Abstract

A superexpressão ou ativação do AMP cíclico de resposta de ligação elemento de proteína (CREB ) tem sido conhecido por estar envolvido em várias neoplasias humanas, incluindo câncer de pulmão. Os genes regulados por CREB foram relatados para suprimir a apoptose, induzir a proliferação celular, inflamação e metástases de tumores. No entanto, os genes alvo de críticas de CREB no cancro do pulmão não foram bem compreendidas. Aqui, nós identificada GSK-3α como um dos genes alvo CREB que é crítico para a viabilidade das células de cancro do pulmão. O knockdown CREB reduziu significativamente a expressão de GSK-3α e a ligação directa de CREB no promotor de

GSK3A

foi identificado. A análise de Kaplan-Meier com uma base de dados pública mostrou um significado prognóstico da expressão GSK-3α aberrante no câncer de pulmão. A inibição de GSK-3α suprimida a viabilidade celular, a formação de colónias, e o crescimento do tumor. Pela primeira vez, demonstrou-se que a GSK-3α é regulada por CREB no cancro do pulmão e é necessária para a viabilidade celular. Estas descobertas implicam eixo CREB-GSK-3a como um novo alvo terapêutico para o tratamento do cancro do pulmão

Citation:. Park SA, Lee JW, Herbst RS, Koo JS (2016) GSK-3α é um novo alvo de CREB e CREB-GSK-3α Sinalização Participa de viabilidade celular no câncer de pulmão. PLoS ONE 11 (4): e0153075. doi: 10.1371 /journal.pone.0153075

editor: Irina U. Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos

Recebido: 06 de fevereiro de 2015; Aceito: 23 de março de 2016; Publicação: 06 de abril de 2016

Direitos de autor: © 2016 Park et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional do Câncer concessão R01-CA126801 (a Ja Seok Koo) e Cancer Support Center Grant CA-16359 (ao Câncer de Yale Centro). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O fator de transcrição AMP cíclico-resposta proteína de ligação ao elemento (CREB) regula diversos processos celulares que incluem a diferenciação celular, proliferação, sobrevivência, o metabolismo da glicose, regulação imune, e plasticidade sináptica associada à memória [1-7] . Anteriormente, mostrámos que CREB é crítico para a regulação da diferenciação de células normais da mucosa brônquica epitelial humana (NHTBE) [8]. Além disso, a duração de sobrevivência diminuiu foi significativamente associada com a sobre-expressão de CREB ou CREB activado (p-CREB) em nunca fumantes com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) [9] e do knockdown de CREB suprime a viabilidade das células de câncer de pulmão [10]. Várias cinases de serina-treonina pode activar CREB e p-CREB induz a expressão de vários genes de resposta a cAMP-elemento, contendo os quais desempenham papéis importantes na função de CREB. Várias abordagens para a identificação de genes alvo de CREB foram relatados [11-14], mas os genes-alvo distintas de CREB em cancro do pulmão permanecem em grande parte desconhecida.

GSK-3, que tem duas isoformas de GSK-3α e GSK- 3β, é uma proteína quinase serina /treonina que está envolvida na progressão do ciclo celular, a diferenciação e a apoptose. A GSK-3 é constitutivamente activa em células em repouso e que fosforila e inibe a sinalização oncogénica tais como β-catenina /WNT via [15-21]. Embora a GSK-3 tem sido estudado como um supressor de tumor [22-24], há evidências crescentes de que a GSK-3 desempenha um papel oncogénica em vários cancros humanos. A maioria dos estudos têm-se centrado no papel de um total de GSK-3 ou de GSK-3β [25-27], mas estudos recentes implicaram o papel oncogénica de GSK-3α na leucemia mielóide aguda (LMA) [28], o cancro da próstata [29], e câncer pancreático [30]. Curiosamente, a sobre-expressão de CREB ou o aumento da sua actividade tem sido associada com a progressão destes cancros humanos [31-36]. Em particular, as funções de CREB como um proto-oncogene LBC em [31, 37] e a GSK-3α também é um alvo fundamental para a terapia de AML [28]. Recentemente, a GSK-3α e GSK-3β têm sido referidos como sendo novos alvos quinase de tivantinib, que é um inibidor potente e selectivo do receptor de tirosina quinase c-Met, em células de cancro de pulmão. Tivantinib mostrou maior potência para a GSK-3α mais do que para a GSK-3β e a inibição de GSK-3α ou GSK-3β expressão causou apoptose em células de cancro do pulmão [38].

