Abstract

Fundo

desenvolvimento de anticorpos terapêuticos é uma das áreas de maior crescimento da indústria farmacêutica. Geração de anticorpos monoclonais de alta qualidade contra um determinado alvo terapêutico é crucial para o desenvolvimento de drogas bem sucedida. No entanto, devido à tolerância imunológica, tornando difícil para gerar anticorpos utilizando abordagens convencionais.

Metodologia /Apreciação

Mixed quatro câncer gástrico (CG) linhas de células humanas foram utilizados como imunogénio em A /camundongos j; dezesseis altamente colónias de hibridoma positivas foram seleccionados por meio de células activadas por fluorescência de alta throughput screening (FACS-HTS) utilizando um total de 20000 colónias em sessenta e sete placas de 96 poços contra células vivas (células GC humanos mistos versus controlos de PBMC humanos). MS17-57 e controlar comercial de fosfatase alcalina (ALP) mAb foram utilizados para confirmar os antigénios alvo (AGS), que foram identificados como ALP expressa na superfície da célula através de uma combinação de GC de Western blot, imunoprecipitação e espectrometria de massa (MS).

MS identificou os antígenos reconhecidos pelo MS17-57 ser duas variantes de um ALP secretado, PALP e IALP (placentária e ALP intestinal). Estas proteínas pertencem a uma família de enzimas hidrolase responsável pela remoção de grupos fosfato a partir de muitos tipos de moléculas. imunofluorescência usando MS17-57 demonstrou maior coloração de tecidos gastrointestinal (GI) de cancro em comparação com tecidos normais (GI

P

0,03), e confirmados ligação de MS17-57 de ser restrito a um epitopo funcional expressa em superfície da célula do cancro. Os ensaios de proliferação utilizando palpo /IALP-linhas celulares que expressam GC demonstraram que MS17-57 inibiu o crescimento celular em 32 ± 8%. Os ensaios de migração de células Transwell MS17-57 documentado que podem inibir a migração de PALP /IALP-GI expressando células de cancro de 25 ± 5%. MS17-57 mAb inibiu o crescimento do tumor em ratinhos nus.

Conclusões

Nossas descobertas indicam que PALP e IALP pode ser expresso ectopicamente na matriz extracelular de cancros gastrointestinais, e que MS17-57 dirigido contra PALP /IALP pode inibir o crescimento GI células cancerosas e migração

em

vitro

e

em

vivo

. Esta investigação fornece um exemplo de identificação de biomarcadores de câncer que representam alvos terapêuticos promissores utilizando mAb gerado através de uma nova tecnologia HTS

Citation:. Li M, Gao J, Feng R, Wang Y, Chen X, Sun J, et ai. (2013) Generation of Monoclonal Antibody Targeting MS17-57 segregada de fosfatase alcalina ectopicamente expressa na superfície de células de cancro gastrointestinal. PLoS ONE 8 (10): e77398. doi: 10.1371 /journal.pone.0077398

editor: Nikki Pui-yue Lee, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 01 de maio de 2013; Aceito: 03 de setembro de 2013; Publicação: 15 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (números de subvenção 81201596, 81101847, 81172324, 91229106, 31270963); Projectos chave na Science Programa de Tecnologia Coluna de China (2011BA203191); Comissão de Ciência e Tecnologia de Xangai Município (12XD1403700, 12PJ1406300); Fundo de Investigação para o Programa de Doutorado da Educação Superior da China (20110073110071); Projeto chave da Comissão de Educação Xangai (12ZZ105). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Todos os autores são inventores de um pedido de patente pendente sobre os ratos imunizantes, preparando MS17- 57 hibridoma e uso de anticorpo monoclonal MS17-57 para tratamento de câncer. Os autores declaram que dois autores eram funcionários de uma empresa comercial, Xangai MabStar, Inc. Os autores também declarar que MS17-57, bem como o método de rastreio foi submetido para pedido de patente com o título de “Geração de anti-ectopicamente alcalina expressa fosfatase mAb, o seu método e aplicações “(patente pendente), Estado Escritório de propriedade intelectual da República Popular da China (CN201310090565.9). Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento. Os outros quatro mAbs será patenteada e os resultados serão publicados também.

