Abstract

elementos estromais dentro de um tumor interagir com as células cancerosas para criar um microambiente que suporta o crescimento de tumores e sobrevivência. Adrenomedulina (ADM) é um factor autócrino /parácrino produzidos por ambas as células do estroma e as células cancerosas para criar tal microambiente. Durante a diferenciação de macrófagos, a ADM é produzido em resposta a estímulos pró-inflamatórios e hipóxia. Neste estudo foram investigados o papel de ADM como um factor de crescimento para as células de cancro do ovário e como um modulador de macrófagos. Analisamos também os níveis de expressão ADM em um estudo clínico retrospectivo usando a tecnologia nanofluidic e avaliação da ADM ao nível do gene em 220 pacientes com câncer ovariano. Para estudar os efeitos da ADM, linhas celulares de cancro do ovário A2780, OVCAR-3, e os seus homólogos HEY e resistentes a drogas foram usadas para ensaios de proliferação, enquanto que os monócitos de doadores saudáveis ​​foram diferenciadas in vitro. ADM era um factor de crescimento fraco, como reveladas por ensaios de proliferação e análise do ciclo celular. Após a cultura de células cancerígenas, sob condições adversas, tais como a privação de soro e /ou hipóxia, a ADM verificou-se ser um factor de sobrevivência em HEY, mas não em outras linhas de células. Em macrófagos, a ADM mostrou actividade sobre a proliferação /diferenciação, principalmente em macrófagos do tipo 2 (M2). Inesperadamente, o estudo clínico revelou que a alta expressão da ADM foi ligado ao resultado positivo e ao câncer com baixa CA125. Em conclusão, embora in vitro ADM era um factor potencial na agressividade biológica, esta possibilidade não foi confirmado nos doentes. Portanto, o uso de um antagonista ADM seria inadequado no tratamento de pacientes com câncer de ovário

Citation:. Baranello C, Mariani M, Andreoli M, Fanelli M, Martinelli E, Ferrandina G, et al. (2012) adrenomedulina no câncer de ovário: Foe In Vitro e In Vivo amigo? PLoS ONE 7 (7): e40678. doi: 10.1371 /journal.pone.0040678

editor: Konradin Metze, Universidade Estadual de Campinas, Brasil

Recebido: 19 Março, 2012; Aceito: 12 de junho de 2012; Publicado: 30 Julho 2012 |

Direitos de autor: © Baranello et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado por uma bolsa da Associazione Oppo e le sue stanze ONLUS (www.oppostanze.it), pelo Programa de Pesquisa do Câncer Ruth C. Donovan e por uma generosa doação de Sr. e Sra Ruggles. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

microambiente O câncer é um tema que começou recentemente a investigadores de juros. Durante anos, a investigação centrou-se na própria célula de cancro, mas de um tumor sólido, também contém elementos estromais não malignas, incluindo macrófagos, linfócitos, mastócitos, células endoteliais, fibroblastos, miofibroblastos, pericitos, e de células estaminais mesenquimais, as quais interagem com as células cancerosas criar um microambiente que suporta o crescimento de tumores e sobrevivência [1], [2]. Compreendendo a composição exacta do microambiente do tumor poderia ser útil para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas racionais.

Cancro do ovário

epitelial exibe uma rede de citocina-quimiocina complexo de [3]. Os receptores para as quimiocinas são expressos numa variedade de células infiltrantes, incluindo macrófagos, que são recrutadas por quimiocinas [4]. Esta interacção é um processo de duas vias: células de cancro do ovário, também são capazes de modular o fenótipo de macrófagos, uma vez que as citoquinas e receptores de superfície de células que são induzidos em co-cultivadas in vitro macrófagos são também detectada no cancro do ovário humano [5]. ADM é capaz de promover a angiogénese e melanoma crescimento [6], tanto através do efeito parácrino, mediada pela via nítrico endotelial sinalização de sintase de óxido, e por o efeito autócrino, que estimula a polarização dos macrófagos para um fenótipo alternativamente activada (M2).

