Abstract

Cancro população lado da haste-como células (SP) foram identificados em muitos tumores sólidos; No entanto, a maioria destas investigações são realizadas utilizando linhas celulares de cancro estabelecidas. As células cancerosas em tecido tumoral contendo fibroblastos e muitos outros tipos de células são muito mais complexas do que qualquer linha celular de cancro. Embora as células SP foram identificados na linha de células de carcinoma de células escamosas da laringe (LSCC) Hep-2 em nosso estudo piloto, não se sabe se o tecido LSCC contém células SP. Neste estudo, as células LSCC (LSCCs) foram cultivadas primária e purificada a partir de um espécime LSCC cirurgicamente ressecado derivado de um neoplasma epiglótico bem diferenciado de um macho chinês. Isto foi seguido pela verificação das características específicas do epitélio, tais como biomarcadores e ultra-estrutura. Uma subpopulação distinta SP (4,45 ± 1,07%) foi isolado por análise Hoechst 33342 efluxo de LSCCs cultivadas usando um citómetro de fluxo. células-tronco do câncer (CSC) -associated ensaios, incluindo a expressão de auto-renovação e genes marcadores CSC, proliferação, diferenciação, formação esferóide, resistência à quimioterapia, e foram então conduzidos tumorigenicidade entre LSCCs não-SP (NSP) SP e.

In vitro

e

In vivo

ensaios revelaram que as células SP manifesta expressão preferencial de auto-renovação e genes marcadores CSC, maior capacidade de proliferação, diferenciação e formação esferóide; resistência aumentada à quimioterapia; e maior tumorigenicidade de xenoenxerto em ratinhos imunodeficientes em comparação com células de PNS. Estes resultados sugerem que as LSCCs cultivadas e purificadas primários contêm células-tronco SP-like de câncer, o que pode servir como um modelo valioso para a investigação CSC em LSCC

Citation:. Wu CP, Zhou L, Xie M, Du HD , Tian J, S Sun, et ai. (2013) Identificação de Células Estaminais-Like Cancer Side Populacionais em Purificada Primária Cultivadas laringe humana Carcinoma de células escamosas Epitélio. PLoS ONE 8 (6): e65750. doi: 10.1371 /journal.pone.0065750

editor: Jian Cao, Stony Brook University, Estados Unidos da América

Recebido: 26 de novembro de 2012; Aceito: 29 de abril de 2013; Publicação: 11 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi parcialmente financiado pela National Science Foundation Natural da China (30872855) eo Shanghai Ciência e Tecnologia Fundação da China (12JC1402101). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro haste semelhante a população lado células (SP) foram identificados com sucesso numa vasta gama de tumores sólidos, incluindo cancro da mama [1], [2], o carcinoma hepatocelular [3] – [7], do pulmão câncer [8], [9], câncer gastrointestinal [10] – [12], o câncer de próstata [13], câncer de vesícula biliar [14], câncer de ovário [15], o cancro endometrial [16], câncer pancreático [17], [ ,,,0],18], câncer urológico [19], [20], glioblastoma [21], o melanoma [22], osteossarcoma [23], [24], neoplasias mesenquimais [25], cancro da nasofaringe [26], cancro oral [27], [28], e outros cânceres de cabeça e pescoço [29], [30]. No entanto, a maioria destas pesquisas foram realizadas utilizando linhas celulares de cancro estabelecidas. Embora linhas celulares de cancro estabelecidas são ferramentas úteis na pesquisa básica e pré-clínico do câncer, eles são imita simplificadas de complexos e heterogêneos, tecidos cancerosos sólidos. As células cancerosas em fibroblastos de tecido contendo tumor primário, as células do estroma, os linfócitos e outros tipos de células são muito mais complexas do que as células de qualquer linha celular de cancro. Portanto, as células cancerosas cultivadas e purificadas primários decorrentes dos tecidos cancerosos pode ser uma melhor representação do tumor original.

carcinoma de células escamosas da laringe (LSCC) é uma das neoplasias mais comuns da região de cabeça e pescoço. Nos últimos anos, os pacientes LSCC em estágio avançado ainda tendem a sucumbir à recidiva loco-regional e metástases à distância. as células-tronco SP-cancro como desempenham um papel crítico na iniciação do tumor, a manutenção, a progressão e a recaída [31] – [33]. Portanto, a investigação em curso sobre as células SP para desenvolver novos agentes que têm como alvo as células-tronco cancerosas (CSCs) é urgentemente necessário.