Introdução

Gastrointestinal (GI) o câncer é um dos tumores malignos mais comuns em seres humanos com um alto risco de mortalidade em todo o mundo [1]. O desenvolvimento de anticorpos terapêuticos para investigar, avaliar, prevenir e tratar o câncer é uma das áreas de crescimento mais rápido da investigação, tanto na área acadêmica e da indústria farmacêutica [2]. A geração de anticorpos monoclonais de alta qualidade (mAbs) contra marcadores de cancro como alvos terapêuticos é uma via importante para o desenvolvimento de drogas clínicas. Alguns marcadores de cancro são conhecidos (por exemplo, receptor do factor de crescimento epidérmico humano 2 e factor de crescimento endotelial vascular) ou estão bem desenvolvidos, mas a maioria são ainda desconhecidas ou pouco desenvolvida [3]. Há, portanto, grande interesse em gerar mAb contra alvos novos e desconhecidos cancerosas. mAb contra alvos tumorais específicas podem ser desenvolvidas e identificada utilizando uma variedade de abordagens, incluindo-ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) throughput screening -high (HTS), células activadas por fluorescência (FACS) -HTS, e

in vitro Comprar e

in vivo

triagem.

a identificação de novos biomarcadores de câncer envolvidos na tumorigênese, o desenvolvimento do cancro, ou a prevenção do cancro continua a ser de grande interesse em todo o mundo [4,5]. Devido aos avanços na proteômica e outros aspectos da biologia molecular, tais investigações estão cada vez mais viável na era atual do que no passado. Tecnologia de ponta HTS está relativamente bem desenvolvida e é muito popular em muitos campos acadêmicos [6,7].

Por isso, têm investigado a geração de mAbs contra potencialmente novos antígenos na superfície das células de câncer usando um FACS- método de HTS. Neste estudo, verificou-se que os mAbs MS17-57 poderia identificar placentária e fosfatases alcalinas intestinais (PALP e IALP, respectivamente) como alvos expresso na membrana de células de cancro. A nossa estratégia consistiu em explorar um novo método de FACS-HTS e tecnologia de hibridoma usando uma mistura de 4 linhas de células de cancro gastrointestinal vivos como imunogénio [8], levantando a hipótese de que, pelo menos, algum do mAb produzido seria susceptível de se ligar ao epitopo conformacional (s ) na superfície da célula de células cancerosas gastrointestinais. Os dados demonstraram que MS17-57 poderia vincular a PALP e IALP que foram ectopicamente expressa na superfície da célula, e poderia neutralizar a actividade de ALP ambos

in vitro

e

in vivo

. Estes resultados sugerem que PALP IALP e expressa na superfície do tumor do GI com o metabolismo das células do cancro e via de sinalização aberrante em que eles podem promover o crescimento de células cancerosas e metástases. MS17-57 é um mAb com alta afinidade e especificidade, potencialmente representando um reagente útil e uma base potencial para uma nova estratégia terapêutica no desenvolvimento de medicamento contra o câncer.

Nossos estudos futuros incidirá sobre o mecanismo molecular de MS17-57 inibição da proliferação de células cancerosas e migração através da ligação de PALP /IALP na superfície de células de cancro, e em clarificar as vias de sinalização intracelulares afectadas pela acção deste anticorpo. Presumindo investigações adicionais confirmar os resultados promissores descritas nestas investigações preliminares, engenharia de anticorpos de MS17-57 como um anticorpo quimérico ou humanizado para aplicação terapêutica poderia ser perseguido.

