Abstract

terapia de ablação androgênica é o tratamento primário para câncer de próstata metastático. Contudo, 80-90% dos pacientes que recebem terapia de ablação de androgénios, em última análise desenvolver tumores recorrentes em 12-33 meses após o tratamento com um tempo de sobrevivência global mediana de 1-2 anos após recidiva. LNCaP é uma linha celular vulgarmente utilizada estabelecida a partir de um nó de linfa lesão metastática de adenocarcinoma prostático humano. Nós previamente estabelecido dois recidiva do receptor de androgénio (AR) rico em-andrógeno independente LNCaP sublinhas 104-R1 (androgénio empobrecido durante 12 meses) e 104-R2 células (androgénio empobrecido durante 24 meses) de AR-positiva LNCaP dependente de androgénios S-104 células. LNCaP 104-R1 e R2 de 104 imita os tumores recaíram hormônio-refratário AR-positivos em pacientes que recebem terapia de ablação do andrógeno. tratamento de andrógeno estimula a proliferação de células 104-S, mas provoca a inibição do crescimento e interrupção do ciclo celular G1 em células 104-R2 104-R1 e. Investigou-se a diferença entre o perfil de expressão de proteínas de LNCaP 104-S vs LNCaP 104-R1, R2-104, PC-3, e células DU-145, bem como examinou a sensibilidade destas células de cancro da próstata para diferentes quimioterápicos e pequena molécula inibidores. Em comparação com células 104-S, 104-R1 e 104-R2 células expressam níveis proteicos mais elevados de AR, PSA, C-Myc, Skp2, BCL-2, p53, p-MDM2 S166, Rb, e p-Rb S807 /811 . células A-104 104 e R1-R2 Express maior proporção de P-Akt S473 /Akt, p-EGFR /EGFR, e p-Src /Src, mas menor proporção de p-ERK /ERK do que as células 104-S. PC-3 e DU-145 células expressam c-myc, Skp2, Akt, Akt1, e fosfo-EGFR mas menos fosfo-Akt e ERK-fosfo mais elevados. A sobre-expressão de Skp2 aumento da resistência de células LNCaP de drogas de quimioterapia. O paclitaxel, androgénio, e inibidores de PI3K /Akt, EGFR, Src, ou a Bcl-2 parece ser as escolhas potenciais para tratamento de cancros da próstata avançado. O nosso estudo fornece lógica para o direccionamento de Akt, EGFR, Src, Bcl-2, e AR sinalização como um tratamento para tumores da próstata recidivaram AR-positivos após a terapia hormonal.

Citation: Lin H-P, Lin C-Y, Hsiao P-H, Wang H-D, Sheng Jiang S, Hsu J-H, et al. (2013) Diferença na expressão da proteína perfil e quimioterapia Drogas resposta dos diferentes estágios progressão da LNCaP sublinhas e outras células cancerosas humanas da próstata. PLoS ONE 8 (12): e82625. doi: 10.1371 /journal.pone.0082625

editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Itália |

Recebido: 16 de julho de 2013; Aceito: 25 de outubro de 2013; Publicação: 05 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Lin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações CS-101-PP-14 e CS-102-PP-14 (Institutos Nacionais de pesquisa em Saúde), NSC 99-2320-B-400-015-MY3 e NSC 101-2325-B-400-014 ( Conselho nacional de Ciência) e DOH101-TD-C-111-004 (Departamento de Saúde) a partir de Taiwan para CPC e DOH102-TD-M-111-102001 (Departamento de Saúde, Taiwan) para HJK. CYL é suportado por DOH101-TD-C-111-004. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. O autor correspondente Dr. Chih-Pin Chuu é membro do Conselho Editorial PLOS ONE, no entanto, podemos confirmar que isso não altera a nossa adesão a todas as políticas de PLoS ONE sobre a partilha de dados e materiais.