Aqui, identificado pela primeira vez que GSK- 3α, não GSK-3β, é regulada pela CREB em células de câncer de pulmão. Além disso, examinamos de que existe uma correlação positiva entre a expressão elevada GSK-3α e menor sobrevida dos pacientes com câncer de pulmão. Knockdown de GSK-3α atenua a viabilidade celular, a formação de colónias, e o crescimento do tumor. Juntos, estes resultados implicam que a GSK-3α é um gene alvo crítica de CREB e sinalização CREB-GSK-3α é um potencial alvo terapêutico para o câncer de pulmão.

Materiais e Métodos

celular cultura

linhas celulares de cancro de pulmão humano (H1993, H1437, H1734, e A549) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection. cancro do pulmão células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Invitrogen), suplementado com 10% (volume /volume) inactivado por calor de bovino fetal /soro (FBS, Sigma Aldrich), 2 mM de L-glutamina, 100 U /ml de penicilina G de sódio e 100 ug /ml de sulfato de estreptomicina (Invitrogen). células epiteliais humanas normais traqueobrônquica (NHTBE) foram obtidos a partir da Lonza Walkersville, Inc. e cultivadas em BEGM

™ com vários suplementos. Todas as células foram passadas diretamente de ações de baixo passagem original e foram usados ​​antes da passagem 30. As células também foram testados nos últimos três meses para a morfologia correta por microscópio e para detectar contaminação por micoplasma usando um kit de detecção MycoAlert mycoplasma (Lonza Walkersville, Inc .). Todas as células foram cultivadas a 37 ° C em atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO

2.

Anticorpos /Química

monoclonal anti-actina-β anticorpo (A2228) foi adquiridos de Sigma Aldrich. anticorpo policlonal de coelho contra a GSK-3α (ab28833) foi adquirido a partir de Abcam. Forscolina (3828), anti-CREB (9197), anti-P-CREB (9198), anti-ciclina A2 (4656), B1 anti-ciclina (4138), anti-ciclina E2 (4132), e a GSK-3β ( 12456) foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology. Coelho monoclonal ciclina D1 anticorpo (2261-1) foi comprado de Epitomics

Knockdown /superexpressão de genes

Silencer CREB siRNA e GSK-3a siRNAs foram adquiridos da Thermo científico ou Invitrogen.; CREB siRNA (109994, Invitrogen), a GSK-3α siRNA-1 (L-003009-00-0005, ON-TARGETplus SmartPool, ThermoScientific), e GSK-3α siRNA-2 (145366, Invitrogen). BLOCO-lo fluorescente oligo (Invitrogen) foi utilizado como um controlo. Cada siARN foi transfectadas utilizando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). Além disso, as células foram infectadas com lentivírus ou shRNAs shScrambled segmentação de CREB ou GSK-3α com 8 ug /ml de polibreno e as células infectadas foram seleccionadas com puromicina. As sequências de shRNAs estão listados na Tabela S1 (disponível on-line). Para a sobre-expressão de CREB, células H1437 e A549 foram transfectadas com ADN de plasmídeo pCMV-de vazio ou pCMV-CREB (Clontech Laboratories, Inc.) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Viabilidade Celular

celular a viabilidade foi avaliada pelo ensaio de MTT. Depois as células foram transfectadas com ARNsi durante 72 h, as células foram incubadas com MTT (concentração final de 0,5 mg /ml) durante 4 h a 37 ° C incubadora. Após a incubação, MTT, 150 ul de DMSO a 100% foi adicionado para dissolver os cristais. As células viáveis ​​foram contadas por leitura da absorvância a 570 nm utilizando um leitor de microplacas SpectraMax (Molecular Devices).

Ensaio de Formação de Colónias

A 24 horas após a transfecção por os ARNsi indicados, 2 x 10

3 células foram transferidas em placas de 6 poços e deixou-se crescer durante 7-14 dias. O meio foi removido, fixadas com formalina a 10% durante 15 minutos, e seguida por coloração com violeta de cristal para visualizar as colónias.

quantitativa PCR em tempo real

O ARN total foi purificado a partir de células usando um Kit RNeasy Mini (Qiagen). A transcrição reversa do RNA total foi realizada utilizando a transcriptase reversa M-MLV (Promega). PCR quantitativa (qPCR) foi realizada utilizando

SYBR verde de PCR Reagentes núcleo (Applied Biosystems) e iCycler termociclador (Bio-Rad Laboratories). As sequências dos iniciadores estão listadas na Tabela S1 (disponível on-line).