nosso estudo piloto câncer identificaram células-tronco SP-como na linha celular LSCC Hep-2 [30] . No entanto, desconhece-se se o tumor sólido LSCC contém células SP. Neste estudo, pela primeira vez, foi utilizado Hoechst análise 33342 efluxo para identificar as células SP diretamente de, células purificadas primárias cultivadas bem diferenciados LSCC (LSCCs) derivadas de uma laringectomia de sofrimento paciente do sexo masculino chinês para carcinoma epiglottic. Descobrimos que os LSCCs de cultura principal também continha uma subpopulação SP distinta, o que representou 4,45 ± 1,07% do total de células cancerosas. Além disso, ao

in vitro

e

in vivo

ensaios, documentamos que as células SP abrigava mais de câncer propriedades estaminais-como em comparação com células não-SP (NSP).

Materiais e Métodos

h3> Declaração

espécime de tumor foi obtido com a aprovação do Comitê de Ética do olho, ouvido, nariz e garganta Hospital, Universidade Fudan, de Xangai, China. consentimento informado assinado foi obtido a partir do paciente. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Cuidados Shanghai Medical Experimental Animal. Todos cirurgia foi realizada sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Informações do Paciente

O paciente era um não tratada masculino chinês de 68 anos de idade, que foram submetidos à laringectomia de células escamosas carcinoma decorrente da epiglote, Estágio IV, T4aN2M0, com base no 6º União edição for International Cancer Control (UICC) sistema de classificação TNM. Notavelmente, ele não tem um histórico familiar de câncer de cabeça e pescoço, mas tinha uma história de 40 anos de tabagismo e história de 30 anos do uso de álcool.

Cultura Primária e Purificação de LSCCs

Um espécime de tumor cirurgicamente ressecado foi imerso em fosfato de antibiótico salina fria triplo tamponada (PBS) contendo 1% de penicilina /estreptomicina e anfotericina B (10 ng /mL) (Invitrogen, Buffalo, NY, EUA), e scissored em pequenos fragmentos, que foram, então, dissociadas enzimaticamente em meio RPMI 1640 contendo colagenase tipo IV (Sigma) a uma concentração final de 200 U /ml durante pelo menos 12 h a 37 ° C. As células e os restantes fragmentos foram então lavadas e suspensas em BEGM ™ (meio de crescimento de célula epitelial brônquica) (Catálogo de CC-3170; Lonza, Walkersville, MD, EUA) suplementado com 1% de penicilina /estreptomicina. A suspensão foi então semeada em placas de Petri de 60 mm numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 incubadora a 37 ° C. Após 3-4 dias de incubação, alguns dos fragmentos e as células aderiram ao prato; aqueles que não aderem foram lavados antes do meio foi renovado. Os fibroblastos foram removidos por uma breve exposição a 0,25% de tripsina-EDTA (Invitrogen, Buffalo). As células cancerosas perto de confluência foram destacadas com 0,25% de tripsina-EDTA e repicadas. As células foram armazenadas em nitrogênio líquido de passagem 1.

morfológica de exame e Imunocitoqu�ica

LSCCs cultivadas foram examinados sob um microscópio de contraste de fase para características morfológicas. Para validar a origem epitelial, LSCCs crescimento durante 24 h em lamelas de vidro foram fixadas com paraformaldeído a 4% (PFA) durante 10 min e, em seguida, incubadas em 1% de albumina de soro bovino (BSA) de soro normal de cabra /10% /0,3% de Triton X- 100 (Boster, Wuhan, China) à temperatura ambiente durante 40 minutos para bloquear interacções não específicas e de permeabilizar as células. Os anticorpos monoclonais contra citoqueratina humana (CK) (pan) (1:50, clone AE1 /AE3; Maixin Biotech, Fuzhou, China), citoqueratina 5 (CK5) (1:50, catálogo C0246; Anbo, San Francisco, CA, EUA ), e vimentina (1:50, clone SP20; foram adicionados Maixin Biotech) e incubadas durante a noite a 4 ° C, seguido da adição de anticorpo secundário e a incubação no escuro durante 1 hora a 37 ° C. a núcleos foram coradas com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, Boster, Wuhan, China). O anticorpo secundário foi Cy3-conjugado de cabra anti-murganho /coelho de imunoglobulina (Ig) G cadeias leves e pesadas (H + L). (1:100; Jackson, Lancaster, PA, EUA)