Introdução

de acordo com as últimas estatísticas, em 2008 (GLOBOCAN 2008 banco de dados, versão 1.2 ), o câncer de próstata é o segundo câncer mais freqüentemente diagnosticado de homens eo quinto câncer mais comum global no mundo. As estatísticas da American Cancer Society estima que 238,590 novos casos de câncer de próstata serão diagnosticados e cerca de 29.720 pessoas morrerão de mortes específicas do câncer de próstata nos Estados Unidos em 2013. A incidência de câncer de próstata está aumentando de forma constante em quase todos os países [1]. O câncer de próstata é diagnosticado em muito poucas pessoas com idade inferior a 50 anos. Aproximadamente 85% dos pacientes sendo diagnosticados mais de 65 anos [1]. A cirurgia é muitas vezes bem sucedida para o câncer de próstata confinado ao órgão. terapia de ablação do andrógeno, proposta pelo Dr. Charles B. Huggins, é o tratamento primário para câncer de próstata metastático. No entanto, a maioria dos doentes com cancro da próstata que recebem a terapia de ablação de androgénio acabará por desenvolver tumores recorrentes, resistente à castração dentro de 1-3 anos após o tratamento com um tempo de sobrevivência global mediana de 1-2 anos após recidiva [2,3]. Não há nenhuma terapia padrão efetivo para cânceres de próstata avançados recaída. A quimioterapia é geralmente aplicada para o tratamento de cancro da próstata metastático refractário a hormonas [4]. quimioterápicos comumente utilizados para cânceres de próstata incluem etoposídeo, paclitaxel, vinblastina, e mitoxantrona. Etoposide e mitoxantrona são inibidores da topoisomerase tipo II [4,5]. Vinblastina se liga a tubulina e inibe a montagem de microtúbulos [4]. Paclitaxel interrompe a montagem do fuso mitótico, segregação cromossômica e divisão celular. O paclitaxel também estabiliza o polímero de microtúbulos e protege-o de desmontagem [4]. tratamentos com medicamentos de quimioterapia resultar em diminuição da PSA, a resposta radiográfica, melhora da dor e melhora dos sintomas urinários em um sub-grupo de pacientes [4]. No entanto, estes fármacos apresentam pouco efeito em prolongar a sobrevivência [4]. efeitos secundários indesejáveis ​​destes agentes quimioterápicos incluem mortes tóxicos, acidentes vasculares cerebrais, trombose, neutropenia, edema, dispnéia, mal-estar e fadiga [4]. As terapias alternativas estão em necessidade.

LNCaP é uma linha celular vulgarmente utilizada estabelecida a partir de um nó de linfa lesão metastática de adenocarcinoma prostático humano [6]. células LNCaP expressam o receptor de androgénio (AR) e antigénio específico da próstata (PSA). Anteriormente, foi realizada cultura sensível ao andrógeno LNCaP células 104-S em condições de depleção de androgênio

in vitro

para imitar os pacientes que receberam terapia de ablação do andrógeno [7-9]. A maioria das células 104-S morreu depois de 3 meses. Uma pequena população de células chamado 104-R1 surgiu depois de 10 meses. Estas células proliferam regularmente na ausência de androgénio [7-9]. Dezoito a 20 meses após a depleção de androgénio, células 104-R1 deu origem a uma população de crescimento mais rápido das células chamadas células 104-R2 [7-9]. Durante a transição de células 104-S-R2 para 104 células 104-R1 e, a expressão de mRNA, a abundância de proteínas, e aumentar a actividade transcricional de AR várias dobras [7-14]. Proliferação de células 104-R2-R1 e 104 é independente de androgénios, mas é suprimida por concentrações fisiológicas de androgénio [7-9,11-14]. tratamento de andrógeno suprime c-Myc e Skp2, assim, provoca a parada do ciclo celular G1 em células 104-R2 104-R1 e. Nossos LNCaP próstata modelo progressão do cancro imita as situações clínicas em que os tumores de próstata AR-positivos se repetem após a privação de andrógeno [13,15,16]. PC-3 e DU-145 células pertencem à NCI60 e foram as células de cancro da próstata AR-negativo estabelecidas a partir de adenocarcinoma prostático metastático humano para o osso [17], e cérebro [18], respectivamente. Nós portanto, utilizado o modelo de LNCaP progressão, PC-3, e células DU-145 neste estudo para caracterizar a diferença de o perfil de expressão de proteínas de células de cancro da próstata entre andrógeno-dependente e independente de androgénios. Foi examinado o perfil de 33 diferentes proteínas envolvidas na regulação do ciclo celular, sobrevivência celular, a sinalização de Akt, e receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) de sinalização em 104-S, 104-R 1, 104-R2, PC-3 e DU-145 células. Também em relação à diferença de sensibilidade destas células de cancro da próstata para tratamento com vários fármacos de quimioterapia e inibidores de moléculas pequenas para determinar qual o fármaco ou inibidor é mais eficaz para suprimir a proliferação de células de cancro da próstata avançado. As nossas observações sugerem que a AKT, EGFR, Src, Bcl-2, e AR vias de sinalização são potenciais alvos terapêuticos para o cancro da próstata resistente à castração AR-positiva.

Materiais e Métodos

Cultura celular

sublinhas celulares de cancro da próstata LNCaP (104-S, 104-R1, e 104-R2 células) e PC-3 foram presentes de Dr. Shutsung Liao (The University of Chicago, IL, EUA). LNCaP 104-S, 104-R1, R2-104 e as células foram geradas a partir do clone de LNCaP FGC (ATCC CRL-1740). Estes sublinhas LNCaP e células PC-3 foram descritos em publicações anteriores [7-12,14,19-24]. células DU-145 foram comprados da coleção Bioresource e Centro de Pesquisa (cidade Hsinchu, Taiwan). Estas linhas de células foram subcultivadas e mantidas como descrito anteriormente [7-12,14,19-24]. R1881 (17β-hidroxi-17α-metilestra-4,9,11-trien-3-ona) foi adquirido a partir de Sigma-Aldrich (Sigma, St. Louis, MO, EUA).

