Abstract

Objetivos

fluido cérvico-vaginal (CVF) podem ser considerados como uma fonte potencial de biomarcadores para doenças do menor trato reprodutivo feminino. O fluido pode ser facilmente recolhida, oferecendo assim novas possibilidades, como o desenvolvimento de auto-testes. Nosso objetivo foi identificar um biomarcador de proteína CVF para o cancro do colo do útero ou seu estado pré-canceroso.

Métodos

Um estudo proteômica diferenciais foi criada usando amostras CVF de mulheres saudáveis ​​e pré-cancerosas. contagem espectral livre de etiqueta foi aplicada para quantificar a abundância de proteína.

Resultados

A análise do proteoma revelou 16 candidatos a biomarcadores de que

alfa-actinina-4

(p = 0,001) e

piruvato-quinase isoenzima M1 /​​M2

(p = 0,014) foram mais promissor. Verificação de

alfa-actinina-4

por ELISA (n = 28) mostrou que este biomarcador candidato discriminação entre amostras de saudável e de baixo risco e as mulheres infectadas por HPV de alto risco (p = 0,009). análise adicional de amostras longitudinais (n = 29) mostrou que

alfa-actinina-4

níveis correlacionados com a persistência do vírus e de compensação, com a discriminação de aproximadamente 18 pg /ml.

Conclusões

os nossos resultados mostram que CVF é uma excelente fonte de proteínas biomarcadores para a detecção de patologias do trato inferior feminino genitais e que

alfa-actinina-4

derivado de CVF é um biomarcador candidato promissor para o estado pré-canceroso de câncer cervical. Mais estudos de sensibilidade e especificidade deste biomarcador irá demonstrar a sua utilidade para melhorar programas de rastreio atuais e /ou a sua utilização para um teste de auto-diagnóstico de câncer cervical

Citation:. Van Raemdonck GAA, Tjalma WAA, Coen EP, Depuydt CE, Van Ostade XWM (2014) Identificação de proteínas biomarcadores para o câncer cervical utilizando o fluido cérvico-vaginal humano. PLoS ONE 9 (9): e106488. doi: 10.1371 /journal.pone.0106488

editor: Rakesh N. Veedu, The University of Queensland, Austrália |

Recebido: 24 Março, 2014; Aceito: 01 de agosto de 2014; Publicação: 12 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Van Raemdonck et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. GVR recebeu um subsídio do Instituto para a Ciência e Tecnologia (https://www.iwt.be/english/welcome) (nr projeto . 093132). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Christophe Depuydt declara que ele é um empregador do Sonic Healthcare Benelux, Emiel Vloorstraat 9, 2020 Antwerpen, da Bélgica e que, para o melhor de seu conhecimento, não há conflito de interesses, nem financeiro, profissional ou pessoal, entre suas atividades em sonic Healthcare Benelux e este manuscrito [PONE-D-14-13187] ( “Identificação de proteínas biomarcadores para o câncer do colo do útero usando fluido cérvico-vaginal humana “). Isto não altera a adesão dos autores para as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O papilomavírus humano (HPV) é responsável por praticamente todos os cânceres cervicais [1]. Embora existam mais de 150 variantes deste vírus, apenas certos genótipos de HPV, tais como 16, 18, 33, 45 e 58 são conhecidos como os tipos de alto risco (HPV-RH) [2]. tipos de baixo risco de HPV (LR-HPV), principalmente o HPV 6 e 11, raramente causam tumores genitais; no entanto, eles causam condilomas acuminados (verrugas anogenitais) [3]. HPV oncoproteínas expressão persistente (E6 /E7) em HPV células basais epiteliais infectadas desregula a divisão celular [4]. A sobre-expressão destes genes virais provoca a desregulação da proliferação celular, o metabolismo, a apoptose, a diferenciação e a instabilidade genómica, todos os quais podem levar a estágios consecutivos de neoplasia intra-epitelial cervical (CIN1, 2 e 3) ou lesões intra-epiteliais escamosas (baixo -grade SIL e de alto grau SIL). Aproximadamente 85% de todas as pessoas sexualmente activas serão expostas ao HPV, e a maioria de todas as infecções HR-HPV são virião produzir (que é limitado no tempo), sugerindo que, para além do genótipo virai, diversos cofactores estão intimamente associados com a persistência das oncoproteínas virais e a transformação da mucosa cervical para tecido maligno [5], [6].