ADM é um péptido solúvel 52-amino-ácido que foi purificado pela primeira vez a partir de feocromocitoma [7], e que se pensa ser produzida principalmente pela medula supra-renais. Hoje em dia, no entanto, é bem sabido que a ADM é quase ubíquo, com uma distribuição generalizada de tecido que é indicativa das suas várias actividades biológicas [8]. ADM é produzida por ambos estromal (isto é, endoteliais, músculo liso vascular, do miocárdio e do sistema nervoso central) e células de tumor como um factor autócrino /parácrino. Também é produzido durante a diferenciação de macrófagos em resposta a estímulos pró-inflamatórios e hipoxia, e tem principalmente efeitos anti-inflamatórios, uma vez que a ADM inibe a produção de TNF-α por macrófagos activados, reduz a permeabilidade vascular, e regula negativamente a resposta auto-imune mediada por Th1 [ ,,,0],9].

A2780, TC1, TC3, células OVCAR-3, OVCAR-EPO10 e foram tratados com a ADM 1, 10, e 100 nM durante 72 horas e contadas. As contagens de células são apresentados como o número absoluto de células. Um efeito modesto no crescimento celular foi observado em algumas linhas de células, tais como células A2780 (A), TC1 (B), e células OVCAR-3 (D).

Estruturalmente, a ADM é caracterizada por um típico anel de 6-amino-ácido, devido a uma ponte dissulfureto entre as cisteínas 16 e 21, e é amidado no terminal C. Tanto a ligação dissulfureto e amidação são essenciais para a sua actividade. ADM é homóloga à da calcitonina péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP), amilina e, ambos os membros do calcitonina /CGRP /amilina superfamília [10]. Esta homologia permite reactividade cruzada significativa com os receptores de estes péptidos, bem como com a própria calcitonina. Dois receptores foram identificados para a ADM: ADM-R1 e R2-ADM, ambas formadas por uma subunidade principal comum e uma proteína acessória. A subunidade principal é o receptor de calcitonina como receptor (CRLR); a proteína acessória é a proteína do receptor de actividade de modificação de 2 (Ramp2) no ADM-R1 e RAMP3 em ADM-R2 [11].

Uma vez que o cancro do ovário é uma doença que se espalha em um ambiente rico em macrófagos, os quais acredita-se que seja a principal fonte de produção de ADM, neste estudo foram investigados o papel de ADM como um factor de crescimento de células cancerosas e, como um factor de modulação de macrófagos. Embora in vitro percebemos a sua actividade parcial como um fator de promoção do crescimento em células de câncer, em um estudo clínico retrospectivo observou-se que níveis elevados de ADM estão ligados a um resultado positivo e um câncer com baixa expressão CA125.

As células foram deixados em jejum durante 36 horas com ou sem adição de ADM 100 nM, colhidas após 0 (T1), 4 (T2), 8 (T3), e 24 horas (T4), fixadas, coradas com iodeto de propídio e adquiridos utilizando um citofluorímetro . Os dados foram analisados ​​como histograma. Ao traçar contagem de células versus iodeto de propídio (PI) de fluorescência, foi avaliada a percentagem de células em cada fase. Dados a partir de A2780 e células OVCAR-3 isoladamente são mostrados como uma percentagem do total de G1 + G2 + S (A-B). A morte celular foi também avaliada através da análise da fragmentação do ADN incluído no sub-L

0/1 pico (C-D). O efeito da ADM no ciclo celular e na morte celular não é detectável. Esta experiência foi repetida duas vezes com resultados semelhantes.

Resultados

ADM é um fator de crescimento fraco em linhas celulares de cancro do ovário

A fim de avaliar os efeitos da ADM no crescimento de linhas celulares de cancro do ovário OVCAR-3, OVCAR-EPO10, e A2780 e os seus homólogos de paclitaxel-resistentes e células TC1 TC3 foram tratadas com ADM recombinante humana a 1, 10, e 100 nM de concentração de 72 horas. Após a colheita, as células foram contadas. Um efeito modesto no crescimento celular foi observado em algumas linhas de células, tais como A2780, TC1, e células OVCAR-3 (Fig. 1). Depois disso, foi analisado o efeito sobre o ciclo celular após a suplementação com ADM exógeno e privação de soro concomitante. As células foram semeadas em placas de 24 poços e privadas de soro durante 36 horas com ou sem adição de ADM 100 nM. Após 36 horas (T1), 5 × 10