Microscopia Electrónica de Transmissão

a pelota obtida a partir dos LSCCs colhidas na passagem 2 foi fixado com glutaraldeído 2,5% e pós-fixados em 1% de tetróxido de ósmio. A amostra foi desidratada por meio de uma série de álcoois graduados e embebidos em resina. Secções ultrafinas foram cortadas, coradas com acetato de uranilo e citrato de chumbo, e observados sob uma Philips CM120 microscópio eletrônico de transmissão (TEM).

citómetro de fluxo para a pureza do LSCCs de cultura principal

LSCCs cultivadas foram tripsinizadas, lavadas em PBS, fixadas em 4% de PFA durante 10 minutos, e incubou-se em 1% de soro de BSA /10% de cabra normal /0,3% de Triton X-100 (Boster) à temperatura ambiente durante 40 min para permeabilizar as células e bloquear inespecífica interacções. Isto foi seguido por incubação em PBS contendo CK (pan) de anticorpo isotiocianato de -fluorescein (1:500, clone de C-11; Sigma) durante 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS e analisadas utilizando um citómetro de fluxo ciano ADP (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EUA). As células tratadas com PBS em vez de CK (pan) serviu como controle.

Detecção e isolamento de células SP e NSP por citometria de fluxo

LSCCs cultivadas em fase de crescimento exponencial foram lavadas em PBS, tripsinizadas, e suspensas a uma concentração de 1 × 10

6 células /ml em meio frio BEGM. Hoechst 33342 (Sigma) foi adicionado a uma concentração final de 5 ug /ml, na presença ou ausência de verapamil (Sigma) a 50 umol /L, pré-incubadas durante 30 min a 37 ° C. Isto foi seguido por uma incubação de 90 min no escuro a 37 ° C com agitação intervalo. Após a lavagem, foi adicionado 1 ug /ml de iodeto de propídio (Sigma) para excluir as células mortas e as amostras foram analisadas num citómetro de fluxo EPICS ALTRA (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EUA).

Ensaio de viabilidade celular

SP recentemente classificados e LSCCs NSP foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5000 células /poço em 0,2 ml de meio BEGM e meio isento de soro (SFM; descrito no ensaio de formação de esferóides seguinte). Cada grupo foi repetido em 6 poços e meio sem células serviu como controlo. A viabilidade celular foi medida utilizando a célula de contagem Kit-8 (CCK-8; Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japão) as instruções do fabricante, a seguir. A incubação durou 3 horas, e o ensaio foi realizado em triplicado. absorvância no ultravioleta foi medida a 450 nm com um leitor de placas de ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA).

quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR)

reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA , EUA) foi utilizado para extrair o ARN total a partir de SP e isolado usando NSP células. A transcrição reversa foi realizada utilizando kit reagente PrimeScript® RT com gDNA borracha (Takara, Dalian, China). PCR em tempo real foi realizado com o kit de SYBR® Premix Ex TaqTM (Takara) num instrumento LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Suíça). ciclagem térmica incluiu uma desnaturação inicial a 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 5 s e 60 ° C durante 30 s. Beta-actina (ACTB) foi usado como um controle endógeno. A fórmula 2

-ΔΔCT foi usada para calcular a expressão de ARNm relativa de SP contra células de PNS. Os iniciadores utilizados para a amplificação são listados na Tabela 1.