Materiais e Métodos

culturas de células

linhas celulares de cancro GI MKN45, BGC823, SGC7901, MKN28, AGS e GES-1 foram adquiridos a partir do Instituto de Bioquímica e Biologia Celular , Xangai Institutos de Ciências da vida, da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China) ea Bioresource Centro Riken (Tsukuba, Japão). As linhas celulares de cancro gastrointestinal MKN-74 [9] e TMK-1 [9] foram os cortesia do Dr. Gary K. Schwartz (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Nova Iorque, NY, EUA), e células KKLS [10] foram obtidas do Dr. Yukuta Takahashi (Cancer Research Institute, Universidade Kanazawa, Kanazawa, Japão). As linhas celulares de cancro gástrico ST-8 e ST-9 [11] estavam a cortesia de Drs. Bradley McIntyre e Paul F. Mansfield, da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center (Houston, TX, EUA). Todas as outras linhas de células (células SP2 /0, etc.) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram obtidos de um voluntário saudável com consentimento informado.

Excepto para SP2 /0 de mieloma e células de células de hibridoma Acm, todas as células foram cultivadas em MD6, um caseiro, meio isento de soro derivado a partir do meio de Dubecco modificado de Eagle (Gibco BRL, Rockville, MD, EUA) com soro fetal de bovino inactivado pelo calor a 5% (FBS) (Sigma, St. Louis, MO, EUA), 100 unidades /mL de penicilina, e 100 ug /mL estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). As células de mieloma e hibridoma foram cultivadas de forma semelhante mas sem soro bovino fetal. As células de mieloma e hibridoma foram cultivadas em suspensão. células cancerosas GI foram cultivadas a aderir a frascos de cultura de tecidos com meio 5% FBS /MD6.

tecidos de pacientes

espécimes tumorais frescas e tecidos não cancerosos adjacentes (mucosa) de sete pacientes submetidos a cirurgia foram GC obtido a partir do Departamento de Cirurgia da Shanghai Ruijing Hospital em Xangai, China. Estes pacientes não tinham recebido quimioterapia citotóxica ou radioterapia antes da cirurgia. protocolos Institutional Review Board foram observados, e aprovação ética para o estudo foi concedido pelo Comitê de Ética em Pesquisa Ruijing Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes (incluindo os doadores voluntários) envolvidos no estudo.

tecidos frescos foram coradas com MS17-57, bem como mAb de controlo de isotipo. Os sinais de ligação foram amplificados, marcado com isotiocianato de fluoresceína, e contadas por FACS-HTS.

Ratos

ratos macho A /J (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, EUA) 6- 8 semanas de idade foram adquiridos a partir da Nanjing Experimental Modelo Centro animal, Universidade de Nanjing, Nanjing, China, e mantidos ao biotério de Shanghai MabStar, Shanghai, China. A manutenção de camundongos A /J e procedimentos experimentais foram aprovados pelo Shanghai Bem-Estar Animal e do Comitê de Ética em Pesquisa, Ciência e Tecnologia Comitê de Shanghai Governo Municipal, a China e o número de licença é SYXK (Hu) 2009-0087.

ratinhos nus Masculino JAX com idades entre 4-8 semanas foram adquiridos a partir de Xangai Experimental Modelo Centro animal e mantida no Centro Experimental animal de Shanghai Ruijing Hospital. Estes ratinhos nus foram usadas para experiências com xenoenxertos de cancro gástrico humano (CG) e os métodos são semelhantes aos do grupo Sela previamente descrito [12]. A manutenção de JAX ratos pelados e procedimentos experimentais foram aprovados pelo Shanghai Bem-Estar Animal e do Comitê de Ética em Pesquisa, Ciência e Tecnologia Comissão de Governo Municipal de Xangai, China e o número de licença é SYXK (Hu) 2.011-0.113.

Ao vivo Cancer Cell Imunização

Cada Um camundongos /J foi injetado subcutaneamente a 5-10 sites, bem como uma vez por via intraperitoneal (ip) com cerca de 5-10×10

6 células (quantidades iguais de MKN45, BGC823, SGC7901, e células MKN28) em solução salina tamponada com fosfato (PBS; pH 7,4). Três ratos foram distribuídos por lote experimental. Duas semanas mais tarde, os ratinhos foram injectados uma vez, para um total de três imunizações, além de uma injecção i.p. impulsionador três dias antes do experimento de fusão

