não pode ser comparável à elevada concentração de circulação de miR-345 em CRC metastático. O mesmo miARN pode estar em formas diferentes relacionado com o tumor, de acordo com, se for encontrada no tumor ou como um miARN circulante.

miR-143 é jusante regulada em amostras de tumor de CRC, em comparação com o tecido normal . [32], [33], [34]

KRAS

pode ser um alvo para miR-143 [35] e os níveis de miR-143 expressão em amostras de tumores de CRC são um biomarcador prognóstico em

KRAS

pacientes wt mas não um marcador preditivo para o tratamento anti-EGFR. [36] Circulating miR-143 foi testado como marcador diagnóstico em pacientes de CRC, mas não é significativamente desregulada em comparação com controlos normais. [37] miR-324- 3p não foi descrito no CRC, mas é diferente expressa no plasma de doentes com cancro da mama em comparação com controles saudáveis. [38].

a força do nosso estudo foi o tamanho da amostra relativamente grande, o procedimento de inicialização (resampling validação do modelo de regressão de Cox), e uma abordagem estatística rigorosa usando apenas miRNAs ajustados de acordo com a correção de Bonferroni. O próximo passo será o de validar esses miRNAs significativas no sangue de outro grupo de pacientes com CCRm tratados com cetuximab e irinotecano. Actualmente, não existem tais amostras estão disponíveis a partir de estudos realizados de fase III.

Não há estudos investigaram se as expressões de miRNA no sangue total têm um potencial como biomarcadores de prognóstico ou previsão em pacientes com mCRC tratados com cetuximab e irinotecano. A maioria dos estudos que investigam miARNs circulantes ter usado plasma ou soro. [39], [40] perfis de expressão de miARN no sangue total coletado em tubos PAXgene de ARN ter sido descrita em pacientes com doenças hematológicas, do pâncreas e cancro do pulmão [41], [42] e têm vantagens em comparação com miRNA no soro /plasma devido ao maior rendimento [43] de miRNAs e menos problemas metodológicos [44]. MiRNAs encontrados em todo o sangue periférico pode ser originado a partir de células cancerosas, mas também a partir de células não-cancerosas, tais como leucócitos, trombócitos e monócitos. Eles podem estar na corrente sanguínea de ligação às proteínas, como atrás [45] e o HDL [46] ou embalados em exossomas. [47] Os miARNs prognósticos, encontrados no nosso grupo de pacientes, pode ser devido a progressão tumoral, a resposta inflamatória ou como uma resposta à falha do órgão

.

recentemente, Shen e colegas relataram, que o EGFR estava envolvida na supressão de maturação miARN específica em resposta ao stress hipóxico. [48] o mecanismo proposto era que um de EGFR através da fosforilação de ago2, causou uma redução de DICER /ligação ago2 [48] por meio deste inibir a maturação de pré-miRNAs com a configuração de longo loop. A inibição de EGFR podem também causar regulação miARN intracelular e transportar alguns dos miARNs alterados para a corrente sanguínea, actuando assim como uma resposta de circulação para acções de EGFR.

Conclusão

Foram identificados seis miARNs circulando em sangue total como marcadores prognósticos para o OS. miR-345 era um único biomarcador para OS em todos os pacientes e em subgrupos de pacientes com

KRAS

peso e

KRAS + BRAF

peso de casal. Além disso, o miR-345 foi significativamente associada com PFS ea resposta melhor em geral e pode ser um potencial biomarcador para o resultado clínico em pacientes com mCRC tratado com 3

cetuximab linha rd e irinotecano.

Informações de Apoio

arquivo S1.

contém os seguintes arquivos:. Figura S1, S2 Figura, Figura S3, S4 Figura, Tabela S1, S2 Tabela, Tabela S3, S4 Tabela, Tabela S5, S6 Tabela, Figura S5, S6 Figura

doi: 10.1371 /journal.pone.0099886.s001

(DOCX)

Reconhecimentos

Agradecemos Nina Dahl Kjersgaard e Beata Gregersen, Hospital Herlev para excelente assistência técnica. Birgitte Christiansen, Trine S. Rasmussen e os enfermeiros e técnicos da Unidade de Pesquisa Clínica e da Unidade de Tratamento Experimental em Herlev Hospital, Hospital Odense e Hospital Aalborg estão agradecidos pela excelente assistência. Danish Cancer Biobank em Herlev Hospital é agradecido para a manipulação de amostras de tecido.