Western Blot para CSC Marcadores

Cerca de 30 ^ g de amostras de proteína a partir de lisados ​​celulares de células SP ordenada e NSP foram analisados ​​usando electroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (Beyotime, Xangai, China), electrotransferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA, EUA), e sondaram-se durante a noite com anticorpo primário (Epitomics, Burlingame, CA, EUA) para o CD44 (1:1,000 , 1998-1), CD24 (1:500, T3445), CD133 (1:1,000, 3621-1), ABCG2 (1:1,000, 3765-1), BMI1 (1:10,000, 5590-1), OCT4 ( 1:1,000, 2876-1), SOX2 (1:1,000, 2683-1), e NANOG (1:1,000, 3369-1). IgG de cabra anti-coelho (H + L) (1:5,000, Jackson) foi então aplicado, seguido pela detecção de sinal usando BeyoECL Plus (Beyotime, Xangai, China). anticorpo ACTB (1:5,000, R1207-1; Huaan Biotech, Hangzhou, China) foi utilizado para normalizar a quantidade de amostra carregada

Ensaio de Proliferação

Ordenado SP e NSP LSCCs foram semeadas como. descrito acima. Nos dias 1, 3, 5 e 7 após separação, o crescimento celular foi ensaiada utilizando o CCK-8, seguindo as instruções do fabricante. A incubação durou 3 horas, e o ensaio foi realizado em triplicado. absorvância no ultravioleta foi medida a 450.

Ensaio de Diferenciação

Isolado NSP células SP e foram cultivadas em meio BEGM durante 18 dias, durante o qual as amostras foram restained pela Hoechst 33342 no dia 6, 12, e 18 para quantificar a percentagem de células SP em cada grupo. Foi utilizado um citômetro de fluxo para análise

Formação Spheroid Ensaio

Ordenado SP e células NSP (5.000 células /ml) foram cultivados usando o kit StemPro_ NSC SFM (A10509-01;. Invitrogen, Carlsbad), com SFM contendo de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) /F12, factor de crescimento de fibroblastos a 20 ng /ml, e 20 de factor de ng /mL de crescimento epidérmico. Além disso, 1% a 200 mmol /l de L-glutamina (25030; Invitrogen, Grand Island, NY, EUA) foi adicionado. Após a sementeira, observou-se a capacidade de formação de esferóides dos dois subconjuntos ao longo do tempo.

Droga sensibilidade do ensaio

ordenada SP e NSP LSCCs foram semeadas a 5 x 10

3 células /cavidade em placas de 96 poços e cultivadas em meio contendo cisplatina BEGM (Pharmaceutical Factory, Nanjing, China) em um gradiente de concentração (0, 1, 3, 5, 7, 9, 11 ug /mL). Cada concentração foi repetido em 6 poços. As outras seis poços paralelos foram pré-incubadas com 50 nmol /L de verapamil como um chemosensitizer a cisplatina durante 30 min a 37 ° C. Uma concentração de 0 ng /ml foi usado como controle. Uma 6 poços contendo meio adicional só serviu como um controlo em branco. As células, cultivadas durante 48 h, foram avaliadas por incubação com CCK-8 durante 3 h. A taxa de inibição (IV) foi avaliada utilizando a fórmula IR = 100% de taxa de -survival (SR), e o SR foi medida utilizando a fórmula SR = (absorvância média dos poços de teste /absorvância dos poços de controlo média) x 100% .

Xenoenxerto tumorigenicidade Ensaio

in vivo

Homem não obesos diabéticos (NOD) /imunodeficiência combinada grave ratos (SCID), 6-8 semanas de idade (SLAC Laboratory Company animal , Xangai, China), foram alimentados em armários de fluxo laminar sob condições específicas livres de patógenos. Ordenar SP, células de PNS, e LSCCs-mãe sem triagem foram suspensos em 0,2 ml de PBS e injectada na axila de cada ratinho. Os ratinhos foram palpados duas vezes por semana para a formação de tumores e foram sacrificados 6 semanas mais tarde. Todos os nódulos tumorais foram fotografados, pesados ​​e confirmado por hematoxilina e eosina. Os valores de P foram calculados de acordo com os pesos dos tumores SP relativos aos tumores NSP.

Análise Estatística

Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão (SD) de pelo menos 3 experiências independentes. t de Student ou

Mann-Whitney

teste foi utilizado com o software GraphPad Prism versão 5.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego CA, EUA) para examinar as diferenças. Os valores de P 0,05 foram considerados significativos

Resultados

morfológica, Características imunocitoquímico e ultra-estrutural

Os LSCCs cultivadas cresceu como uma monocamada em um padrão de calçada, demonstrando a sua epitelial. origem. Além disso, eles apresentaram características típicas da transformação maligna (Fig. 1A-C). A coloração positiva de CK (PAN) e CK5 e coloração negativa de vimentina confirmaram a sua linhagem epitelial (Fig. 1D-F). A micrografia eletrônica de transmissão revelou características epiteliais típicas de LSCCs, incluindo muitas mitocôndrias, reticuli endoplasmático rugoso, ribossomos, grandes núcleos irregulares com a membrana nuclear mostrando profundo recuo e projeções microvillus-like na superfície da célula. Pacotes de tonofilamentos no citoplasma e numerosas desmosomes nas conexões intercelulares foram frequentemente observados (Fig. 1G-I).