Três dias após o reforço, as células do baço foram coletados por meio de cirurgia de um rato imunizado sacrificados por CO

2 inalação e todos os esforços foram tomadas para reduzir o sofrimento dos animais.; as células do baço foram então fundidas com células de mieloma SP2 0 /[13,14] em solução de polietileno-glicol (pH 7,4) 50% de fusão para gerar hibridomas mAb. As células de hibridoma fundidas foram mantidas em hipoxantina-aminopterina-timidina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), e 280 ul /poço de células fundidas (cerca de 1-2 x 10

4 células de baço /poço) foram divididas em alíquotas em placas de cultura de sessenta e sete de 96 poços de fundo plano de tecidos e incubadas a 37 ° C numa incubadora com 5% de CO

2 durante 10 dias. Ao mesmo tempo, as quatro linhas celulares de cancro do GI foram cultivadas em grandes quantidades em vários frascos.

celular activadas por fluorescência com high-throughput screening (FACS HTS)

O sistema FACSCalibur-HTS (Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA) foi utilizado para pesquisar os hibridomas seletivos a partir de grandes quantidades de fusão células /colónias nas placas de fusão. Até 200 rastreio e contador de rastreio (células cancerosas em comparação com as células normais) placas pode ser usado num ensaio de triagem tal. As células de todas as quatro linhas de GC foram recolhidas, misturadas, e aliquotas (cerca de 1×10

6 células /poço) em placas de 96 poços de fundo em U (67 placas) .O mesmo número de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) a partir de um voluntário saudável foram separados por utilização da solução de separação de linfócitos humanos de Ficoll-Plaque Plus (GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, PA, EUA) e divididas em alíquotas em placas de 96 poços de fundo em U (mais 67 placas para contador de rastreio). O sobrenadante (80 uL /​​poço) a partir de cada uma das placas de fusão 67 foi transferida para placas de células marcadas GC 1-67 após estas células tinham sido bloqueadas por 2,0% de albumina de soro bovino (BSA) /tampão de bloqueio PBS nas placas. O sobrenadante a partir das mesmas placas de fusão foram igualmente transferidas para placas de PBMC. Após a célula GC e placas de PBMC foram lavadas três vezes com tampão de bloqueio, o anticorpo secundário [cabra anti-ratinho de imunoglobulina G (IgG) Fe conjugada com isotiocianato de fluoresceína] foi aliquotado em ambas as placas da célula de GC e placas de PBMC (100 pL /poço) e incubou-se em gelo ou num refrigerador a 4 ° C durante 30 minutos, e lavadas novamente três vezes com tampão de bloqueio. As células fluorescentes coradas foram fixadas em paraformaldeído a 1,5% /PBS. A percentagem de deslocamento do pico de células coradas e intensidade de fluorescência média (IFM) foram continuamente monitorizados pelo sistema FACS-HTS para rastreio 134 e contra-rastreio de placas de 96 poços de fundo em U. colónias de hibridoma que exibem forte ligação e especificidade para células GC (e sem ligação a PBMC) foram selecionados para o crescimento expansivo, desmamados do meio condicionado, e subclonado.

mAb Geração

Os sobrenadantes foram recolhidos a partir do clones de hibridoma seleccionados e utilizando proteína-A Sepharose colunas purificadas (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Nós escolhemos o mAb MS17-57 purificada para análise adicional, o qual foi filtrado através de uma membrana de 0,2 um, esterilizado, e divididas em alíquotas em tubos criogénicos mantidas a 4 ° C para utilização em culturas de células ou

In vivo

estudos (descrito abaixo). A mistura de mAb em PBS e 50% de glicerol foi congelado a -20 ° C para armazenamento a longo prazo.