Análise Western Blot

padrão de SDS-PAGE e Western blotting procedimentos foram utilizados para analisar a expressão de várias proteínas. Os lisados ​​de células inteiras a partir de cada uma das linhas celulares de cancro de pulmão testadas foram preparadas utilizando tampão de lise de SDS (50 mM Tris-HCl, pH 6,8, SDS a 2%, glicerol a 10%, e 0,02% de azul de bromofenol), contendo inibidores de protease e fosfatase. Todas as proteínas foram visualizadas utilizando um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano e Amersham ECL

™ Western Blotting reagentes de detecção (GE Healthcare Life Sciences). A intensidade de bandas individuais foi quantificada utilizando o software ImageJ densitometria e expressos em relação ao sinal de actina, como uma medida da abundância relativa de proteínas em diferentes amostras.

imunoprecipitação da cromatina (ChIP)

O kit SimpleChIP enzimática (Cell Signaling) como descrito pelo fabricante. A PCR foi realizada com iniciadores específicos para as regiões promotoras indicados e as reacções foram realizadas em triplicado e 1% da entrada total de amostra foi utilizada como um controlo. As sequências dos iniciadores são listadas na Tabela S1 (disponível online).

Imunomarcação

Para imunofluorescência, detecção de anticorpos primários foi feito usando conjugados fluorescentes de Alexa Fluor

® 488 anticorpo (Invitrogen) juntamente com Prolongar

® ouro Antifade Reagente com DAPI (Invitrogen). Antes de coloração de tecidos embebidos em parafina fixos, seguimos o protocolo padrão que incluía medidas como desparafinização, recuperação antigênica e permeabilização.

Citometria de Fluxo

Para ciclo celular por citometria de fluxo, as células foram fixado em 70% de etanol e corados com coloração com iodeto de propídeo (BD Pharmingen) para o teor de ADN. A apoptose foi medida usando a anexina V apoptose Kit de Detecção de FITC (BD Pharmingen), seguindo as instruções do fabricante.

In Vivo

Estudos

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) da Universidade de Yale e conformado com os mandatos legais e diretrizes federais para o cuidado e manutenção de animais de laboratório (protocolo nº: 2012-11464). J fêmea: NU ratinhos nus foram obtidos a partir de Jackson Laboratory e utilizados quando 6-7 semanas de idade. células H1993 foram pré-tratadas com 20 nM de ARNsi de controlo ou ARNsi de GSK-3α durante 24 h, seguida de transplante (2 x 10

6 células /flanco, xenoenxerto n = 7 /grupo) no flanco de ratinhos. Além disso, H1993-shScrambled, H1993-shGSK3A Nº 2, ou H1993-shGSK3A # 4 As células foram inoculadas em flancos dorsais (6 x 10

5 células /flanco; shScrambled n = 9, shGSK3A # 2 N = 4, e shGSK3A # 4 n = 5). Todos os xenoenxertos foram transplantadas em ambos os flancos dorsais de ratos esquerda e direita. O volume do tumor foi medido com compassos de calibre digitais e calculado pela fórmula de 0,52 x comprimento x largura

2. Os ratinhos foram sacrificados no final do estudo por serem colocados numa câmara de dióxido de carbono.

Métodos Estatísticos

A quantificação resultados são apresentados como médias ± desvio padrão (SD). A significância estatística das diferenças entre os grupos foi determinada por estudante do

t

-teste, com um

P valor

abaixo de 0,01 considerado estatisticamente significativo. O método de Kaplan-Meier foi utilizado para analisar a sobrevida univariada, e as comparações das distribuições de sobrevivência entre os grupos foram realizadas pelo teste de log-rank.

Resultados

GSK-3α é regulada por CREB em células de câncer de pulmão

para investigar os genes-alvo CREB críticos no cancro do pulmão, foi realizada a análise qPCR utilizando primers específicos contra um subconjunto de genes relacionados à sobrevivência celular, proliferação e viabilidade em células CREB knockdown. Verificou-se que o nível de ARNm de GSK-3α, não no nível de GSK-3β, foi significativamente regulada negativamente por siARN de CREB em todas as linhas celulares de cancro de pulmão testadas (H1993, H1437, H1734, e A549) (Figura 1A). Além disso, a expressão da proteína de GSK-3α foi dramaticamente suprimida por knockdown de CREB em todas as linhas celulares de cancro de quatro pulmão testadas (Fig 1B), mas o nível de proteína de GSK-3β não foi alterado por CREB knockdown (Fig 1C).