Existem diversas razões pelas quais o desenvolvimento de um ensaio de diagnóstico, com base no fluido cérvico (CVF), para início detecção do cancro cervical seria benéfico. Na primeira, testes de rastreio atuais não são ideais. Por causa da alta prevalência de câncer do colo do útero, as mulheres entre as idades de 25 e 65 são freqüentemente pesquisadas utilizando Pap (anicolaou) esfregaços, um teste que se baseia na detecção de alterações morfológicas de células da mucosa do colo do útero. Infelizmente, a baixa sensibilidade deste teste pode resultar em câncer cervical diagnosticados numa fase tardia [7]. Os dados sobre os ensaios clínicos randomizados mostram que o rastreio de ADN de HPV é mais sensível do que a citologia, mas a especificidade é mais baixa, o que inevitavelmente irão resultar em um tratamento excessivo porque cerca de 80% dos pacientes positivos para HPV espontaneamente eliminar o vírus [3]. Além disso, o exame colposcópico é trabalhoso, difícil de automatizar e vulneráveis ​​a variação inter e intra-observador [8]. A introdução de um novo biomarcador que ajuda a melhorar a sensibilidade e especificidade dos programas de rastreio atuais é, portanto, mais do que bem-vindo. A segunda razão reside na aplicabilidade da CVF para o diagnóstico. Uma vez que o fluido pode facilmente ser recolhidos pelo indivíduo com o auxílio de dispositivos especiais [9], um teste rápido e simples, com base em um ensaio de vareta, realizada pela própria mulher, poderia ser desenvolvido. Tal auto-teste pode ser introduzido, por exemplo, em populações de recursos limitados, onde carga desigual de câncer do colo do útero, muitas vezes ocorre. De fato, estima-se que apenas 5% das mulheres em países de baixos recursos são selecionados de forma adequada para o cancro do colo do útero [10]. Falta de infra-estrutura de cuidados de saúde e custos financeiros são as principais razões pelas quais os programas baseados em citologia não são implementadas. Desde métodos alternativos são atualmente investigados nessas regiões, o uso de um teste de auto-diagnóstico baseado em CVF poderia ser considerada. Além disso, testes de auto também pode ser usado em estudos de acompanhamento de programas de vacinação uma vez que o efeito da vacinação em mulheres sexualmente activas é incerto [11]. Além disso, as vacinas atuais só endereço de indução de neoplasia genótipos de HPV 16 e -18 sugerindo que, sob circunstâncias ideais, apenas um máximo de 70% de todos os cancros do colo do útero pode ser evitado [7], [12]. Assim, pelo menos para as próximas décadas, uma avaliação cuidadosa dos programas de vacinação é altamente recomendado e um teste de auto-diagnóstico simples poderia ajudar muito em atender a esta pergunta.

No passado, vários estudos foram realizados proteômica para identificar biomarcadores para o (precoce) detecção de neoplasia cervical. Em diferentes estudos, tecido cervical pré-cancerosas e saudáveis ​​foi comparada e Lee

et al.

Estudou o

in vitro

contribuição de oncoproteína E7 para o desenvolvimento da neoplasia do colo do útero usando uma linha de células infectadas pelo HPV [ ,,,0],13] – [20]. Vários marcadores que foram ligados à desregulação do ciclo celular normal, tais como p16, Ki67 e a ciclina E foram caracterizados. Estes resultados resultou numa melhor compreensão da carcinogénese induzida pelo HPV, mas até agora todos eles apresentaram baixa sensibilidade e /ou especificidade e, portanto, não pode ser utilizado na prática clínica.

Para a descoberta de biomarcadores e validação, fluidos corporais são melhores do que amostras de tecido porque as seguintes vantagens são inerentes à maior parte dos fluidos corporais: (1) acessibilidade fácil; (2) A prevenção dos riscos de amostragem; e (3) potencial de amostragem múltipla [21]. Hoje, o plasma é o fluido biológico mais analisados ​​na pesquisa de biomarcadores e que já tem sido utilizada na investigação do cancro do colo do útero [22], [23]. No entanto, o plasma entra em contato com quase todos os órgãos do corpo, fazendo com que os biomarcadores de plasma menos específico, porque é difícil determinar a partir de qual órgão são originários [21].