IgG de ratinho de isotipagem

Foi utilizado um kit de isotipagem de mAb de rato (IsoStrip, RochePharma AG , Reinach, Suíça) para caracterizar o isótipo do MS17-57 mAb de ratinho (IgG).

cDNA Sequenciamento da região variável da MS17-57

Foi utilizado um kit RNeasy (Qiagen, Valência, CA, EUA) para isolar o ARN total a partir de células de hibridoma MS17-57. A biblioteca de ADNc foi criada a partir de MS17-57 ARNm em reacções de transcrição reversa com um kit de SuperScript III da primeira cadeia (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA). As regiões variáveis ​​de IgG MS17-57 fragmento Fab de ligação a Ag foram amplificadas por reacção em cadeia da polimerase (PCR) com 21 pares de cadeia pesada-cadeia leve e iniciadores, os quais foram obtidos a partir da biblioteca de IgG de rato conjunto de iniciadores (Progen Biotechnik, Heidelberg, Alemanha). Os produtos de PCR foram usados ​​para a sequenciação de ADN, que foi realizada pelo Lee laboratório Lu no MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, EUA. regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e regiões de estrutura (FWRs) de MS17-57 foram identificados utilizando recursos disponíveis no Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia sites e determinar os alinhamentos de cDNA e sequências de aminoácidos [15-18].

Indirecto ELISA

Ag (proteína) (0,2 ug /ml em PBS) foi revestida sobre Immulon II-HB placas de 96 poços de ELISA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) e incubou-se em um molhado -Box durante a noite à temperatura ambiente (RT). Ag placas revestidas foram lavadas e bloqueadas por /PBS-Tween 20 (PBST) tampão de 1,0% de BSA, e 100 uL de anticorpos primários diluídos individualmente em 1,0% de BSA /PBST foram adicionados a cada poço. As placas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente e lavada com PBST. Após lavagem, 100 uL de diluído (1: 2500) com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated de cabra anti-rato IgG Fe de anticorpo policlonal secundário (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, EUA) foi adicionado a cada poço e incubou-se durante 1 hora à TA. Após uma lavagem adicional com PBST, 150 ul de substrato de peroxidase (tetrametilbenzidina em 0,02 M [pH 6,0] tampão citrato /acetato de e 0,003% H

2O

2) foi adicionado a cada poço para desenvolver a coloração de se ligar sinais; desenvolvimento foi parado por adição de 50 uL de 0,2 M de H

2SO

4 a cada poço. A absorvância (densidade óptica; OD) das placas de reacção foi lida a 450 nm com a referência definido turbidez a 620 nm.

Análise Immuocytochemical com Cytospin Slides

Para fazer 1×10

6 células GC em 50 mL /cada, buracos câmara de Cytospin foram girados em lâminas e fixadas com paraformaldeído a 4% /solução de PBS, desidratado com 70% de etanol e seco ao ar. As lâminas foram re-hidratadas em PBST numa posição plana durante 5 minutos e, em seguida, incubado em soro de cabra a 10% /PBS. As lâminas foram incubadas com anticorpos primários a uma diluição adequada, durante 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C, lavadas duas vezes em PBST, durante 5 minutos cada /em uma posição horizontal. As lâminas foram então incubadas com o anticorpo secundário marcado com HRP (anticorpo de cabra anti-rato IgG Fc-HRP, Jackson ImmunoResearch Laboratories) a 1: 500 de diluição em PBS durante 30 minutos à TA. Detecção a coloração de mAb em células de cancro foi realizada com 0,125% de substrato cromogénico aminoetilcarbazole durante 5-10 minutos à temperatura ambiente, e as lâminas Cytospin mAb coradas foram contrastadas com hematoxilina de Gill (Dako, Carpinteria, CA, EUA). Anti-fade meio de montagem (Vector Labs, Burlingame, CA, EUA) foi utilizado para montar os slides.