(a) Efeito do knockdown CREB no nível de mRNA de

GSK3A

,

GSK3B

, e

CREB

. Cada uma das células indicadas foram transfectadas com ARNsi de controlo ou ARNsi de CREB (40 nM de cada) durante 48 h, seguido por análise de qPCR. Todos os valores nos gráficos representam ± SD média de três experiências independentes. Frente e verso

t-

teste. *,

P Art 0,01. (B-C) Efeito de knockdown de CREB nos níveis de proteína de GSK-3α (B) e a GSK-3β (C). Cada uma das células indicadas foram transfectadas com ARNsi de controlo ou CREB siRNA (40 nM, cada um) por 72 h, seguido por análise de western blot.

Notamos que o promotor de

GSK3A

continha vários locais de ligação de CREB putativa, conforme determinado por TFSEARCH (https://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html) (Figura 2A). Para examinar se a CREB liga-se ao humano

GSK3A

promotor, foi realizada ensaio ChIP utilizando anticorpos de imunoprecipitação de CREB e IgG como controlo negativo. Não só conjunto de iniciadores A, que abrange o local de ligação de consenso da CREB (-39 a -53), mas também outros três conjuntos de iniciadores (B: -459 a -476, C: -545 a -557, e D: -603 a – 616) mostrou a ligação do CREB no

GSK3A

promotor. No entanto, as regiões não específicos (NS-1, 2-NS, e NS-3) do promotor não mostrou qualquer ligação de CREB (Fig 2B). Além disso, o knockdown de CREB marcadamente suprimida a associação de CREB com o

GSK3A

promotor (Fig 2C). Consistente com os dados anteriores que mostraram CREB knockdown suprimiu a expressão de GSK-3α, a sobre-expressão de CREB fortemente induzida expressão de GSK-3α ao nível da proteína, após sobre-expressão transitória ou estável de CREB (Figura 2D). Na verdade, as expressões de p-CREB e GSK-3α foram aumentadas por forscolina, o que activa a adenilato-ciclase de enzima e aumenta os níveis intracelulares de AMP cíclico (Figura 2E). Tomados em conjunto, sugerimos que CREB é um potencial regulador a montante da GSK-3α em células de câncer de pulmão.

(A) Diagrama esquemático mostrando as posições dos elementos de ligação CREB localizados no promotor do gene do ser humano

GSK3A

(TFSEARCH). AD: as regiões específicas para iniciadores que cobrem elementos de ligação CREB, A: -39 a -53, B: -459 a -476, C: -545 a -557, D: -603 a -616, NS-1, – 2 e -3: as regiões para iniciadores que incluem não específicos elementos de ligação NS-1: -126 a -230, NS-2: -183 a -378, e NS-3: -1214 a -1356. As sequências dos iniciadores são indicadas no quadro S1 (disponível online). (B) a ligação directa de CREB no

GSK3A

promotor. Um ensaio feito com chip foi cromatinas preparados a partir de células H1993 e H1734. A ligação de CREB com o

GSK3A

promotor foi detectada por visualização do produto de PCR. As bandas individuais detectados em amostras de entrada indicam a especificidade dos iniciadores de PCR. (C) A ligação directa de CREB no

GSK3A

promotor em células CREB-knockdown. O nível de proteína de CREB em cada linha celular estável foi confirmada por análise Western Blot. (D) Efeito de sobreexpressão de CREB na expressão de GSK-3α. células H1437 foram transfectadas com a mesma quantidade de vector de expressão pCMV-vazio ou pCMV-CREB e a expressão de CREB, p-CREB, e GSK-3α foi examinada por análise de Western blot (esquerda). -Controlo A549 (A549-ctrl) ou A549-CREB células foram transfectadas com vectores pCMV e seleccionado por puromicina (1 jag /ml). O efeito de CREB na expressão de GSK-3α também foi confirmada (à direita). (E) Efeito de forscolina na indução do nível de p-CREB e GSK-3α. As células A549 e H1437 foram tratadas com forscolina (10 mM, 30 min) ea expressão de cada proteína foi examinado por análise de western blot.