CVF podem ser obtidos por lavagens cérvico-vaginal, secreção vaginal , tampões ou com um dispositivo de auto-amostragem [9], [24] e tem as seguintes vantagens sobre o plasma: (1) que possui um volume /relação de órgão-fluido inferior em comparação com o plasma, o que resulta numa maior sensibilidade; e (2) que entra em contacto com o menor número de sistemas de órgãos, o que provavelmente aumenta a especificidade dos marcadores de [21], [25]. Neste estudo, vamos nos concentrar na identificação de biomarcadores candidatos à neoplasia cervical, comparando a composição de proteína de amostras CVF individuais de mulheres saudáveis ​​e pré-cancerosas (HSIL LSIL e). Nossas descobertas indicam que

alfa-actinina-4

(ACTN4) é um biomarcador candidato promissor para o estado pré-cancerosas de câncer cervical e que esta proteína CVF está muito bem adaptado para o desenvolvimento de um teste de auto-diagnóstico.

Materiais e Métodos

desenho do estudo e amostra coleção

Todos os pacientes concordaram em participar mediante consentimento por escrito eo estudo foi aprovado pelo comitê de ética do hospital universitário de Antuérpia (número de registo : B30020108372). códigos de identificação dos doentes estudo específico-foram designados e transmitida de uma tal maneira que a confidencialidade do paciente foi preservada.

Todas as amostras neste estudo prospectivo, cego, de coorte foram levados pelo mesmo ginecologista (Waat). Em caso de resultados anormais Papanicolau (devido à infecção pelo HPV ou como um resultado falso-positivo), os pacientes sãos e pré-cancerosas são rotineiramente submetidos a um exame colposcópico, um procedimento que inclui a lavagem da vagina com ácido acético a 5%. Depois de colposcopia este fluido de lavagem (contendo o fluido cérvico-vaginal) são normalmente descartados, mas foi coletado para análise proteômica. Além disso, as amostras de citologia cervical foram recolhidos durante este exame colposcópico para determinar o status de citologia e HPV como descrito anteriormente usando PCRs específicos do tipo [26]. Todas as amostras de citologia com base BD-SurePath líquidos foram enviadas para o laboratório de patologia (RIATOL, Departamento de Diagnóstico Molecular, Sonic Healthcare Benelux, Antuérpia, Bélgica) para processamento. Com base na combinação dos resultados de colposcopia, citologia e resultados de genotipagem de HPV, saudáveis ​​e mulheres pré-cancerosas poderia ser identificada numa maneira fiável. Nós selecionamos amostras provenientes de 6 saudável (colposcopia normais /citologia e HPV negativo, grupo A) mulheres e 6 pré-cancerosa (colposcopia anormal /citologia e HR-HPV positivo, grupo B) indivíduos (Tabela 1). Todas as amostras foram derivadas de pós-menopausa ( Três anos após a última menstruação) mulheres de idade semelhante (59 +/- 13 anos). Os pacientes que utilizaram medicamentos foram excluídos do estudo. Além disso, pacientes que apresentavam sinais visíveis de infecções ginecológicas (por exemplo, gonorreia) ou sofreu uma infecção HIV foram excluídos também. Com base nas amostras de fluidos cervico, os pacientes foram rastreados para a Trichomonas vaginalis. Durante análises proteômicas, amostras CVF saudáveis ​​e pré-cancerosas foram sempre analisados ​​em pares para minimizar variações técnicas da plataforma LC-MS /MS.