Cancer Cell Proliferação Ensaio de Inibição de

O ensaio de inibição da proliferação de células cancerígenas foi realizado utilizando contagem celular kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Santa Clara, CA, EUA) e foi baseado na detecção da actividade de desidrogenase em células viáveis. Um total de 5.000 células /150 ul de BGC823 seleccionado, MKN45, ou ambos os tipos de células a partir de linhas de células de 4 GC utilizados na imunização, foi dispensado em cada poço de placas de 96 poços para cada uma das condições de ensaio quadruplicou. As placas foram pré-incubadas durante 24 horas numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO

2. 50 mAbs ul /poço de MS17-57 (8 e 2 ug /mL), um irrelevante (controlo do isotipo) (30 e 8 ug /ml) e um meio sozinho (controlo em branco) foi adicionado às placas de ensaio em quadruplicado para reduzir variação. As placas de teste foram incubadas utilizando as mesmas condições que a pré-incubação. CCK-8 solução foi adicionado às placas (10 uL /​​poço), feita como uma placa por cada condição de ensaio por dia nos dias 1 a 7. As placas foram incubadas durante 3 horas e a absorvência a 450 nm foi medida utilizando um VERSAmax leitor de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA).

cancer Cell Migration ensaio de inibição de

a inibição da migração de células cancerosas quimiotático foi avaliada utilizando o ensaio de migração celular colorimétrico QCM de 24 poços ( Merck Millipore, Billerica, MA, EUA). À TA, 300 mL da suspensão de células (

5 células /ml em MD6 1,0 x 10), com ou sem a cada 5, 10, e 20 ug /mL de mAbs MS17-57 mais irrelevantes adicionados a cada inserção, foi adicionada para cada um dos 24 poços da câmara de migração, e 500 uL de MD6 com soro fetal bovino a 5% foi adicionado a cada poço da câmara inferior. As placas de teste foram incubadas numa incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C com 5% de CO

2 durante 24 horas, e a migração de células não foram suavemente removido do interior das pastilhas com uma cotonete. As células na superfície inferior da membrana foram coradas por imersão das pastilhas em violeta de cristal (um corante nucleico) de solução corante (500 uL /​​poço) durante 20 minutos. As inserções foram enxaguadas em água várias vezes, deixadas secar ao ar e fotografados. As células foram tingidas divididas em alíquotas em placas de 96 poços e contadas por VERSAmax leitor de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA).

crescimento de tumores em ratinhos Balb /c nu

A actividade antitumoral do MS17-57 foi estudada com xenoenxertos de GC humano em ratinhos nus Balb /C, tal como previamente descrito [12]. Resumidamente, 1 x 10 i.p.

6 seleccionado BGC823 ou em células MKN45 MD6 com ou sem MS17-57 mais mAb irrelevante foram injectados em cada rato. Esta injecção de tumores em todos os ratinhos produzido por 6 semanas após o implante celular, e o peso do nódulo de tumor de cada um era de cerca de 0,3-1,0 gramas, o que depende de como muitas células iniciais foram inoculados. O tratamento com MS17-57, mAb irrelevante, e de PBS (como controlos em branco médio) (todos ip) começou no dia após a injecção de células de cancro (isto é, no dia 1) e foi repetido nos dias 15 e 29. Cada grupo de tratamento consistia em, pelo menos quatro animais. O número de nódulos tumorais foi contado, e o diâmetro do nódulo foi medido uma vez. Os ratos foram sacrificados por inalação de CO2 no dia 48 e todos os esforços foram feitos para amenizar o sofrimento dos animais.

A imunoprecipitação (IP) e Espectrometria de Massa (MS) Análise

Para IP indirecta, Dynabeads magnéticas revestidas com proteína-A (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA) foram incubadas com 50? g de MS17-57 durante 30 minutos à temperatura ambiente com agitação constante. As pérolas foram então lavadas e incubadas com lisado de selecionados BGC823 ou MKN45 GC células, o que os lisados ​​foram diluídos apropriadamente. A incubação ocorreu na presença de 0,1% de Triton X-100 no ensaio de radioimunoprecipitação extractos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). mAb contra o anti-β-actina (cerca de 42 kDa em electroforese em gel de dodecil de sódio [SDS-PAGE] em gel de poliacrilamida) foi usado como um padrão de calibração interna. O lisado foi sucessivamente expostos a esferas MS17-57-revestidas durante 30 minutos com rotação. esferas ligadas foram lavadas com 0,5% de Triton X-100 seguido de água. As amostras foram eluídas por aquecimento em água fervida com 50 uL /​​cada eluato de Laemmli tampão de amostra desnaturante (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Em seguida, as amostras foram carregadas e separados em 10% de gel de Bis-Tris (Bio-Rad) em 1 × 2 – (

N

-morfolino) etanossulfónico tampão de corrida e SDS-PAGE. O gel foi corado com um kit de coloração com prata (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA). As bandas coradas foram cortadas alvo e analisadas com um sistema de série ProteinChip 4000 (Enterprise Edition) espectrómetro de massa (Bio-Rad).