Chemicals

inibidor de EGFR gefitinib (Iressa, ZD-1839) e inibidor de Src Saracatinib (AZD0530) foram adquiridos a Selleckchem (Houston, TX, EUA). inibidor de Bcl-2 ABT 737 (CAS 852808-04-9) foi adquirido de Santa Cruz (Santa Cruz, CA, E.U.A.). Outros compostos foram adquiridos de Sigma.

Ensaio de Proliferação Celular

número relativo de células foi analisada através da medição do conteúdo de ADN de lisados ​​de células com o corante fluorescente Hoechst 33258 (Sigma), como descrito anteriormente [10,14 , 19,20,22-25]. A média e o desvio padrão representou a média de octuplicate (8 cavidades) de uma experiência representativa.

Análise de citometria de fluxo

As células foram semeadas a uma densidade de 5 x 10

5 as células em placas de 10 cm em 10 mL de meio durante 24 horas. Após 96 horas de cultura na presença de várias concentrações de androgénio, as células foram removidas com tripsina e fixadas em etanol a 70% em PBS durante a noite a -20 ° C. As células fixadas foram lavadas com PBS, tratadas com 0,1 mg /ml de RNase A em PBS durante 30 min, e, em seguida, suspenso em iodeto de propídio /ml 50 ug em PBS. perfis do ciclo celular e distribuição foram determinados por análise de citometria de fluxo de células utilizando um citómetro de fluxo BD FACScan (BD Biosciences, San Jose, CA, E.U.A.). distribuição do ciclo celular foi analisada utilizando software ModFit LT (Verity Software House, Topsham, ME, EUA) como descrito [8,9,14,20,22,23,25].

Real-Time quantitativa em Cadeia da Polimerase reacção

O ARN foi isolado e os ARNm específicos foram quantificados como descrito [10-12,19,21,26]. As sequências dos iniciadores e sondas para o receptor de androgénio (AR) e da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) foram descritos anteriormente [9,12,26]. As sequências dos iniciadores e das sondas utilizadas para a quantificação do PSA foram descritos por Gelmini et al [27]. Todos os níveis de transcritos foram normalizados para níveis de GAPDH em cada amostra.

Western Blotting Análise

Células amostras foram submetidas a lise em tampão de lise de SDS (240 mM de Tris-acetato, 1% de SDS, 1% de glicerol, 5 mM de EDTA pH 8,0, 0,1 mM de ditiotreitol) contendo os inibidores de protease 1 mM ácido 4- (2-aminoetil) fluoreto de benzenossulfonilo (AEBSF), 0,8 uM de aprotinina, 40 μMbestatin, 14 fiM de E-64, 20 � leupeptina, 15 um Pepstatina a (Sigma -Aldrich, P8340) e a inibidores de fosfatase cantaridina, bromotetramisole e microcistina LR (Sigma-Aldrich, P2850). As proteínas foram separadas em geles de 8-12% de SDS-PAGE e os níveis de expressão das proteínas foram determinados por Western blotting utilizando os seguintes anticorpos: Akt2, β-actina e GAPDH eram de Novus (Littleton, CO, E.U.A.). Akt total, fosfo-Akt Ser473, fosfo-Akt Thr308, phodpho-p42 /44 MAPK Thr202 /Tyr204, EGFR, p-MDM2, p53, Src, fosfo-Src Tyr527, Rb, e p-Rb Ser807 /811 eram de celular sinalização (Danvers, MA, EUA). anticorpos gordos sintase ácido (FAS), AR e de c-myc foram adquiridos a Epitomics (Burlingame, CA, E.U.A.). Skp2, p21, p27 e os anticorpos foram adquiridos a partir de Santa Cruz (Santa Cruz, CA, E.U.A.). PSA foi da Dako (Elostrup, Dinamarca). Bcl-2 foi a partir de BD (BD Biosciences, San Jose, CA, E.U.A.). Bad, MDM2, Akt1, p42 /44 MAPK, fosfo-EGFR Tyr1173, fosfo-EGFR Tyr1148, fosfo-EGFR Tyr1086, fosfo-EGFR Tyr1069, fosfo-EGFR Tyr1045, e fosfo-EGFR Tyr 845 eram da Millipore (Billerica, MA, EUA). α-tubulina foi da Sigma. β-actina, α-tubulina, e GAPDH foram utilizados como controlo de carga. Peroxidase de rábano conjugada com anti-coelho e anticorpos secundários anti-IgG de ratinho eram de Santa Cruz. O sinal de anticorpos secundários marcados com peroxidase de rábano foi detectado por quimioluminescência melhorada reacção (kit de detecção ECL Western Blotting) (PerkinElmer, Waltham, MA, E.U.A.). GAPDH, α-tubulina, e β-actina foram utilizados como controlos de carga. Intensidade das bandas de diferentes proteínas foi quantificada com EPSON TX130 stylus usando UN-SCAN-IT gel 6,1 software.