5 células de cada condição foram colhidas e a análise do ADN foi realizada. Para avaliar a recuperação das células, nos outros poços meio foi substituído por meio contendo FBS. As células foram colhidas após 4 (T2), 8 (T3), e 24 horas (T4), e de novo a análise do ADN foi realizada. Percentagem de células em cada fase foi avaliada e os dados representativos são apresentados para as células A2780 e OVCAR-3 (Fig. 2A-B) e para os seus homólogos resistentes a drogas A2780CIS e OVCAR-EPO (Fig. 3 A-B), que são resistentes à cisplatina e patupilone, respectivamente. Um aumento modesto na fase S foi observado nas amostras tratadas com a ADM. fragmentação do ADN, incluindo o sub-L

0/1 pico, também foi avaliada como um indicador da morte celular (Fig. 2 C-D, 3C-D). O efeito de ADM sobre a morte das células não foi detectável. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a ADM possui um papel modesto como um factor de sobrevivência e de crescimento em linhas celulares de cancro do ovário analisados.

As células foram tratadas tal como descrito na Figura 2. Sem efeitos relevantes foram observadas nestes dois célula linhas em termos de modulação do ciclo celular e morte induzida pela ADM. Esta experiência foi repetida duas vezes com resultados semelhantes.

A2780 e células OVCAR-3 foram cultivadas sob condições hipóxicas durante 72 horas com e sem a adição de 100 nM de ADM. RNA extraído a partir de sedimentos celulares foi analisada por qPCR. Em células A2780, que são sensíveis à hipóxia, receptores ADM e ADM foram reprimidos em condições de hipóxia. Em células OVCAR-3, que são menos sensíveis a hipoxia, os receptores de ADM e de ADM foram regulados positivamente (A). A2780, TC1, TC3, OVCAR-3, OVCAR EPO e as células 10 foram cultivadas como descrito acima e contadas. O tratamento com ADM não modular o crescimento de células de cancro do ovário quer em condições normais ou hipóxicos, com a excepção de que na linha OVCAR EPO 10 houve um aumento de 2,4 vezes o crescimento sob condições hipóxicas. células parentais OVCAR-3 foram sensibilizados à hipóxia por ADM. Em comparação com o controlo normóxico, hipoxia reduziu o número de células em cerca de 50%. Bar e erro bares referem-se a média e desvio padrão de 2 experiências independentes realizadas em triplicado

ADM é um Factor de sobrevivência seletiva

O efeito da hipóxia foi investigada em A2780 e OVCAR-3. células (Fig. 4A). Em células A2780, que são sensíveis à hipóxia, receptores ADM e ADM foram reprimidos em condições de hipóxia. Em OVCAR-3, que são mais resistentes à hipóxia, receptores ADM e ADM foram upregulated. A2780, TC1, TC3, OVCAR-3, OVCAR EPO e 10 foram cultivados em condições hipóxicas, com ou sem suplementação de ADM 100 nM (Fig. 4B). Entre as linhas celulares analisados, verificou-se que apenas para OVCAR EPO 10 houve um aumento de 2,4 vezes em condições de hipóxia na presença de ADM, um comportamento diferente a partir da linha celular parental OVCAR-3, que a ADM parecia sensibilizar à hipóxia, desde observou-se apenas a metade do número de células em comparação com o número observado na amostra exposta a hipoxia sem ADM. Não ocorreram alterações relevantes foram detectáveis ​​em outros modelos.

OVCAR-3 (A), OVCAR EPO10 (B), HEY (C), e HEY-EPO8 células (D) foram cultivadas em condições de privação de soro (sem FBS) para um intervalo apropriado (permitindo que apenas cerca de 50% das células para proliferar), com ou sem adição de ADM 50 nM, 100 nM e 500 nM. As contagens de células são apresentados como o número total de células. Notavelmente, a presença de ADM não afectam visivelmente o crescimento celular. Cada barra datapoint e erro refere-se a média e desvio padrão de 2 experiências independentes realizadas em triplicado.