(A) de laringe células carcinoma espinocelular (LSCCs) surgiu diretamente a partir do explante 48 h após a semeadura , rodeado por fibroblastos (seta). (B) na passagem 1, LSCCs cresceu com fibroblastos coexistentes (seta). (C) A passagem 4, LSCCs cresceu vigorosamente, sem fibroblastos e exibiu características típicas de alteração maligna, incluindo numerosas figuras de mitose, uma grande nuclear à relação citoplasmática, proeminentes múltiplos nucléolos, células gigantes multinucleadas ocasionais, vacúolos citoplasmáticos, redondo e células luminescentes, e anomalia nuclear. A coloração positiva de citoqueratina (CK) (PAN) (D) e CK5 (E), e coloração negativa de vimentina (F). características ultra-estruturais (setas) de LSCCs mostrando desmosomes nas conexões intercelulares (G), tonofilamentos no citoplasma (H), e membrana nuclear recuado (I).

Pureza e de triagem de células SP em Purificada LSCCs de cultura principal

A pureza de LSCCs cultivadas primárias foram determinadas por citometria de fluxo foi de 98,32 ± 0,93% (Fig. 2A, B). separação de células foi realizada depois de excluir as células mortas e detritos celulares com base em sinais de dispersão e fluorescência de iodeto de propídio. O portão R2 mostrou as células SP que estavam Hoechst 33342 negativo /dim, eo R4 portão indicado as células NSP que estavam Hoechst 33342 positivo. células SP ocupada alguns 4,45 ± 1,07% das células totais. Quando pré-incubadas com verapamil durante 30 min, a percentagem de células SP diminuiu para 0,14 ± 0,13% do total de células (Fig. 2C e D). células SP e NSP foram coletadas para experimentos posteriores. A pureza das células SP e não-SP recém-ordenadas foi 99,25 ± 0,23% e 98,98 ± 0,22%, respectivamente (Fig. 2E, F).

(A) Pureza de LSCCs cultivadas determinadas por citometria de fluxo utilizando citoqueratina (CK) (pan) (98,32 ± 0,93%) e controle (B). (C) Triagem de LSCCs usando Hoechst 33342. O R2 portão representa a população lateral (SP) células (4,45 ± 1,07% do total de células) eo portão R4 é o não-SP células (NSP). (D) A proporção SP após o tratamento verapamil foi de 0,14 ± 0,13%. A pureza do SP recém-ordenados (99,25 ± 0,23%) (E) e as células NSP (98,98 ± 0,22%) (F).

A viabilidade celular após classificar

No significativa foram detectadas diferenças na viabilidade celular entre os SP recentemente classificados e LSCCs NSP mantida em ambos forma BEGM e SFM (P 0,05) (Fig. 3A), o que indica que a concentração de Hoechst (5 ug /mL) utilizada neste estudo não potencialmente alterar a viabilidade celular de LSCCs NSP.

. (A) A viabilidade celular após separação. foi detectada nenhuma diferença significativa na viabilidade celular entre população lateral (SP) e células não-SP (PNS) em meio de crescimento celular epitelial brônquica (BEGM) e meio isento de soro (SFM). Relativa (B) mRNA e os níveis (C) proteína de auto-renovação e genes marcadores CSC em SP e células NSP. (D) taxa de crescimento celular de células SP e NSP em ambos BEGM e SFM determinados pela Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (*** P 0,01, ** P 0,05, * P 0,05).

a expressão de auto-renovação e Genes CSC marcador em mRNA Nível

As expressões de mRNA relativas de ABCG2, BMI1, OCT4, NANOG, SOX2, CD44, CD24, e CD133 em SP classificados e NSP células foram determinados por qRT-PCR. Os resultados mostraram que as células SP mostraram maior expressão de mRNA em ABCG2, BMI1, OCT4, NANOG, SOX2, e CD44 em comparação com células de PNS. No entanto, não foi detectada nenhuma diferença significativa da expressão de CD24 e CD133 mRNA entre o SP e células NSP (Fig. 3B).