O sequenciamento do ligando AR domínio de ligação em sublinhas LNCaP

O RNA total foi isolado com RNeasy Mini kit (Qiagen, Venlo, Hilden, Alemanha). O ADNc foi sintetizado a partir de ARN total utilizando RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Waltham, Massachusetts, E.U.A.). A sequência de codificação para o domínio de ligação ao ligando de AR foi amplificado com o kit de KOD-plus (TOYOBO, Osaka, Japão), utilizando o par de iniciadores 5′-ctgaaactacaggaggaagg-3 ‘(directo) e 5′-tgcagaggagtagtgcagag-3’ (inverso) . A amplificação foi realizada utilizando um protocolo térmica touch-down: 8 ciclos de 94 ° C durante 15 s, 55 a 47 ° C durante 30 s (diminuição da temperatura de hibridação 1 ° C por ciclo), 68 ° C durante 1 min, seguido de 35 ciclos de 94 ° C durante 15s, 47 ° C durante 30s, 68 ° C durante 1 min, e um passo de extensão final a 68 ° C durante 3 min. Os produtos de PCR foram purificados em gel (FAVORGEN, Ping-Tung, Taiwan) e sequenciação directa num sequenciador de DNA. Os dados de sequenciação foi depositado em GenBank (apresentação ID: 1664456; BankIt1664456 SEQ1 KF720403; BankIt1664456 Seq2 KF720404; BankIt1664456 Seq3 KF720405).

Análise de Dados

Os dados são apresentados como a média +/- SD de pelo menos três experiências ou são representativas de experiências repetidas pelo menos três vezes. teste t de Student (de duas caudas, não emparelhado) foi utilizado para avaliar a significância estatística dos resultados obtidos em experiências de ensaio de proliferação. Um add-in ED50V10 programa Excel foi utilizado para o cálculo da concentração inibitória metade máxima (IC

50).

Resultados

resposta androgênica de sublinhas LNCaP

A principal diferença entre 104-R2 células com suas células 104-S parentais LNCaP 104-R1 ou é a sua resposta ao tratamento de andrógeno. Tratar LNCaP células 104-S com a concentração fisiológica de androgénio (0,1, 1, 10 nM R1881) [28] estimulou a proliferação celular. No entanto, o tratamento de androgénio suprimiu a proliferação de 104-R1 e R2 de 104 células (Figura 1A). Na ausência de androgénio, a taxa de crescimento de 104 células 104-R2-R1 e era 1,8-2,3 dobras maior do que a de 104-S de células (Figura 1A). tratamento de androgénio (0,1, 10 nM R1881) aumento da população de células em fase S e diminuição da população de células em fase G1-S em 104 células. No entanto, diminuiu androgénio população de células em fase S e causou paragem do ciclo celular G1 em ambos R2-104 células (Figura 1B) e 104-R1. O IC

50 de R1881 calculado para suprimir 104-R2 células 104-R1 e foi de 14,9 e 13,2 nM, respectivamente. PC-3 e DU-145 células não expressam AR e não respondem ao tratamento de androgénio, que, assim, não incluem PC-3 e as células DU-145 nestas experiências.

Proliferação de LNCaP 104-S, 104-R1, e 104-R2 células crescendo em 10% de CS-FBS DMEM mais 0, 0,1, 1, ou 10 sintéticos nM andrógeno R1881 durante 96 horas foi determinada por proliferação de 96 poços medição do teor de DNA total por poço usando Hoechst 33258 fluorescência . os números relativos de células foram normalizados com a das células 104-S sem tratamento R1881. asteriscos triplos (***) representa o número de células é uma diferença estatisticamente significativa (P 0,001) em comparação com o mesmo tipo de célula sem tratamento R1881. Colunas representam a média de 24 repetições; barras representam o desvio padrão. (B) distribuição do ciclo celular de LNCaP 104-S, 104-R1, e R2 células 104-tratados com 0, 0,1, e 10 nM de R1881 durante 96 horas foi determinada por citometria de fluxo. Asterisco (*), dois asteriscos (**), e os asteriscos triplos (***) indicam diferença estatisticamente significativa da

P Art 0,05,

P Art 0,01, e

P Art 0,001, respectivamente, em comparação com o mesmo tipo de células sem tratamento R1881.