Análise proteômica

Após a coleta, as lavagens cérvico (25-40 ml) foram imediatamente transportadas em gelo para o laboratório e armazenadas a -80 ° C. Após centrifugação, o sobrenadante foi concentrado por liofilização para um volume final de cerca de 200 uL. As amostras de proteína (1 mg /amostra) foram separados e fraccionados na primeira dimensão numa coluna C4 de HPLC de fase reversa (RP) de proteína. A digestão enzimática com tripsina foi realizada e os péptidos resultantes de cada fracção foram separadas numa segunda dimensão num sistema de micro HPLC-RP-C18 capilar. Análise por espectrometria de massa foi realizada usando um instrumento MALDI-TOF /TOF. Resultando espectros MS /MS de cada amostra foram selecionados no banco de dados Swiss-Prot humano (versão: 57,1) usando o motor de busca MASCOTE. A análise dos conjuntos de dados obtidos foram realizados como previamente descrito [25]. Informações mais detalhadas podem ser encontrados no documento de S1 e S1 Figura.

ensaio imunoenzimático

Para confirmar os resultados de LC-MS /MS, ensaios de enzima ligada de sorvente imunológico (ELISA) foram realizados para

alfa-actinina-4

(ACTN4) e

piruvato quinase isoenzima M1 /​​M2

(PKM2), de acordo com as instruções do fabricante. Um kit de ELISA ACTN4 humana (Cusabio Biotech Co. LTD.) E um kit de ELISA PKM2 humana (USCNK Life Science Inc.) foram utilizados para quantificar ACTN4 e PKM2 em lavagens vaginais cervicais a partir saudáveis ​​(n = 16) e HPV-infectado (N = 12) do sexo feminino (ambos pré e pós-menopausa). Além disso, várias amostras longitudinais (n = 29) foram também testados para estes dois biomarcadores candidatos.

Estatísticas

Para determinar se a diferença na abundância de proteínas foi significativa, normalizadas fatores espectros abundância (valores NSAF ) foram submetidos a testes estatísticos. Porque as proteínas seleccionadas foram identificados em várias amostras, e, por conseguinte, também continha vários valores NSAF, foi utilizado um teste U não-paramétrico de Mann-Whitney. Além disso, um teste de qui-quadrado foi realizado, pelo que a frequência de todas as proteínas identificadas foi analisada para determinar se determinadas proteínas foram mais ou exclusivamente detectado mais sob certas condições. T de Student não pareado foram realizados para analisar os resultados de ELISA. Todos os testes estatísticos foram realizados utilizando o Statistical Package of Social Science (SPSS versão 18).

Resultados

Estudo Diferencial para a caracterização de biomarcadores de câncer do colo do útero

Para identificar diferencialmente abundante proteínas, 12 amostras foram divididas em dois grupos e foram analisados ​​individualmente utilizando uma plataforma proteômica analítica (Tabela 1). Grupo A composta de 6 amostras de indivíduos saudáveis, enquanto que o grupo B consistiu de 6 amostras de indivíduos pré-cancerosas. Análise proteômica resultou em 846 e 825 identificações para o grupo A e do grupo B, respectivamente, representando 371 (grupo A) e 341 (grupo B) proteínas não redundantes (Figura 1). A sobreposição média entre todas as amostras do grupo A foi de 54% e do grupo B foi de 53% (Tabela S1).

Para os proteoma 371 proteínas únicas saudáveis ​​foram identificados, enquanto 341 proteomas exclusivos para o proteoma pré-cancerosa. Um conjunto de sobreposição de 238 proteínas foram encontradas em ambos os proteomas.

A análise semi-quantitativa também foi realizada com base no método NSAF livre-label (Tabela S2). Para ambos os grupos, os valores NSAF das proteínas presentes em, pelo menos, 5 dos 6 amostras foram comparadas mutuamente. A variação na abundância de proteínas entre as amostras foi expressa como o coeficiente de variação (CV). Um valor CV médio de 60% (mais baixo: 19%; mais alto: 134%) foi obtida para o grupo A (saudável), enquanto um CV médio de 52% (mais baixo: 14%; mais alto: 99%) foi observado para o grupo B .

Identificação de proteínas diferencialmente abundantes

Para identificar biomarcadores candidatos que se correlacionam com o estado pré-cancerosas de câncer cervical, proteomas CVF saudáveis ​​e pré-cancerosas foram comparados. A análise qualitativa foi realizada entre as 371 proteínas identificadas para o grupo saudável e as 341 identificações para o grupo pré-cancerosas, o que resultou em proteínas sobrepostas 238 ou 67%. Para identificar proteínas com uma diferença estatisticamente significativa de ocorrência, todas as identificações foram submetidos a testes estatísticos usando um teste do qui-quadrado de Pearson. As proteínas com um valor de p ≤0.05 estão listados (Tabela 2). A partir destes cálculos, ACTN4 foi identificada em todas as amostras de pacientes pré-cancerosas, mas não nas amostras de pacientes saudáveis. Além disso, ACTN4 foi primeiramente identificada com base em vários peptídeos originais com uma pontuação de proteína MASCOTE média de 162 (Tabela S3). A diferença na abundância desta proteína foi ainda verificada por meio de ELISA (ver abaixo).