Níveis de Proteína de CSC Marcadores

células SP foram encontrados para ter aumento da proteína os níveis de CD44, ABCG2, BMI1, OCT4, SOX2, e NANOG em comparação com células de PNS. Não foram detectadas diferenças significativas de níveis de proteína CD24 e CD133 entre SP e células NSP (Fig. 3C).

Crescimento Cell Rate

Nos dias 1, 3, 5 e 7, após separação, absorvência das células de SP e NSP foi medida utilizando CCK-8 para determinar a taxa de crescimento. No médio BEGM, tanto SP e células NSP proliferaram ao longo do tempo. células SP atingiu uma fase de crescimento exponencial de 3 dias após a semeadura e de dia 7 de terem atingido um patamar. Em contraste, as células NSP continuou crescendo lentamente até o dia 7 antes de passar para uma fase de upgrade (P 0,001). No SFM, células SP proliferaram de forma estável com uma velocidade mais baixa do que no BEGM. Em contraste, as células NSP dificilmente propagado (Fig. 3D).

Análise Diferenciação

Nos dias 6, 12 e 18 após a semeadura, a SP culta e células NSP foram restained com Hoechst 33342 para medir as diferenças em sua capacidade de diferenciação. Os dados mostraram que a percentagem de células SP diminuiu em cultura ao longo do tempo, em 17,67 ± 1,45% no dia 6, 9,08 ± 0,61% em 12 dias, e 4,45 ± 0,63% no dia 18 (Fig. 4A-F). No dia 18, a percentagem de células 33342-opaco /negativas Hoechst em células SP cultura era semelhante ao do LSCCs não separados, enquanto que as células NSP cultivadas continha apenas 0,07 ± 0,03% de células SP (Fig. 4G-H), que podem ter surgido a partir de células SP residuais a partir da última ordenação.

a percentagem de população lateral (SP) as células detectadas em células SP cultivadas diminuiu ao longo do tempo. A percentagem de células SP era de 17,67 ± 1,45% no dia 6 (A, B), 9,08% ± 0,61 no dia 12 (C, D), e 4,45 ± 0,63% no dia 18 (E, F). Em contrapartida, a percentagem de células SP em cultura não-SP células (NSP) foi de 0,07 ± 0,03% (G, H).

Formação Sphere

células SP isolados proliferaram de forma estável no meio de cultura de células estaminais. Esferas flutuantes em suspensão geradas a partir de uma única célula de SP LSCCs aumentado em tamanho ao longo do tempo (Fig. 5A-C). Em contraste, algumas células NSP morreram e outros propagado muito lentamente e não conseguiu formar esferas visuais (Fig. 5D).

No dia 3 (A, × 100), dia 5 (B, × 100) e dia 7 (C, x 400), que flutua aglomerados esféricos de população lateral (SP) células expandidas de forma gradual ao longo do tempo. Em contraste, células não-SP (NSP) não poderia formar aglomerados esféricos após serem cultivadas durante 7 dias (D, × 100). (E) de sensibilidade de SP recém-ordenados e NSP à cisplatina. A taxa de inibição (IV) de células SP mostrou uma diferença significativa a partir de células de PNS em cada concentração de (P 0,001), com a excepção de 11 ug /ml (P 0,05). células SP foram mais resistentes à cisplatina do que as células NSP; isso pode ser revertido pelo pré-tratamento verapamil.