OVCAR-3 (A), OVCAR EPO10 (B), HEY (C), e HEY-EPO8 ( suspensões) de células D a partir da experiência privação de soro foram diluídas e plaqueadas em placas de Petri em 3 mudas de células diferentes por prato. O efeito de ADM sobre a capacidade clonogénica após 14 dias é apresentada como o número de colónias. Apenas HEY células mostrou qualquer efeito adequado de protecção contra privação de soro após o tratamento com ADM neste ensaio, enquanto que os seus homólogos de epotilona-resistentes exibiu o efeito oposto. Bar e as barras de erro referem-se a média e DP de 2 expericias independentes realizadas em triplicado.

De modo a estudar o efeito de tratamentos de ADM em um modelo de stress diferente, as células foram semeadas em placas de 6 poços e privadas de soro. Um período de incubação foi estabelecido após ensaios preliminares (36 horas por HEY e OVCAR EPO10, 48 horas para HEY EPO8, e 60 horas para OVCAR-3). condições de privação de soro por si só, sem ADM, induzida, pelo menos, 50% de inibição do crescimento. ADM foi adicionado a 3 concentrações diferentes (50 nm, 100 nm e 500 nm). Os dados dos ensaios de proliferação em condições de privação de soro são mostrados na Figura 5A-D. As células de cada ensaio foram então plaqueadas em placas de Petri em 3 diferentes densidades de sementeira de células por placa (90, 180, e as células 360 foram semeadas em cada prato de Hey EPO 8, OVCAR-3, e OVCAR EPO10; 150, 300, e 600 células /prato para HEY) e as colónias foram contadas após 14 dias. Tal como acontece com a hipoxia, privação de soro foi eficaz na redução do número de células em ensaios de crescimento de três dias a curto prazo. Um, não modesto aumento estatisticamente significativo foi observado quando a ADM foi adicionado na concentração mais baixa. A fim de avaliar a presença de um efeito protector da ADM no compartimento clonogénicas, após a exposição ao soro fome, as células foram colocadas em placas a diluições limitantes e as colónias contadas após 10-14 dias (Fig. 6A-D). Neste ensaio, apenas na HEY células um efeito consistente de protecção de privação de soro foi observado com o tratamento com ADM, enquanto em outros tipos de células não foram registadas alterações. Tomados em conjunto, estes resultados demonstraram que apenas em algumas linhas celulares foi capaz de mediar a ADM crescimento ou sobrevivência factores.

tipo 1 (A) e tipo 2 (b) os macrófagos foram tratados com a ADM 1 nM, 10 nM, e 100 nM durante 72 horas e contadas. As contagens de células são apresentados como o número absoluto de células. Tipo 2 células cultivadas na presença de ADM alcançado um número de até 3,8 vezes mais elevada do que a contagem de células não tratadas, enquanto que um aumento menor pode ser observada em macrófagos do tipo 1 (1,3 vezes mais elevada com a ADM 10 nM). Expressão de ADM endógena, IL1β, IL6, IL8, IL12, TNFa, IFNγR, CCL22, o TGF-p, IL-10, e IL13Rα foi avaliada por qPCR (C) após o tratamento do tipo 1 e do tipo 2 com macrófagos rhADM 100 nM durante 24 horas. Em ambos os tipos de células, a ADM endógena, IL-12 e TNF-α são regulados positivamente. IL1β e IL8 foram reprimidos enquanto CCL22 é regulada no tipo 2 macrófagos contra o tipo 1. Não há outras diferenças relevantes na expressão das outras citocinas, quimiocinas e receptores foram notados. Bar e erro bares referem-se a média e desvio padrão de 2 experiências independentes realizadas em triplicado.

A análise de Kaplan-Meier de 220 pacientes com câncer ovariano (A) revelou que os níveis de ADM elevados de expressão foram relacionados a um positivo resultado em termos de oS, embora a diferença não alcançou significância estatística (

p

= 0,07). A mesma análise, com um ponto de extremidade final da PFS, revelou a mesma tendência (B), ou seja, pacientes com menor expressão de ADM recaída mais cedo do que aqueles com níveis mais elevados (

p

= 0,01). A análise multivariada mostrou que a idade, estágio clínico, histotipo, ea classificação não foi significativamente relacionada com a expressão ADM, enquanto houve uma forte associação inversa significativa (

p Art 0,001) entre os níveis de CA125 e expressão ADM (C ). Além disso, os níveis de PLK1 o gene, que está relacionado com o número de células na fase M, foram significativamente reduzidas no grupo com baixa expressão ADM (D).