GSK-3α é um factor de mau prognóstico no câncer de pulmão

Há evidências de que a GSK-3β é sobre-expresso no cancro do pulmão. A sobreexpressão de GSK-3β serve como um marcador independente de mau prognóstico para NSCLC e a sua inibição suprime a proliferação de células em células NSCLC [39]. No entanto, o papel da GSK-3α no cancro do pulmão ainda precisa de mais investigação. Aqui, verificou-se que a GSK-3α é sobre-expresso em várias linhas celulares de cancro do pulmão, em comparação com células NHTBE (Fig 3A).

(A) Os níveis de proteína de GSK-3α, p-CREB e CREB em múltiplos pulmão linhas celulares de cancro, em comparação com células NHTBE. análise (BD) de Kaplan-Meier de sobrevida global por baixo ou alto

GSK3A

(

GSK3A

conjunto de sonda 202210_x_at) expressão em (B) 1760 pacientes com cancro do pulmão, (C) 487 pacientes de adenocarcinoma de pulmão , e carcinoma (D) 422 de pulmão de células escamosas com o tratamento adjuvante. A análise de sobrevida global dos pacientes foi realizada utilizando modelo proporcional de Cox e dados de acompanhamento para o período indicado.

Para ponderar se a nossa descoberta de

GSK3A

superexpressão é relevante ao câncer de pulmão humano, utilizou-se disponível publicamente plotter Kaplan-Meier (https://kmplot.com/analysis), que é composto por 1760 pacientes com cancro do pulmão que recebem quimioterapia /radioterapia com base nos bancos de dados (CArray: n = 504; GSE14814 : n = 90; GSE19188: n = 156; GSE29013: n = 55; GSE31210: n = 246; GSE3141: n = 111; GSE37745: n = 196; GSE4573: n = 131; GSE8894: n = 138; e TCGA: n = 133). Para determinar se

GSK3A

mRNA (202210_x_at) abundância em tumores foi associado à sobrevida global, foi realizada na análise de sobrevida global dos pacientes em uso de modelo proporcional de Cox e de acompanhamento de dados para 200 meses após a cirurgia. Superexpressão de

GSK3A

níveis de mRNA foi associado com pior sobrevida global de pacientes com câncer de pulmão (rácio função dos riscos (HR) = 1,42, P = logrank 4.9e-06) (Fig 3B). Curiosamente,

GSK3A

níveis de mRNA foram mais fortemente associados com pior sobrevida global de pacientes com câncer de pulmão com adenocarcinoma (HR = 1,99, P = logrank 2.4e-06) (Fig 3C). No entanto, positivo

GSK3A

expressão não foi significativamente correlacionada com o tempo de sobrevida mais curta dos pacientes com o tipo de células escamosas carcinoma histologia (Fig 3D). Descobrimos também que a sobre-expressão de

CREB

nível de mRNA foi associado com pior sobrevida global de pacientes com câncer pulmonar com padrão muito semelhante para

GSK3A

mRNA (S2 Fig). Os nossos resultados sobre as amostras de tumor clínicos demonstram que a activação aberrante de GSK-3α está associada com a mortalidade humano de doentes com cancro do pulmão, especialmente com adenocarcinoma do pulmão.

A inibição de GSK-3α suprime a viabilidade das células de cancro do pulmão

Para determinar o efeito de GSK-3α, que é um gene alvo de CREB, que confirmou o efeito do knockdown de CREB sobre a viabilidade celular em várias linhas celulares de cancro de pulmão. Consistente com os nossos relatórios anteriores [10], a inibição CREB suprimida a viabilidade das células de câncer de pulmão (Fig 4A). Em seguida, knockdown de GSK-3α com a sua siRNA específico resultou numa diminuição da viabilidade de todas as linhas celulares de cancro de pulmão testadas (Figura 4B). Além disso, o knockdown de GSK-3α levou a reduzida formação de colónias de células (Fig 4C). Consequentemente, knockdown GSK-3α suprimiu significativamente a viabilidade celular de linhas celulares de cancro de pulmão KRAS-WT (H1993 e H1437), em comparação com linhagens de células de câncer de pulmão KRAS-mutante (H1734 e A549). Foi examinado o efeito do knockdown de GSK-3α na morte celular por meio de análise de FACS. Conforme apresentado na figura 4D, as células que expressam foram shGSK3A mostrou o aumento da morte celular comparado com cada linha celular de controlo. A validação de ARNsi ou shRNAs sobre a expressão de GSK-3α qPCR foi realizado por análise por Western blot ou em várias linhas celulares de cancro de pulmão (Fig S1). Estes resultados sugerem que a GSK-3α regula positivamente a viabilidade das células de cancro do pulmão.