As diferenças de sensibilidade às drogas entre SP e Células NSP

Diferentes concentrações de cisplatina foram utilizados para avaliar as diferenças de sensibilidade às drogas entre SP e células NSP em a presença ou ausência de verapamil, um bloqueador do transportador ABCG2 da superfície celular responsáveis ​​pela resistência quimioterapêutica. Quando tratados com cisplatina isolada, células SP mostrou uma forte resistência até que a concentração de cisplatina foi de 9 pg /ml, e o IR de células SP não mostrou nenhuma diferença significativa a partir de PEN, a uma concentração de 11 ug /ml (P 0,05). Em comparação com células SP, o IR de células NSP mostrou diferença significativa para cada concentração de (P 0,001), excepto para 11 ug /ml. A IV das células pré-tratadas com verapamilo SP aumentada sem diferença significativa em comparação com células de NSP (P 0,05), mas com a diferença significativa em comparação com células SP sem pré-tratamento de verapamil (P 0,001). Não há mudanças notáveis ​​foram detectados no IR das células da PNS, na presença ou ausência de verapamil (P 0,05). (Fig. 5E)

Capacidade Superior Oncogenia de Células SP em NOD /SCID

Nós usamos os LSCCs indiferenciados para o experimento preliminar e escolheu 4 × 10

5 como o número de células de inoculação mais alto para as células SP e NSP. Com o menor número de células inoculação (2 × 10

4), células SP formados dois tumores (n = 4); Em contraste, o menor número de células para as células injecção NSP para formar dois tumores foi de 2 × 10

5 (n = 4). Foram detectadas diferenças significativas entre os pesos dos tumores SP e tumores NSP. Os resultados patológicos confirmou que ambos os tumores formados por células SP e NSP foram LSCCs bem diferenciado, semelhante ao tumor original (Fig 6;. Tabela 2).

(A) Os locais de injecção de não obesos diabéticos (NOD) /imunodeficiência combinada grave (SCID). Hematoxilina e eosina de tumores provenientes do paciente (B), (C, ratinhos tumorais formados pela população lateral (SP); D, tumor formado por não-SP (NSP) células). Ambos os tumores originais e xenoenxerto foram bem diferenciado carcinoma típico, de células escamosas com pérolas de queratina observados com freqüência (setas). (E), com 2 × 10

5 células injetadas, as células SP formaram quatro tumores maiores (4/4), enquanto que as células NSP formado dois tumores muito menores (2/4). (F) A análise estatística dos pesos SP e tumorais NSP em quantidades de células injetadas diferentes (*** P 0,01, ** P 0,05).

Discussão

neste estudo, descrevemos o isolamento bem sucedido e identificação de células SP-cancro da haste como directamente a partir de um espécime LSCC cirurgicamente ressecado derivado de um neoplasma epiglótico bem diferenciadas num paciente do sexo masculino chinês. Embora LSCCs primários são difíceis de cultura

in vitro

, antes do isolamento que tentou a cultura primária de 40 espécimes LSCC e conseguiu em um caso. Nós então purificado as LSCCs cultivadas por tripsinização diferencial repetido para eliminar coexistindo fibroblastos.

O padrão de monocamada e paralelepípedos de LSCCs identificados por microscopia de contraste de fase, coloração positiva de CK (pan) e CK5, coloração negativa de vimentina, e a ultra-estrutura epitelial (incluindo tonofilamentos e desmosomas) revelou por microscopia de transmissão electrónica confirmou a linhagem epitelial dos LSCCs cultivadas (Fig. 1).

uma vez que as células escamosas malignas são fenotipicamente determinada por citoqueratina, utilizou-se um fluxo de citómetro com anticorpo CK (PAN) para avaliar a pureza de LSCCs cultivadas. Embora os resultados devem ser 100%, a pureza foi de 98,32 ± 0,93%, que pode ser um resultado da eficácia imperfeita do anticorpo (Fig. 2A, B). Em seguida, demonstraram que os LSCCs de cultura principal purificados continha uma subpopulação SP distinta (4,45 ± 1,07%), com base na sua capacidade para excluir a Hoescht 33342 corante, e esta capacidade pode ser bloqueada por verapamil, consistente com relatórios anteriores que a Hoechst 33342 exclusão é verapamil sensíveis (Fig. 2C-F).