ADM Afecta de monócitos /macrófagos e proliferação diferenciação

uma vez que os macrófagos são fundamentais para a produção de ADM no estroma, tipo 1 (M1) e tipo 2 (M2) macrófagos foram tratados com 3 diferentes concentrações de ADM (1 nm a 10 nm, e 100 nm ) durante 72 horas. As células foram colhidas por tripsinização e contadas. M2 cultivadas na presença de ADM alcançou uma contagem até 3,8 vezes mais elevada do que a contagem de células não tratadas, enquanto que um aumento menor foi observada em M1 (1,3 com ADM 10 nM), o que indica que de alguma forma a ADM foi capaz de modular a diferenciação de macrófagos e proliferação (Fig. 7A). Como confirmação da capacidade da ADM para modular a diferenciação de macrófagos, M1 e M2 foram tratados com a ADM 100 nM durante 24 horas. a expressão do gene da ADM, IL1β, IL6, IL8, IL12, TNFa, IFNR, CCL22, TGF, IL10 e IL13R foi avaliada através de qPCR. A sobre-regulação de ADM endógena foi observada em M1 e M2, bem como a sobre-regulação de IL-12 e TNF-α (Fig. 7B), o que indica que a ADM foi capaz de regular a sua expressão em macrófagos de um modo autócrino. As únicas diferenças observadas na citocina expressão /quimiocinas em resposta a ADM foram downregulation de IL1β e IL8 e regulação positiva de CCL22 em M2 vs. M1.

Níveis elevados de expressão de ADM era um prognóstico positivo factor em pacientes com câncer ovariano

a fim de obter insights sobre o papel da ADM no cancro do ovário, uma coorte clínica de 220 pacientes com câncer ovariano foi analisada retrospectivamente usando um analisador de genética nanofluidic e um chip de 48,48. análise CA125 e amostras dos pacientes foram coletadas em primeira cirurgia, antes de qualquer tratamento. GAPDH serviu como gene de manutenção e os resultados foram normalizados para os níveis de expressão detectados em células OVCAR-3. A descrição dos doentes envolvidos neste estudo está resumido na Tabela 1. A análise preliminar resultados foi realizada utilizando o método de Kaplan-Meier. elevados níveis de expressão de ADM parecem ser ligada a uma melhor sobrevivência, embora a diferença não atingiu significância estatística (

P

= 0,07) (Fig. 8A). A mesma análise, com o seu endpoint final sobrevida livre de progressão (PFS), revelou a mesma tendência (Fig. 8B), com pacientes com menor expressão de ADM recidivante mais cedo do que aqueles com níveis mais elevados (

p = 0,01

). A fim de obter insights sobre estes resultados, empregamos análise multivariada para avaliar os parâmetros clínicos que foram relacionados à ADM expressão. correlação de Spearman foi utilizado para avaliar as relações entre a ADM, CA125 e idade tomado como variáveis ​​contínuas. Não houve correlações significativas foram observadas entre a ADM e idade (

ρ

= -0,008,

p

= 0,91) e CA125 e idade

(ρ

= -0,139,

p

= 0,17), enquanto uma correlação inversa significativa foi encontrada entre CA125 e ADM (

ρ

= -0,23,

p

= 0,003). valores ADM foram também analisadas por tipo histológico e estágio da doença através do teste de Kruskal-Wallis. expressão ADM não se alterou quando comparadas entre histotipos (χ

2 = 5,14,

p

= 0,39) ou estágio clínico (χ

2 = 3,94,

p

= 0,14) . Quando os pacientes foram estratificados em níveis de expressão de altos e baixos, houve novamente uma associação significativa inversa (χ

2 = 10,7,

p Art 0,01) entre os níveis de CA125 e expressão ADM (Fig. 8C) . Estes dados sugerem que tumores com menor expressão de ADM tem uma massa maior do que aqueles com maior expressão ADM. De acordo com esta hipótese, os níveis de PLK1 um factor relacionado com o número de células na fase M-foram também reduziu significativamente (χ