(A) Efeito do knockdown de CREB sobre a viabilidade celular. linhas celulares de cancro do pulmão (H1993, H1437, H1734, e A549) foram transientemente transfectadas com ARNsi de controlo (50 nM), ou ARNsi de CREB (10, 50 nM) durante 72 h, seguido por ensaio MTT. Todos os valores nos gráficos representam ± SD média de três experiências independentes. Frente e verso

t

-teste. *,

P Art 0,01. (B) Efeito de GSK-3α knockdown sobre a viabilidade celular. As células foram transitoriamente transfectadas com ARNsi de controlo ou ARNsi de GSK-3α (40 nM, cada) durante 72 h e os dados quantitativos foi seguido por um ensaio MTT. Todos os valores nos gráficos representam ± SD média de três experiências independentes. Frente e verso

t-

teste. *,

P Art 0,01. (C) Efeito de knockdown GSK-3α na formação de colónias. Um dia após a transfecção de ARNsi de controlo (40 nM), ou ARNsi de GSK-3α (10, 40 nM), as células foram semeadas novamente em 6-poços com baixa densidade (2 x 10

3 /poço) e incubou-se durante 7-14 dias. A média ± DP de três experiências independentes. Frente e verso

t-

teste. *,

P Art 0,01. (D) Efeito de knockdown GSK-3α sobre a morte celular. células H1734 e H1993 foram infectadas com lentivírus expressando shRNA alvo GSK-3α (duas sequências; shGSK3A # 2 e 4 shGSK3A #) com 8 ug /ml de polibreno. Após 48 horas de infecção, as células foram seleccionadas com 0,5 ug /ml de puromicina para 3 dias. As células selecionadas foram realizadas através de coloração de anexina V e PI a morte celular por apoptose análise por LSRII.

sinalização CREB-GSK-3α é fundamental para a regulação da ciclinas

Para ganhar visão sobre o papel da GSK-3α na viabilidade das células do cancro do pulmão, primeiro analisou se GSK-3α regula ciclo celular usando análise FACS. Curiosamente, a GSK-3α knockdown fase S suprimida do ciclo celular, o que pode contribuir com a viabilidade celular reduzida de células de cancro do pulmão (Figura 5A). Como mostrado na Fig 5B, a expressão da proteína de vários ciclinas incluindo ciclina A2, ciclina B1, ciclina D1, ciclina e E2 foi marcadamente suprimida por knockdown GSK-3α em linhas celulares de cancro do pulmão. Além disso, estes resultados foram consistentes com relatórios anteriores que CREB pode regular a expressão de ciclinas [12, 31, 40, 41]. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a GSK-3α pode funcionar de forma positiva na viabilidade das células de cancro de pulmão através da regulação da expressão de ciclinas.

(A) Efeito do knockdown de GSK-3α sobre o ciclo celular. As células indicadas foram deixados em jejum em meio RPMI isento de soro durante 24 h e colocadas com meio RPMI suplementado com FBS a 10% durante mais 24 h. As células colhidas foram coradas com PI ao ciclo celular análise por LSRII. (B) Efeito do knockdown de GSK-3α sobre as expressões de genes relacionados com a viabilidade da célula ou do ciclo celular, incluindo ciclina A2, ciclina B1, ciclina D1, ciclina e E2. As células de cancro de pulmão foram transientemente transfectadas com ARNsi de controlo ou ARNsi de GSK-3α (40 nM, cada) durante 48 h e foram seguidas por análise de Western blot.