Além disso, uma comparação semi-quantitativo foi realizado para determinar se determinadas proteínas que foram identificados em ambos os saudáveis ​​e os grupos pré-cancerosas foram diferencialmente expressos. Os NSAF valores de proteínas correspondentes foram estatisticamente testadas utilizando um teste-U de Mann-Whitney. Apenas proteínas com uma significância estatística de p £ 0,05 estão listados (Tabela 3). Este cálculo resultou em quatro proteínas que foram caracterizados por uma diferença significativa entre a abundância de ambas as condições. Apenas uma proteína,

haptoglobina

, mostraram uma regulação negativa na condição pré-cancerosa, enquanto outros três proteínas,

ATP sintase subunidade beta

,

anexina A2 Comprar e PKM2, foram upregulated. PKM2 e

anexina A2

apresentou o menor valor de p (0,01 e 0,03, respectivamente) e foram detectados em 5 de 6 amostras do grupo pré-cancerosa. Porque as proteínas altamente variáveis ​​não são candidatos a biomarcadores apropriados, foi calculada a variação nas abundâncias destas proteínas. Com valores CV de 40% e 29% para o grupo de pré-canceroso e saudável para PKM2, respectivamente, esta proteína é mais adequado como um biomarcador candidato comparado com

anexina A2

, que teve valores de 77% e 48%, respectivamente.

Verificação dos candidatos a biomarcadores

Um ELISA foi realizada para verificar os perfis diferenciados de ACTN4 e PKM2. Saudáveis ​​(n = 16) e amostras infectadas com HPV (ambos HR-HPV oncogénico (n = 8) e LR-HPV amostras não oncogénicos (n = 4)), que não foram incluídos na experiência anterior, foram testados usando comercialmente kits disponíveis (Tabela 4).

Os níveis de ACTN4 foram significativamente maiores em amostras de indivíduos infectados HR-HPV em comparação com amostras de não-HR-HPV pacientes saudáveis, infectados (p = 0,023), o que confirmou os resultados de LC-MS /MS. Notavelmente, uma amostra, proveniente de uma HR-HPV não-paciente infectado, parece ser um outlier por causa da alta concentração de ACTN4 de 85,6 pg /mL (ver discussão). Além disso, os pacientes infectados LR-HPV tinham concentrações ACTN4 mais elevados em comparação com os pacientes não-HPV-infectados (p = 0,052), mas os valores um pouco mais baixos em comparação com os doentes infectados HR-HPV (p = 0,114). A comparação dos níveis ACTN4 em (ambos HR e LR-infecções) infectadas pelo HPV em comparação com amostras de não-infectados (pacientes saudáveis) mostrou uma diferença significativa, com um valor de p 0,009 (Figura 2). A concentração mais elevada ACTN4 para o grupo saudável (excepto para o outlier) foi de 17,3 pg /ml, enquanto que a concentração mais baixa para o grupo infectado-RH foi de 30,6 pg /ml. A menor concentração de ACTN4 no grupo LR-infectadas foi de 21,3 pg /ml, que é maior do que o valor mais elevado do grupo saudável. Com base nestas observações, um limiar de 18 pg /ml pode ser definido como o valor mais elevado de ACTN4 para a condição não-infectados. Nenhuma correlação linear foi encontrada entre a carga viral e a concentração absoluta de ACTN4, o que pressupõe que ACTN4 não é apenas um marcador para a infecção pelo HPV, mas sim para a fase pré-cancerosa.

A concentração de ACTN4 para os indivíduos saudáveis ​​(n = 16), os doentes infectados com HPV-RH (n = 8) e os pacientes infectados com o HPV LR (n = 4). O teste estatístico de ACNT-4 níveis entre pacientes infectados saudáveis ​​e HR-HPV resultou em um valor-p de 0,023 e entre saudável contra o LR-HPV em um p-valor de 0,052. Quando os pacientes infectados HR e LR-HPV foram agrupados como pacientes infectadas pelo HPV, um p-valor de 0,009 foi encontrada entre os grupos não-infectados (pacientes saudáveis) e infectados.