2 = 4,6,

P

= 0,03) no grupo com baixa expressão ADM (Fig. 8D). Estas descobertas sugerem que a elevada expressão de ADM exerce um efeito supressor sobre-crescimento de células de cancro do ovário e é ligada ao resultado positivo. Para avaliar esta hipótese, a análise univariada de Cox, que levou em conta o estágio clínico, histotipo, idade, CA125, ADM e PLK1 (últimos 4 parâmetros foram tomados como variáveis ​​contínuas) foi realizada utilizando tanto OS e PFS como variáveis ​​para desfecho (Tabela 2). Variáveis ​​capazes de prever o resultado na análise univariada foram selecionados para realizar a análise multivariada de Cox. Como relatado anteriormente [12], estágio clínico foi a variável mais importante para predizer o risco de morte em pacientes com câncer de ovário. Este fato foi evidente em ambos OS e análise de PFS em análise uni e multivariada. O endometrioid histotipo era uma característica dos pacientes com um melhor sistema operacional e PFS na análise univariada, um efeito mantido na análise multivariada para OS. Os níveis de expressão elevados de ADM foram relacionados com bom OS e PFS. Este efeito, embora modesto em termos de risco, foi mantida em ambas as análises uni e multivariada, apoiando a hipótese de que os níveis de expressão elevados de ADM são preditivos de resultado positivo em pacientes com câncer de ovário.

Discussão

pré-clínicos forte e translacionais estudos sustentam a hipótese de que os componentes do estroma desempenhar um papel central na condução de um fenótipo tumor agressivo. Neste contexto, a ADM é um péptido regulador ubíqua com diversas funções biológicas, tais como a acção vascular, os efeitos estimulantes do crescimento, e a actividade imuno-moduladora. ADM é altamente expressa em uma variedade de doenças malignas, tais como glioblastoma [13], carcinoma de células claras do rim [14] e cancro pancreático [15]. Em todas estas doenças ADM tem sido considerada um biomarcador de mau resultado. Esta característica da ADM foi atribuída, principalmente, às suas propriedades mitogénicas e a sua capacidade para funcionar como um factor de sobrevivência induzida por hipoxia. Junto com seus efeitos diretos sobre a sobrevivência de células cancerosas “, um fator adicional na agressividade do tumor consiste na capacidade de ADM para estimular angiogênese dentro do tumor. Este mecanismo parece ser particularmente relevante no carcinoma renal de células claras, uma doença caracterizada por vascularização intensificada para dentro do tumor [16]. Poucos relatos estão disponíveis sobre se este fenômeno ocorre em câncer de ovário e sobre a função precisa da ADM nesta doença. Em uma pequena clínica de 60 pacientes com câncer ovariano, usando análise de PCR não quantitativa, em 2000 Hata e colegas relataram que a ADM era um fator preditivo de mau prognóstico [17]. Para além deste relatório, há outros estudos translacionais abordado o papel da ADM no câncer de ovário. Os efeitos da ADM em células de cancro do ovário em culturas in vitro é controversa. Giacalone e colegas relataram que a ADM não foi capaz de estimular o crescimento celular em BG-1, PEO4, e as células de câncer de ovário PEO14 [18]. Por outro lado, um estudo recente relatou que o silenciamento do gene de ADM em HO8910 células de cancro do ovário foi acompanhado por inibição do crescimento e regulação negativa quimiossensibilização através de ERK e de expressão de Bcl-2 [19]. Estes resultados levaram-nos a investigar se a ADM é um factor de sobrevivência mitogénica num painel de células cancerígenas que exibem vários graus de resistência a drogas. Na análise in vitro demonstraram que a ADM mostrou actividade mínima como um factor de crescimento, um efeito que varia de acordo com a linha de células, com um aumento modesto em células na fase S do ciclo celular. A atividade da ADM como um fator de sobrevivência foi acentuadamente diferenciados de acordo com a linha de células. Em células Ei, após privação de soro, houve um aumento consistente no número de células capazes de sobreviver e formação de colónias, enquanto que em outros modelos celulares tal efeito foi quase não detectável. extrema variabilidade foi também observada em termos da resposta a hipoxia. Nesta resposta observou-se uma redução na expressão de ADM e os seus receptores nas células sensíveis a hipoxia, tais como A2780, enquanto em OVCAR-3 foram observadas as tendências opostas. Ao combinar os resultados relatados na literatura e nossos próprios resultados, concluímos que a ADM exerce um efeito modesto como um crescimento e fator de sobrevivência em células de câncer de ovário, com extrema variabilidade dependendo do modelo de células analisadas.