A expressão de AR e PSA mRNA em sublinhas LNCaP

Assim como nossas observações anteriores [7-9,14], 104-R1 e 104-R2 células expressam maior mRNA AR do que As células 104-S, quando andrógeno está ausente (Figura 2A). Além disso, observou-se que 0,1 nM R1881 aumento da expressão de mRNA AR em todos os 104-S, 104-R1, e 104-R2 células, enquanto 10 nM R1881 só aumentou mRNA AR em 104-S e 104-R1 células (Figura 2A ). actividade transcricional do AR em 104-S, 104-R1, e células 104-R2 foi comparado ao examinar a indução da expressão de ARNm androgênica do antigénio específico da próstata do gene alvo AR (PSA). Os níveis de ARNm de PSA aumentaram com a dose-dependente tratamento R1881, mas foram muito mais elevados em células 104-R2 do que aqueles em 104-S de células (Figura 2B) 104-R 1 e. O tratamento de células 104-S com 0,1 nM R1881 causou um aumento de 2,3 vezes de ARNm de PSA. No entanto, R1881 em 0.1 nM causou um aumento de aproximadamente 6,3 e 9,0 vezes de ARNm de PSA em 104-R1 e células 104-R2, respectivamente. O tratamento com 10 nM R1881 causou um aumento de 6,8 vezes de ARNm de PSA em células 104-S, mas causou um aumento de aproximadamente 22,1 e 32,0 vezes de ARNm de PSA em 104 células-R2, respectivamente (Figura 2B) 104-R 1 e. Quando R1881 estava ausente, o nível de ARNm de PSA foi mais elevada em células 104-R2 do que em células 104-S-104 e R1. PC-3 e DU-145 células não expressam AR e não respondem ao tratamento de androgénio, que, assim, não incluem PC-3 e as células DU-145 nestas experiências.

A expressão de AR (A) e PSA (B) ARNm foi detectada com quantitativa PCR em tempo real em 104-S, 104-R1, e R2 células 104-tratados com 0, 0,1, e 10 nM de R1881 durante 96 horas. Asterisco (*), dois asteriscos (**), e os asteriscos triplos (***) indicam diferença estatisticamente significativa da

P Art 0,05,

P Art 0,01, e

P Art 0,001, respectivamente, em comparação com o mesmo tipo de células sem tratamento R1881. sinal de número (#) e (###) indicam diferença estatisticamente significativa da

P Art 0,05 e

P Art 0,001, respectivamente, para as células 104-R2-R1 ou 104, em comparação com células 104-S, na ausência de R1881.

domínio de ligação ao ligando de AR em sublinhas LNCaP

células LNCaP expressam uma AR mutante (T877A) que apresenta especificidade de ligação do ligando relaxado [29,30]. Como 104 células-R2-R1 e 104 apresentaram maior resposta androgénica (Figura 2B), determinou-se se há mutações adicionais em outras do que 104 T877A-R2 células 104-R1 e. A sequenciação de ADNc a partir de células LNCaP 104-S, 104-R1, R2-104 e células (Figura 3A, 3B) sugeriu que todos os três sub-linhas LNCaP conter a mutação T877A em AR. Não houve mutação adicional em células 104-R2-R1 e 104, em comparação com as suas células 104-S parentais. A maior resposta androgênica pode ser devido ao maior nível de expressão AR em 104-R2 células (Figura 2B) 104-R1 e.

Sequência de LBD da AR em 104-S, 104-R1, e 104-R2 células com base no iniciador de sentido directo (A) e o iniciador inverso (B) foi mostrado. seta vermelha indica o T877A ponto de mutação no LBD da AR em células LNCaP.

Profiling de proteínas do ciclo celular regulação em sublinhas LNCaP, PC-3 e DU-145 células

Protein nível de AR expressão é superior em LNCaP 104-R1 e R2-104, em comparação com células LNCaP 104-S, na ausência de androgénio. O tratamento tanto com 0,1 e 10 nM de androgénio sintético R1881 aumentou ligeiramente em todas as proteínas AR sublinhas LNCaP (Figura 4). DU-145 e células PC-3 não expressam AR (Figura 4). Todos os três sublinhas LNCaP mas não DU-145 e células PC-3 expressam proteínas de PSA. tratamento de andrógeno induzida produção de proteína PSA. nível de proteína de PSA era muito mais elevada em células 104-R2-R1 104 e 104, em comparação com células-S quando tratadas com 10 nM R1881. O tratamento com 0,1 nM R1881 expressão PSA única induzida em 104-R2 células 104-R1 e mas não células 104-S. A dobra indução da proteína de PSA por meio de tratamento de androgénio foi semelhante à dobra da indução de ARNm de PSA (Figura 2B, Figura 4).

A expressão de proteína de AR, PSA, c-Myc, Skp2, p21

Cip1, p27

KIP1, Bcl-2, Bad, p53, MDM2, fosfo-MDM2 Ser166, Rb, fosfo- Rb Ser807 /811, GAPDH, α-tubulina, e β-actina em LNCaP 104-S, 104-R1, e R2 células 104-tratados com 0, 0,1, ou 10 nM R1881 durante 96 horas foram testados por transferência de Western. GAPDH, α-tubulina, e β-actina foram usados ​​como controlo de carga. As experiências foram repetidas três vezes. Estas proteínas também foram examinados em células PC-3 e DU-145, na ausência de androgénio. Os números representam quantificação das bandas de proteína individual quantificados por ImageJ e UN-SCAN-IT gel 6,1 software.