Como um corante de ligação a ADN, Hoechst é tóxico para as células, particularmente em concentrações elevadas. A fim de eliminar a preocupação de que as células NSP preferencialmente reter citotóxica Hoechst 33342, o que pode alterar a capacidade de proliferação, um ensaio de viabilidade celular foi realizada após separação. Os resultados não revelaram diferenças significativas na viabilidade celular entre os SP recentemente classificados e células NSP (P 0,05) (Fig. 3A), indicando que a viabilidade celular de NSP LSCCs não foi potencialmente afectados por 5 ug /ml de Hoechst, uma concentração amplamente utilizados investigação em células SP [34].

em comparação com células NSP, células SP têm um aumento da expressão de genes, tais como OCT4, NANOG, IMC-1, ABCG2, SOX2 e [31], envolvida na regulação de células-tronco auto-renovação. Curiosamente, estes cinco genes também funcionar como marcadores de tumores sólidos em CSC [35], [36]. Além disso, CD44, CD24, CD133 e são bem conhecidos marcadores CSC em tumores sólidos [37]. Investigou-se a expressão dos genes em ambos os oito níveis de ARNm e de proteína. Consistente com relatórios anteriores, células SP foram encontrados para ter expressão significativamente regulada de OCT4, NANOG, o IMC-1, ABCG2, SOX2 e CD44 em ambos os mRNA e os níveis de proteína em comparação com células NSP. Digno de nota, as células NSP também apresentaram expressão da proteína CD44, consistente com relatórios anteriormente que CD44 é expresso em quase todas as células cancerosas; isso reflete a ambiguidade do CD44 na CSC manutenção [38]. células SP também foram encontrados a ter expressão semelhante da CD24 e CD133 em ambos os níveis de proteína de ARNm e em comparação com as células de PNS, consistentes com relatos prévios que fenótipos CSC para os tumores sólidos pode não ser necessariamente uniforme entre os diferentes tipos de cancro ou mesmo tumores do mesmo histológica subtipo (Fig. 3B, C) [37].

auto-renovação e diferenciação são propriedades fundamentais das células-tronco que lhes permitem dar origem a progênies, incluindo CSCs, que abrigam potencial proliferativo ilimitada, e fenotipicamente diversas células que formam a maior parte do tumor. No ensaio de proliferação, as células SP cresceu significativamente mais rápido do que as células em ambos NSP BEGM e meio GSF (Fig. 3D), confirmando o potencial proliferativo ilimitado de células SP. Assimetria é um tipo particular de divisão celular com um mecanismo atraente em CSC pois requer apenas uma divisão tanto para auto-renovação e diferenciação [39]. No ensaio de diferenciação, a percentagem de células a partir de células SP SP cultivadas diminuiu em cultura ao longo do tempo, com um aumento gradual da percentagem de células de PNS. Mesmo no dia 18, as células cultivadas NSP continha apenas 0,07 ± 0,03% células SP (Fig. 4), e estes podem ter surgido a partir de células SP residuais a partir da última ordenação. Isto sugere que as células SP podem ser submetidos a divisão celular assimétrica de auto-renovação e gerar fenótipos heterogéneas de células de baixa-tumorigénica, incluindo células NSP; No entanto, as células não podem NSP inversamente diferenciar-se em células de SP.

As células estaminais neurais têm a capacidade de crescer em SFM e formar um neuroesfera. Estas propriedades foram aproveitadas para a selecção de células-tronco como em cancros humanos, representados principalmente pelo cancro da mama. No nosso estudo, a capacidade de células de SP para gerar colónias esféricas foi significativamente mais elevada do que a de células de PNS, consistentes com estudos anteriores (Fig. 5A-D) [8], [30].

na droga ensaio de sensibilidade, medimos as diferenças de sensibilidade às drogas entre SP e células NSP. O mecanismo de regulação do efluxo de corante Hoechst é conferida, em parte, através da expressão de transportadores cassete de ligação de ATP da proteína (ABC), predominantemente ABCG2, envolvido no efluxo de agentes quimioterapêuticos [40], [41]. Portanto, nós utilizamos verapamil para bloquear o transportador ABCG2 membrana e observou as mudanças de toxicidade da cisplatina. Descobrimos que as células SP foram muito mais resistentes à cisplatina do que as células de PNS em cada concentração de (P 0,001), excepto para 11 ug /ml (p 0,05), esta situação pode ser revertida pelo pré-tratamento com verapamilo, indicando que o transportador ABCG2 pode desempenhar um papel importante na resistência à droga (Fig. 5E). No entanto, deve notar-se que Mdr1a /b /Bcrp1 ratinhos triplo knockout são viáveis ​​e ainda retêm algumas células SP na medula óssea [42], o que sugere que o mecanismo pelo qual o fenótipo SP é determinada não é apenas conferida através da expressão de proteínas transportadoras de ABC.