Além disso, o mais candidato semi-quantitativa promissor, PKM2, foi verificada com um kit de ELISA comercial. Para esta análise, foram usadas as mesmas 28 amostras; No entanto, os resultados de LC-MS /MS não foram confirmados (dados não mostrados).

Em seguida, analisamos as concentrações ACTN4 durante 29 amostras longitudinais adicionais (ou seja, amostras do mesmo paciente em vários pontos de tempo) a partir de 9 pacientes. Para cada paciente, um mínimo de três amostras foi avaliada longitudinais (Figura 3). A partir destes nove pacientes, cinco pacientes eliminaram o vírus, dois pacientes tiveram a infecção persistente por HPV, um paciente adquiriu uma nova infecção por HPV e um paciente era saudável. Embora o número de pacientes por grupo são pequenos, estas amostras podem nos ajudar a confirmar os nossos resultados. Um ELISA ACTN4 foi realizada em várias das amostras para identificar as correlações entre os níveis de vírus e perfis ACTN4 dentro de um paciente. No entanto, para além do título de vírus, que também esperado que o genótipo e o tempo de infecção para influenciar a expressão ACTN4 porque diferentes tipos de vírus que têm diferentes capacidades cancerígenas e o cancro cervical geralmente se desenvolve após uma infecção persistente HR-HPV [2]. Recentemente, foi mostrado que o desenvolvimento de pré-cancro do colo do útero (neoplasia intra-epitelial cervical da terceira série; CIN3) é precedida por um aumento constante na carga viral de um determinado tipo HR-HPV, enquanto que uma rápida carga aumentando exponencialmente é geralmente eliminada durante seis a 18 meses e é geralmente associada com alterações citológicas de baixo grau [27]. Com esses fatores em consideração, as duas tendências seguintes foram observados a partir dos experimentos: (1) pacientes que tiveram uma infecção em estágio inicial (paciente 1) ou eliminaram o vírus (pacientes 2, 6, 7 e 9) tinha aumentando ou descendente ACTN4 níveis, respectivamente, e os pacientes sem ou com baixas infecções (paciente 5) ou infecções contínuas (pacientes 4 e 10) tinham níveis baixos ou altos ACTN4 estáveis, respectivamente; e (2) para uma infecção persistente (pacientes 1, 4 e 10), o ACTN4 acumulada.

A comparação dos níveis ACTN4 com genótipo e carga viral em amostras longitudinais de 9 pacientes diferentes. genótipos semelhantes são ilustradas nas mesmas cores. No lado esquerdo da carga viral (em número de cópias /célula) é mostrado numa escala logarítmicos enquanto que no lado direito da concentração de ACTN4 é expressa em pg /ml. O y-ax indica o tempo (expresso em dias), enquanto os pacientes foram acompanhados. Uma linha preta pontilhada ilustra o limiar ACTN4 de 17,3 pg /ml. níveis ACTN4 foram determinados os pontos de tempo quando uma amostra CVF estava disponível.

Discussão

Caracterização do proteoma CVF de pacientes saudáveis ​​e pré-cancerosas

Neste estudo, a proteoma CVF de 12 (6 saudável e 6 pré-cancerosa) amostras individuais foi caracterizada para identificar biomarcadores de proteína candidata para a detecção do estado pré-canceroso do cancro do colo do útero. A análise dessas 12 amostras foi realizada tanto no nível (presente /ausente) e semi-quantitativa qualitativa. O número de identificação de proteínas de cada uma das amostras é muito consistente com estudos realizados anteriormente proteomic sobre CVF [28].