Quando andrógeno está ausente, as células 104-R1 e R2 de 104 expressaram níveis mais elevados de c-Myc , Skp2, BCL-2, p53, fosfo-MDM2 Ser166, Rb, Rb e fosfo-Ser807 /811, mas menos p27

proteínas Kip, em comparação com 104-S de células. tratamento de androgénio aumento da expressão de proteínas de Skp2, c-Myc, Rb, Rb e fosfo-Ser 807/811, e p53 em células 104-S, mas diminuiu a expressão destas proteínas em células 104-R2-R1 e 104. Expressão de P27

Kip foi reduzida em andrógeno em 104-S células, mas foi induzida em células 104-R2 104-R1 e. tratamento de andrógeno diminuiu P21

Cip abundância em todas as sublinhas LNCaP. BCL-2 de expressão de proteína em células 104-R2-R1 e 104 foi alta mas a proteína BCL-2 era apenas detectável em células 104-S. tratamento de andrógeno diminuiu BCL-2 em 104-R2 células 104-R1 e. MDM2 em 104-S células foi um ligeiro aumento de andrógeno, mas não foi afetada pelo andrógeno em células 104-R2 104-R1 e. a expressão da proteína BAD não foi afetada pelo tratamento de andrógeno em sublinhas 104-R2 LNCaP (Figura 4) 104-R1 e. 0,1 nM R1881 diminuiu ligeiramente proteína BAD em células 104-S. DU-145 e PC-3 de células expressaram mais elevada de c-Myc e Skp2 mas inferior p27

Kip, em comparação com 104-S células quando androgénio estava ausente. Quando comparado com o 104-S, células DU-145 expressou maior p53 e menor proteína BAD. PC-3 células expressaram mais elevada Bcl-2, fosfo-MDM2 S166, Rb, Rb e fosfo-S807 /811 mas inferior BAD, P53, e MDM2 em comparação com células 104-S.

Profiling de Akt e as proteínas de EGFR em sublinhas de sinalização LNCaP, PC-3, e células DU-145

Akt e receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) de sinalização desempenha papéis importantes que regulam a proliferação e progressão do cancro da próstata. Em comparação com 104-S de células, 104-R1 e 104-R2 células expressaram níveis mais elevados de proteína de Akt2 e fosforilação de tirosinas em EGFR (Tyr 1173 Tyr 1148, Tyr 1069, Tyr 1045, e Tyr 845) mas expressaram níveis mais baixos de proteína de Akt, Akt1, fosfo-EGFR Tyr 1086, fosfo-Akt Thr308, fosfo-p42 /44 MAPK Thr202 /Tyr 204, Src, fosfo-Src Tyr527, e EGFR (Figura 5). tratamento de androgénio aumento da expressão de proteínas de Akt2 em todos os três sub-linhas, bem como a fosfo-EGFR Tyr 1148, 1069 Tyr, Tyr 1045, 845 e Tir em 104-S células. Andrógeno diminuiu fosfo-Akt Ser473, fosfo-Akt Thr308, e fosfo-p42 /44 MAPK Thr202 /Tyr 204 em 104-S, mas não em células 104-R2 células 104-R1 e. Andrógeno aumentou ligeiramente a fosforilação de Akt (Thr308 e Ser473) em 104 células-R2-R1 e 104. Expressão das proteínas Akt total, Akt1, p42 /44 MAPK e EGFR não foi afetada pelo tratamento de andrógeno. Em comparação com células 104-S, DU-145 e PC-3 de células expressa um nível mais elevado de Akt e Akt1 e semelhante de p42 /44 MAPK. No entanto, o nível de proteína de fosfo-Akt T308 e S473, bem como fosfo-p42 /44 MAPK foi muito baixa em células DU-145 e células PC-3. Apesar de células PC-3 expresso menos proteínas Src, fosfo-Src Tyr527 foi relativamente elevada em células PC-3, em comparação com 104-S de células. nível de proteína de fosfo-EGFR Tyr1045 e Tyr845 foi maior em DU-145 e PC-3, em comparação com células 104-S.

A expressão de proteínas de Akt total, Akt1, Akt2, fosfo-Akt Ser473, fosfo- Akt Thr308, p42 /44 MAPK, fosfo-p42 /44 MAPK Thr202 /Tyr204, EGFR, e sítio de fosforilação diferente de tirosina (Tyr1173, Tyr1148, Tyr1086, Tyr1069, Tyr1045, e Tyr845) em LNCaP 104-S, 104-R1, e células 104-R2 tratados com 0, 0,1, ou 10 nM R1881 durante 96 horas foram testados por transferência de Western. Mesmo GAPDH, α-tubulina, e β-actina, como mostrado na Figura 3 foram usados ​​como controlo de carga. Estas proteínas também foram examinados em células PC-3 e DU-145, na ausência de androgénio. As experiências foram repetidas três vezes. Os números representam a quantificação das bandas de proteína quantificadas por indivíduo ImageJ.