Um relatório recente em melanoma sugeriu que a principal fonte de ADM é macrófagos [6]. Para verificar essa hipótese, analisamos a capacidade de ADM para estimular o crescimento de polarizadas macrófagos M1 e M2. ADM foi capaz de regular a sua produção de forma autócrina e selectivamente aumentada da proliferação de M2, que tem uma baixa de IL-12 /elevados de IL-10 fenótipo, e que exibiram expressão diminuída de intermediários de azoto reactivo, a apresentação de antigénio mais baixa e capacidade tumoricida, e alta expressão de factores angiogénicos, tais como VEGF, EGF, e 4D semaforina [20]. Alta expressão de M2 ​​é, por conseguinte, geralmente associada com um ambiente imunológico que torna o cancro mais agressivo.

Apesar destes resultados in vitro, o nosso estudo translacional revelou, surpreendentemente, que os pacientes com maior expressão do gene de ADM tendem a ter mais PFS e um melhor resultado. Notamos, em particular, uma correlação inversa entre os níveis de ADM e CA125 expressão medido no momento da primeira cirurgia. É comummente aceite que CA125 é um marcador de volume do tumor. No cancro do ovário que responde ao tratamento, uma redução na expressão de CA125 é notável. Os tumores caracterizados por baixos níveis de ADM também exibir maior expressão de PLK1, um marcador de actividade mitótica. Por isso, parece provável que, em pacientes, a ADM exerce, directa ou indirectamente, um efeito supressivo do crescimento-, com uma redução de células na fase M do ciclo celular sugerido pela expressão de PLK1. Em um grande número de estudos, o principal efeito observado in vivo para células estimuladas por ADM foi uma elevação na Camp (revisto em [8]). Os agentes que aumentam cAMP em células de cancro têm sido muitas vezes associada com a inibição da proliferação de células [21], e de diversos fármacos capazes de mimetizar cAMP estão em desenvolvimento clínico como agentes anticancerígenos [22]. Juntamente com um efeito directo sobre as células cancerosas através de AMPc, é também possível que os pacientes com níveis mais elevados de exposição com tumores ADM melhor vascularização, tal como demonstrado no carcinoma renal de células claras [16]. Como o câncer de ovário é uma doença quimiossensíveis na maioria dos pacientes [12] podemos especular que a concentração tecidual de quimioterápicos é aumentada quando os níveis de ADM são elevados, levando a um melhor controle da doença e um intervalo livre de doença.

em resumo, este estudo revelou que embora a ADM pode comportar-se como um factor de crescimento /sobrevivência in vitro, e como um agente capaz de estimular selectivamente M2 polarização, estas propriedades não foram confirmados em pacientes. Assim, este estudo não suporta o uso de antagonistas ADM como uma ferramenta para melhorar a gestão dos pacientes com câncer ovariano.

Materiais e Métodos

linhas celulares e Reagentes

A2780 e OVCAR-3 linhas de células foram obtidas a partir de ATCC. A2780 é uma linha celular de cancro do ovário humano derivada a partir do tecido tumoral de um paciente não tratado. A2780 e A2780 TC1 TC3 são as linhas celulares resistentes a paclitaxel-A2780 obtidos a partir após um tratamento prolongado com ciclosporina e paclitaxel (gentilmente fornecida por Indena). OVCAR EPO10 e HEY EPO8 são epotilona B (EpoB) linhas de células resistentes ao obtidos a partir OVCAR-3 e HEY respectivamente, após tratamento prolongado com EpoB. Todas estas linhas de células foram previamente descritos [23]. As linhas de células foram cultivadas sob condições padrão (37 ° C, 5% de CO

2) em meio RPMI 1640 com glutamina, suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 0,1 mM de MEM aminoácidos não essenciais e 0,1 mg /ml de canamicina. Todos os reagentes foram adquiridos de Sigma-Aldrich se outros vendedores não foram especificados. Experiências em hipóxia foram realizados como previamente descrito [24].