GSK-3α é crítica para o crescimento tumoral

a seguir, dirigiu-se ao papel que a GSK-3α no crescimento do tumor

in vivo

usando injeções subcutâneas de controlo ou células GSK-3α-empobrecido. O crescimento dos tumores foi monitorizado ao longo de cinco semanas após as células foram explantados em ratinhos nus. Fotografias representativas dos murganhos ao fim de cinco semanas mostrou que o desenvolvimento de tumores derivados das células de GSK-3α-empobrecido foi marcadamente suprimida em comparação com os tumores derivados das células de controlo (Fig 6A). Consistente com nossa hipótese e os dados, a GSK-3α knockdown resultou numa supressão significativa do crescimento do tumor e o volume do tumor (Fig 6B). Confirmou-se o efeito de depleção de GSK-3α sobre a expressão de GSK-3α ciclina B1 ou nos tecidos derivados de xenoenxertos (S5 FIG). Repetidamente, percebemos que a eliminação completa do

GSK3A

nas células não poderiam desenvolver os tumores em ratos pelados (Fig 6C e 6D). No geral, estes dados demonstram claramente que a diminuição dos níveis de crescimento GSK-3α prejudicar tumor do cancro do pulmão

in vivo

.

(A) Imagens representativas de xenotransplantes derivados de siRNA controle ou siRNA GSK-3α tenha sido tratada com células H1993. Após 24 horas de transfecção siRNA (20 nM, cada), as células foram inoculadas subcutaneamente no lado direito e esquerdo flancos dorsais laterais de ratinhos nus do sexo feminino (n = xenoenxerto 7 /grupo). (B) O volume de tumor de xenoenxertos de derivados de controlo ou de GSK-3α deficientes em células H1993 foram avaliados em cada ponto de tempo, tal como indicado. O volume do tumor foi medido com compassos de calibre digitais e calculado pela fórmula de 0,52 x comprimento x largura

2. Frente e verso

t

-teste. *,

P Art 0,01. (C) Imagens representativas de xenotransplantes derivados de H1993-shScrambled, shGSK3A # 2, # 4 ou shGSK3A células. As células foram inoculadas por via subcutânea nos flancos dorsais dos ratinhos nus (esquerdo: células shScrambled, direita: células shGSK3A) e o volume do tumor foi medido nos pontos de tempo indicados (shScrambled n = 9, shGSK3A # 2 N = 4, e shGSK3A # 4 N = 5). Frente e verso

t

-teste. *,

P

0,05

Discussão

Neste estudo, identificado pela primeira vez GSK-3α como um novo alvo de CREB em células de câncer de pulmão.. Nosso estudo revela papéis oncogênicos de GSK-3α como um gene alvo CREB e como um novo biomarcador de prognóstico no câncer de pulmão. A GSK-3α demonstrou ser um alvo terapêutico em vários cancros humanos, incluindo AML, cancro do pâncreas, e cancro da próstata. No entanto, o papel de GSK-3α no cancro do pulmão é ainda largamente desconhecida. Aqui, os nossos resultados mostram que a diminuição dos níveis de GSK-3α prejudicar a viabilidade das células de câncer de pulmão

in vitro

e

in vivo

. GSK-3α é abundante em várias linhas celulares de cancro do pulmão e tecidos tumorais de pulmão. Além disso, a sobre-expressão anormal de GSK-3α foi associada com um menor tempo de sobrevivência, especialmente em pacientes com adenocarcinoma de pulmão. Mais importante ainda, CREB regula a expressão de GSK-3α mas não a GSK-3β, sugerindo que existe um braço específico de sinalização de CREB-GSK-3α no cancro do pulmão.

A actividade de CREB é regulada pela fosforilação múltipla mecanismos e a fosforilação de CREB em serina-133 é necessário para o recrutamento da proteína de ligação co-activador CREB-(CBP) /P300 e a sua actividade de transcrição. Na verdade, a GSK-3 tem sido conhecido como um repressor de CREB actividade. a actividade de ligação ao ADN CREB é inibida pela sobreexpressão de GSK-3β e aumentou de lítio ou valproato de sódio que são inibidores de GSK-3 em células de neuroblastoma humano [42]. Além disso, a GSK-3β foi reportado para reprimir genes múltiplos CREB-alvo [43, 44]. Por outro lado, o estudo recente foi relatado que a GSK-3 promove a associação de CREB e seus co-activadores com MEIS1, uma caixa homeo (HOX) cofactor de ligação de ADN, para induzir a transcrição mediada por HOX e transformação em leucemias MLL [45]. Embora a consequência funcional da actividade de CREB por GSK-3 não é ainda clara, o nosso estudo sugere fortemente que CREB regula positivamente a GSK-3α, não GSK-3β, em células de cancro do pulmão, proporcionando assim um novo conceito de CREB GSK-3α-sinalização .