Notamos uma descoberta interessante quando se normalizou o fosfo-proteínas de Akt, EGFR, e Src por sua abundância de proteína total. As células 104-R1 e R2-104 expressa relativamente elevada proporção de fosfo-Akt /Akt, fosfo-Src /Src, fosfo-EGFR /EGFR, mas menor proporção de fosfo-ERK /ERK (Tabela 1). Sob condições de crescimento (0,1 nM R1881 em 104-S; 0 nM R1881 para 104-R1 e células 104-R2), proporção de fosfo-Akt /Akt, fosfo-Src /Src, e fosfo-EGFR /EGFR em 104-R1 e R2-104 células foi 1,6-2 vezes, 2,2-3,9 e 1,7-10 vezes maior. A proporção de p-Akt /Akt não foi afectado muito por androgénio em todos os três sub-linhas LNCaP. Andrógeno diminuiu proporção de p-Src /Src em 104-R2 células 104-R1 e mas não células 104-S. Andrógeno aumentou ligeiramente proporção de p-EGFR /EGFR em células 104-S. Andrógeno diminuiu proporção de p-EGFR /EGFR em Tyr1148, Tyr1069, e Tyr 1045 em 104 e R1-Tyr1069 e Tyr845 em 104 células-R2. Andrógeno aumentou a proporção de fosfo-EGFR Tyr1173 /EGFR e fosfo-EGFR Tyr1045 /EGFR em células 104-R2. Em comparação com 104-S, DU-145 e PC-3 rácio células expressaram muito baixo de fosfo-Akt /Akt e ERK-fosfo rácio /ERK mas maior fosfo-EGFR Tyr1045 /EGFR e fosfo-EGFR Tyr845 /EGFR. As células PC-3 também expresso relativamente baixa proporção de fosfo-EGFR /EGFR de Tyr1173, Tyr1148, Tyr1086, Tyr 1069 mas muito alta proporção de fosfo-Src /Src, em comparação com células 104-S.

LNCaP 104-S

LNCaP 104-R1

LNCaP104-R2

DU-145

PC-3

R1881 (nM)

0

0.1

10

0

0.1

10

0

0.1

10

0

0

AktS47310.70.71.41.51.21.11.21.30.00.1T30810.80.70.91.10.90.60.71.00.00.0SrcY52710.91.13.52.32.32.02.01.31.05.0EGFRY117311.41.92.72.53.014.025.025.01.30.6Y114811.71.96.04.04.516.016.014.01.10.5Y108611.01.01.01.01.03.03.02.00.90.5Y106911.41.38.35.05.019.014.010.00.70.5Y104513.52.99.79.07.326.030.033.04.62.0Y84511.51.44.74.04.517.013.09.02.31.8ERK1/2T202/Y20410.70.50.50.50.60.30.10.10.40.0Table 1. Proporção de fosfo-Akt /Akt, fosfo-Src /Src, fosfo-EGFR /EGFR, e de fosfo-ERK /ERK para LNCaP 104-S, 104-R1, R2-104, PC-3 e DU-145 células.

Quantificação de proteína a partir da Figura 4 e na Figura 5 foi utilizado para o cálculo da razão. Os valores da Tabela 2 indicam a razão de fosfo-proteína através abundância de proteína total. CSV Baixar CSV

Padrão de perfil de proteínas expressão em três sublinhas LNCaP, DU-145 e PC-3

Perfil de mudanças de proteína em tratamento de 0, 0,1, e 10 nM R1881 em 104-S, 104-R1, e 104-R2 células foi resumido no mapa de calor na Figura 6. é interessante notar que o padrão de expressão de proteína de 104-S células tratadas com 10 nM R1881 era mais semelhante ao 104-R1 e 104-R2 células tratadas com androgénio (0,1 e 10 nM R1881). O padrão de expressão de proteína de 104-S células sem tratamento andrógeno era muito diferente de todas as outras amostras a ser testado (Figura 6).

Protein perfil de expressão de LNCaP 104-S, 104-R1, e 104-R2 células tratadas com 0, 0,1, ou 10 nM R1881 em 96 horas, bem como em DU-145 e células na ausência de androgénio ensaiadas na Figura 3 e Figura 4 PC-3 foi combinada e gerado em diagramas mapa dois de calor utilizando o cluster 3,0 TreeView (https://genome-www.standford.edu). cor vermelha e verde representa o aumento e diminuição da abundância de proteína, respectivamente. cor mais clara indica maior mudança de abundância de proteínas.