A determinação da quantidade de sobreposição entre as proteínas de amostras dentro de um grupo apresentaram diferenças significativas. Apenas 10% de todas as proteínas foram observadas em cada uma das amostras individuais de ambos os grupos. Este grupo é constituído principalmente por proteínas que são característicos do proteoma CVF, com base na sua localização e função biológica. Pedimos, portanto, estas proteínas “proteínas característicos”. No entanto, um número significativo de identificações, tais como proteínas intracelulares, são menos característica do proteoma CVF. Este achado pode ser explicado por meio de processos tais como a ruptura da camada de células epiteliais durante a amostragem e o desprendimento de células epiteliais mortas. Nós, portanto, grupo essas identificações como proteínas “não-característicos”. Com base nestes resultados, que são comuns a quase todos os estudo abrangente CVF proteômica, pode-se fazer uma distinção entre um “proteoma core” de proteínas CVF característicos frequentemente identificados e um “proteoma variável” que contém as proteínas CVF não características [28] .

em comparação com os valores médios CV das identificações comuns entre três repetições técnicos (25%) [25], os valores de média CV de abundância de proteína na saúde e as amostras pré-cancerosas (60% e 52%, respectivamente) eram significativamente mais elevados. Este resultado era esperado porque, em contraste com as repetições técnicos, as amostras não eram idênticos. Em todas as amostras, proteínas com elevadas diferenças inter-individuais foram observados (até 134%), ao passo que o valor de CV médio medido das proteínas “característicos” foi de 38%. Estes resultados são semelhantes a outros estudos proteômicos de fluidos corporais. Por exemplo, Yamakawa

et al.

[29] encontraram um valor médio CV de 63% para o proteoma do plasma seminal, e de acordo com Anderson

et al.

[30], a média CV valor de uma série de proteínas do plasma era de aproximadamente 45%.

a identificação de proteínas diferencialmente abundantes

Para examinar diferenciais proteínas abundantes, um método de contagem espectral livre de etiqueta foi realizada. Como este método apenas permite uma análise semi-quantitativa, efeitos notáveis ​​foram investigados primeiro uma vez que estes normalmente dar os resultados mais fiáveis. Por isso, exercido pela primeira vez proteínas para as quais a sua presença ou ausência no grupo pré-cancerosas era característico de uma determinada condição. O teste estatístico (teste de qui-quadrado) resultou em proteínas com 12 uma diferença significativa da incidência (p 0,05), dos quais 6 proteínas foram identificadas exclusivamente nas amostras de pré-cancerosas (Tabela 2). A proteína mais significativa foi ACTN4 (Acc No: O43707), a qual foi identificada em todas as amostras pré-cancerosas, mas nenhuma das amostras saudáveis ​​(p = 0,001). Notavelmente, SCCA-1, muitas vezes utilizado como biomarcador de plasma para o cancro do colo do útero [31], também foi identificado, embora com um valor de p mais elevado (p = 0,046).

ACTN4 é um componente crítico do citoesqueleto e é envolvida na formação de adesões célula-célula [32]. Tem sido demonstrado que a inibição de determinadas moléculas de adesão ligados à membrana causada por uma malignas transformação resulta numa redução da força de adesão célula-célula e a regulação positiva de ACTN4 [33]. Com base em um estudo de knockdown ACTN4 utilizando células cancerosas da mama, Khurana

et ai. Demonstraram que

ACTN4 foi envolvida no mecanismo do crescimento das células [34] controle. Além disso, a acumulação citoplásmica de ACTN4 foi associado a várias malignidades e foi ligado com um mau prognóstico [35], e um ganho genómico acumulativo de ACTN4 foi associada com a formação de adenocarcinomas do ovário [36]. Além disso, a regulação negativa RNAi mediada por ACTN4 mostrou uma associação entre a sobre-expressão de ACTN4 e um fenótipo agressivo de carcinoma de células escamosas oral [37]. Recentemente, a proteína foi encontrada para ser associada com vários factores com funções diferentes, sugerindo outros papéis para esta proteína, para além da regulação da actina [38]. Com efeito, Khurana

et ai.

Identificado um motivo LXXLL que foi responsável pela interacção de ACTN4 com o receptor de estrogénio e co-activadores [39]. Estudos recentes em modelos de ratos transgênicos HPV fornecem evidências de que o estrogênio e seu receptor nuclear promover o cancro do colo do útero em combinação com oncogenes de HPV [40]. Por conseguinte, é tentador especular que ACTN4 desempenha um papel importante neste efeito.