Embora a sobreexpressão de GSK-3β e a sua função como um promotor de tumor no cancro do pulmão tem sido demonstrada [39], o papel de GSK-3α no cancro do pulmão permanece elusiva. No nosso estudo, verificou-se que a GSK-3α é sobre-expresso em linhas celulares de cancro do pulmão em comparação com as células epiteliais brônquicas normais. Knockdown de GSK-3α em células de cancro de pulmão provoca a supressão da proliferação das células e também uma substancial indução da apoptose. Estes resultados indicam que a GSK-3α também desempenha um papel crucial no crescimento de células de cancro do pulmão.

O mecanismo de GSK-3α como um promotor de tumor no cancro do pulmão é virtualmente desconhecida. Foi demonstrado que a GSK-3α promove a função oncogénica KRAS através da actividade de IKK-NF-kB em cancro do pâncreas. Os autores sugerem a GSK-3α como um efector a jusante de chave KRAS mutantes para regular as vias de sinalização de NF-kB [30]. Curiosamente, o nosso estudo mostrou que o knockdown GSK-3α altamente suprimiu a viabilidade celular de linhas celulares de cancro de pulmão KRAS-peso, H1993 e H1437 células, em comparação com linhas celulares de cancro de pulmão KRAS-mutante, H1734 (G13C) e A549 células (G12S) . Embora não fica claro se KRAS está directamente relacionada com o papel da GSK-3α em células de câncer de pulmão, sugere-se que a função da GSK-3α na sinalização KRAS pode ser regulada de forma específica do tipo celular.

Para entender melhor o papel da GSK-3α e examinar os genes críticos afetadas pela GSK-3α no cancro do pulmão, inicialmente exibido um subconjunto de genes alvo NF-kB como

MYC

,

WT1

,

BIRC2

,

IL-9

,

HMOX1

, e

TERT

, que foram regulamentadas por um pan-GSK-3 inibidor AR -014.418 em câncer pancreático [30]. Nossos dados não foi totalmente coerente com o estudo anterior, mas observou-se uma diminuição significativa no nível de mRNA de TERT por knockdown GSK-3α e pouca diferença na outra NF-kB tem como alvo o analisado (EDN1, CYP19A1, HMOX1, WT1, e BIRC2) (S3 Fig). Além disso, descobrimos que a expressão de vários ciclinas que são conhecidos como alvo gens CREB foi marcadamente regulada negativamente por knockdown GSK-3α em várias linhas celulares de cancro de pulmão. Embora nosso estudo não identificou diretamente como ciclinas são regulados por GSK-3α, estes resultados suportam fortemente o papel novela de GSK-3α como um regulador activo na viabilidade das células de câncer de pulmão.

Teoricamente, a inibição da a GSK-3 pode conduzir a estabilização β-catenina e hiperactivação de Wnt /β-catenina sinalização [46-49]. No entanto, Doble et ai. mostraram que ambas as isoformas de GSK-3 têm de ser inibida para estabilização β-catenina. GSK-3α /β rato duplo knockout células-tronco embrionárias (ESC) exibido hyperactivated Wnt /β-catenina sinalização [50]. Em consonância com este relatório, há cada vez mais evidências de que a simples perda de ambos os GSK-3α ou GSK-3β isoforma não levar a uma estabilização β-catenina [28, 39]. Os nossos dados também demonstraram que a inibição de GSK-3α não induz o nível de β-catenina e AXIN2, uma proteína relacionada com Axin que desempenha um papel importante na sinalização Wnt via /β-catenina (Fig S4). Estes resultados confirmam que a GSK-3α pode funcionar independente da estabilização β-catenina no cancro do pulmão, mas uma análise mais aprofundada deve ser concluído para compreender plenamente o papel de GSK-3α e GSK-3β na estabilização -catenina β no câncer de pulmão.

As observações que a expressão GSK-3α desempenha um papel causal na sobrevivência de pacientes com câncer de pulmão, sugere GSK-3α poderia ser útil como biomarcador de prognóstico no câncer de pulmão, especialmente adenocarcinoma de pulmão. Novos estudos que examinam os mecanismos para a segmentação da via CREB-GSK-3α no cancro do pulmão será essencial para determinar e desenvolver os inibidores específicos GSK-3a. Em conclusão, propomos que a GSK-3α é um alvo terapêutico promissor como um novo gene alvo de CREB para diagnosticar tumores e desenvolver a terapia, com relevância para o cancro do pulmão.

Informações de Apoio

S1 Fig.