Sensibilidade de sublinhas LNCaP, DU-145, e as células à quimioterapia

A seguir, determinaram a resposta de crescimento de LNCaP 104-S, 104-R1 PC-3, 104- R2, DU-145 e PC-3 células para quatro medicamentos de quimioterapia geralmente usados ​​de cancros da próstata. A IC

50 de paclitaxel para todos os três sub-linhas LNCaP foi semelhante (Figura 7 e Figura 8). A sensibilidade de 104-R2 células para etoposido, mitoxantrona, vinblastina e 104-R1 e, era semelhante. 104-R2-R1 células 104 e foram mais resistentes ao tratamento de etoposido, mitoxantrona, vinblastina e em comparação com 104-S de células (Tabela 2). DU-145 e células PC-3 foram mais resistentes a todas as quatro drogas de quimioterapia, em comparação com 104-S de células.

LNCaP 104-S, 104-R1, R2-104, PC-3, DU-145 e as células foram tratadas com concentrações crescentes de etoposido (A) ou o paclitaxel (B) durante 72 horas. número relativo de células LNCaP de células foi determinado pelo ensaio de proliferação de 96 poços corante Hoechst 33258 à base de tal como descrito em Materiais e Métodos. Os números de células foram normalizados para controlar (sulfóxido de dimetilo) de cada linha de células. asteriscos triplos (***) representam diferença estatisticamente significativa

p

. 0,001 entre o grupo tratado eo grupo controle (sem tratamento)

LNCaP 104-S, 104- R1, R2-104, PC-3, e células de DU-145 foram tratadas com concentrações crescentes de mitoxantrona (a) ou vinblastina (B) durante 72 horas. número relativo de células LNCaP de células foi determinado pelo ensaio de proliferação de 96 poços corante Hoechst 33258 à base de tal como descrito em Materiais e Métodos. Os números de células foram normalizados para controlar (sulfóxido de dimetilo) de cada linha de células. asteriscos triplos (***) representam diferença estatisticamente significativa

p

. 0,001 entre o grupo tratado eo grupo controle

LNCaP 104-S

LNCaP 104-R1

LNCaP 104-R2

PC-3

DU-145

etoposide12.352.002.492.76paclitaxel11.181.072.923.43mitoxantrone13.523.383.382.28vinblastine11.321.453.231.83AG147811.841.410.501.69Gefitinib11.090.991.791.32LY29400211.491.332.953.73Saracatinib11.110.901.870.77BCl-2 inhibitor11.151.030.571.12Table 2. Rácio de IC

50 para LNCaP 104-R1, R2-104, PC-3, DU-145 e células em comparação com as células 104-S.

IC

50 a partir de Figuras 7-10 foi utilizado para o cálculo do rácio. IC

50 de 104-S células para todos os inibidores diferentes foi definido como 1 para comparação. CSV Baixar CSV

sensibilidade do sublinhas LNCaP, DU-145 e PC-3 células para quinase inibidores e Bcl-2 inibidor

Em comparação com células LNCaP 104-S, 104-R1 e 104-R2 células eram mais resistentes ao tratamento de inibidor de PI3K LY294002 e inibidor de EGFR AG1478 (Figura 9, Figura 10, Tabela 2). Sensibilidade de células de 104 104-R2-R1 e de inibidor de EGFR gefitinib e Bcl-2 inibidor ABT 737 foi semelhante ao do 104-S células. 104-R2 células foram ligeiramente mais sensíveis ao tratamento com inibidor de Src Saracatinib. Em comparação com células 104-S, PC-3 e DU-145 células foram mais resistentes à maioria das drogas a ser testado. No entanto, células PC-3 foram mais sensíveis ao tratamento de AG1478 ou ABT 737, enquanto DU-145 células foram mais sensíveis ao Saracatinib.

LNCaP 104-S, 104-R1, 104-R2, PC-3, e células de DU-145 foram tratadas com concentrações crescentes de AG1478 (a) ou Gefitinib (B) durante 72 horas. número relativo de células LNCaP de células foi determinado pelo ensaio de proliferação de 96 poços corante Hoechst 33258 à base de tal como descrito em Materiais e Métodos. Os números de células foram normalizados para controlar (sulfóxido de dimetilo) de cada linha de células. asteriscos triplos (***) representam diferença estatisticamente significativa

p Art 0,001 entre o grupo tratado eo grupo controle.

LNCaP 104-S, 104-R1, R2-104, as células PC-3 e DU-145 foram tratadas com concentrações crescentes de LY294002 (A), Saracatinib (B), ou ABT 737 (C) durante 72 horas. número relativo de células LNCaP de células foi determinado pelo ensaio de proliferação de 96 poços corante Hoechst 33258 à base de tal como descrito em Materiais e Métodos. Os números de células foram normalizados para controlar (sulfóxido de dimetilo) de cada linha de células.