Preparação de Macrófagos de culturas primárias

linfomonócitos foram isolados a partir de buffy coat de um dador saudável por centrifugação de gradiente de densidade utilizando Histopaque-1077 (Sigma -Aldrich) e ressuspensas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro humano AB (Sigma-Aldrich), 100 UI /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina (GIBCO). Cerca de 10

7 linfomonócitos por poço foram semeadas em placas de 6 poços placas de cultura primárias (BD Falcon) e incubadas a 37 ° C, 5% de CO

2 durante 2 horas para permitir que os monócitos (10% a 30%) para aderir ao fundo dos poços. meio de cultura fresco contendo ou 50 ng /mL de GM-CSF humano recombinante ou 50 ng /M-CSF humano recombinante mL (R D Systems) foi adicionada para permitir monócitos para diferenciar para o tipo 1 e tipo 2 macrófagos, respectivamente. Tipo 1 e Tipo 2 macrófagos foram tratados com a ADM recombinante humana (Sigma-Aldrich), em seguida, lavada duas vezes com PBS pré-aquecido. As células foram recolhidas em tubos estéreis e centrifugados para extracção de ARN para a análise ou contados a proliferação celular.

Extração de RNA e transcrição reversa de Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR)

O ARN total foi extraído 1-3 × 10

6 células que utilizam o sistema BioRobot EZ1 (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante. Para a transcrição reversa, foi utilizada a iScript

kit de síntese de ADNc TM (Biorad). análise qPCR foi realizada utilizando o ™ SYBR iQ

® Verde Supermix e o sistema de detecção Opticon 2 Motor DNA (Biorad). Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi usado como gene de manutenção. As sequências dos oligonucleótidos iniciadores estão listados na Tabela 3.

análise do ciclo celular

células de cancro do ovário foram semeadas em placas de 24 poços a 1-5 × 10

4 células /poço. Em algumas condições as células foram privadas (privadas de soro fetal de bovino, ou FBS) na presença de 100 nM de ADM. Os controlos foram representados por células em jejum sem adição de ADM (controlo negativo) e por células cultivadas em meio completo (controlo positivo). Após 36 horas (T1), 5 × 10

5 células de cada condição foram colhidas por tripsinização, recolhidas em tubos de citometria de fluxo, e marcado tal como descrito anteriormente [25]. Cada amostra foi adquirido usando o Cytomics ™ Citómetro de fluxo (Beckman Coulter).

proliferação celular Ensaios

células do cancro do ovário em meio de cultura foram semeadas em placas de 6 cavidades a densidades celulares ideais predeterminados (HEY : 6 × 10

4 /bem, A2780, A2780 TC1, A2780 TC3 e OVCAR EPO10: 8 × 10

4 /poço; OVCAR-3 e HEY EPO8: 10

5 /poço). ADM humano recombinante foi adicionado ao meio após a adesão das células ao fundo dos poços. Após 72 horas, as células flutuantes presentes no sobrenadante foram colhidos. As células aderentes foram tratadas com tripsina-EDTA e recolhidas, em conjunto com os seus sobrenadantes correspondentes. contagem de células totais foram realizadas utilizando um hemocitômetro (câmara Burker, Nalgene). condições de hipóxia foram realizados por incubação das células em uma câmara Billrop.

Em alguns experimentos, ei, ei EPO8, as células OVCAR e OVCAR EPO10 foram cultivadas em condições de fome (sem FBS) para horários predeterminados, com ou sem adição de ADM. O controlo positivo era constituído por células cultivadas em meio completo.

tipo 1 e tipo 2 macrófagos foram tratados com rhADM durante 72 horas, em seguida, colhidas após o tratamento com tripsina-EDTA e contadas numa câmara de Burker.

clonogénicos Assays

Após a contagem OVCAR-3, células OVCAR EPO10, hey, e hey EPO8 de experimentos privação de soro, cada suspensão de células foi diluída em FBS contendo meio a densidades muito baixas celulares.