Com base na NSAF-método semi-quantitativo, foram seleccionadas as proteínas para a sua expressão diferencial entre as duas condições. O teste estatístico (Mann-Whitney U) resultou em quatro proteínas com um aumento significativo (p 0,05) em abundância diferença (Tabela 3). Embora estas quatro proteínas mostram uma diferença estatisticamente significativa durante esta fase de descoberta, uma etapa de verificação é necessária para confirmar estes resultados. Quando tanto o p-valor e a frequência de presença foram tidas em conta,

anexina A2 Comprar e PKM2 eram mais promissor (p 0,03), porque ambos foram identificados em pelo menos 9 de 12 amostras individuais, com três upregulation fold para a condição pré-cancerosa (Tabela 3). Apesar de a identificação de um

nnexin A2

em quase todas as amostras (11/12 amostras) com uma diferença aceitável em abundância (p = 0,03), as variações inter-individuais (CV de 77%) para o grupo saudável eram muito mais elevada em comparação com PKM2 (35%). Portanto, PKM2 (Acc No: P14618) foi selecionado para verificação por ELISA

PKM2 é uma enzima glicolítica que contribui para o fornecimento de energia da célula.. Esta proteína tem duas isoformas, uma isoforma embriológico (M2) com a actividade enzimática elevada e uma isoforma adulta (M1). Recentemente, foi demonstrado que a transformação maligna de células por oncogenes HR-HPV E6 e E7 induziu um interruptor PKM de M1 M2 para [41]. Esta opção faz com que uma mudança do metabolismo celular normal para a glicólise elevada, o que é benéfico para o crescimento e neoplasia de células tumorais [42]. Infelizmente, não fomos capazes de confirmar a diferença nas concentrações PKM2 entre CVFs de indivíduos saudáveis ​​e pré-cancerosas, embora foram utilizados dois kits ELISA de diferentes fornecedores. É possível que o método de contagem espectral semi-quantitativa pode ser propenso a muita variação. Como alternativa, temos observado anteriormente que a matriz CVF não é o ideal para algumas configurações de ELISA e este pode ser o caso para os dois ensaios PKM2 ELISA.

Verificação de alfa-actinina-4 níveis

alfa-actinina-4, o biomarcador candidato mais promissor, foi verificada em 57 amostras adicionais CVF (28 amostras individuais e 29 amostras longitudinais) por ELISA, um número que certamente preenche os requisitos para a fase de descoberta /verificação de biomarcadores de proteínas [43] . Os resultados de ELISA revelaram que a concentração de ACTN4 é elevado nos pacientes infectados por HPV em comparação com os pacientes não infectados, confirmando assim os resultados de LC-MS /MS. No entanto, a infecção com HPV-LR (HPV-6 e HPV-11) resultou em concentrações mais elevadas no ACTN4 CVF. Embora as concentrações de ACTN4 medidos nas CVFs de indivíduos LR-HPV-infectados são mais elevados do que os de indivíduos não infectados, não foi observada nenhuma diferença significativa no nível de abundância (p = 0,052). Porque estas conclusões são baseadas na análise de amostras de apenas quatro pacientes única LR-HPV-infectados, mais deste tipo de amostra deve ser avaliada antes de conclusões podem ser tiradas. Um paciente não-infectado apresentaram um valor outlier de 85,6 pg /ml de ACTN4. Este paciente não tem história conhecida de infecção HR-HPV, mas o arquivo clínico mostrou doença isquêmica do coração e uma prevalência de câncer de mama. Por conseguinte, é possível que esta concentração elevada de ACTN4 é causada pelo tratamento médico ou de uma infecção pelo HPV-LR diferente de HPV-6 ou HPV-11. Por conseguinte, grande validação deste marcador em um maior número de amostras, incluindo os de pacientes que sofrem de outras doenças e infecções (VIH, o herpes, a vaginose bacteriana,

Chlamydia

etc), o próximo passo é determinar se ACTN4 é adequado para fins de diagnóstico. Nestes estudos, pode-se prever um limite de 18 pg /ml para discriminar entre amostras de comparação com indivíduos saudáveis ​​infectados com o HPV.

Embora os níveis ACTN4 numericamente não se correlacionam com as cargas virais, uma tendência descendente e ascendente poderiam claramente ser observada em pacientes que ou iniciados uma infecção ou eliminaram o vírus. Também foi observado que as infecções ao longo de períodos mais longos causados ​​acumulação do marcador.