IP directa foi realizada utilizando o kit de acoplamento de anticorpo Dynabeads (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA) para diretamente par as contas com MS17-57. Os restantes passos foram os mesmos como descritos para o IP indirecta.

Expressão de ARNm por transcrição reversa quantitativo (qRT) Análise -PCR

A extracção de ARN total de 10 linhas celulares de cancro foi realizada com GI TRIzol reagente (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA) [19]. O ARN foi quantificado utilizando a razão de absorção A260 /A280 nm. Para converter o ARN em ADNc, um 1 mL da amostra de RNA total foi usada numa reacção de transcrição reversa com inibidor de RNase (Invitrogen), SuperScript III transcriptase reversa (Invitrogen), ditiotreitol, e tampão da primeira cadeia. As misturas das amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 10 minutos e depois a 42 ° C durante 50 minutos. A reacção foi desactivada a 70 ° C durante 15 minutos.

Os iniciadores frente e para trás de IALP, PALP, e da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (5′-TCCATCTTCGGGTTGGCCCCC-3 ‘e 5’-3-TCCGTGGGTCTCGGACGACAG ‘; 5′-CCTGGGTGCTGCTCCTGCTGGG-3′ e 5’-CGTAGACACCCCCATCCCGTCAC-3 ‘e 5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3′ e 5’-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 ‘, respectivamente) foram sintetizados e utilizados numa reacção em tempo real PCR com SYBR reagentes verdes (Life Science, Hercules, CA, EUA) e carregou-se numa placa de 96 poços. A mistura de amostras foi executado em um tempo real do sistema de detecção de PCR CFX96 toque (Bio-Rad) de acordo com as seguintes condições: 93 ° C durante 2 minutos, para pré-desnaturação, 93 ° C durante 1 minuto para desnaturação, 55 ° C durante 1 min para emparelhamento, 72 ° C durante 1 min para a extensão em 40 ciclos, a 72 ° C durante 7 min para a incubação final. Os dados foram analisados ​​usando o software Opticon Monitor (Ciência da Vida, Hercules, CA, EUA).

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS (IBM). Os dados foram expressos como média ± erro padrão das médias. As diferenças foram analisadas pelo teste t de Student;

P

valores 0,05 foram considerados significativos

Resultados

MS17-57 Hibridoma foi gerada por imunização com células GC Vivo

Seguindo os princípios. geração de mAb [10], foi utilizada uma mistura de células MKN45, BGC823, SGC7901, e MKN28 GC vivo como imunogénio para a imunização a /J ratinhos três vezes. Antes de o reforço final, o soro de um rabo-de purga de cada ratinho imunizado foi recolhido. células SGC7901 e BGC823 foram selecionados aleatoriamente a partir das quatro linhas celulares GC que foram usadas na imunização de células vivas. PBMCs humanas isoladas a partir de sangue total de um dador saudável foram usadas como um controlo não canceroso. GC células humanas e as PBMC foram ligados com soro de ratinhos imunizados cada um e com soro de ratinho não imunizado para o controlo (Figura 1). Todos os três ratinhos em cada grupo de linha de células exibiram sinais para as linhas celulares e PBMC GC ligação, embora PBMC teve sinais relativamente fracos.

PBMCs humanas foram isoladas a partir de sangue total de um dador saudável seleccionado para controlo celular normal. MKN45, BGC823, SGC7901, e MKN28 células foram usadas em experiências, mas as linhas de células e SGC7901 BGC823 foram seleccionados aleatoriamente como exemplos nesta figura. O MFI foram maiores nestas células do que em PBMC. Todos os três ratos exibiram fortes respostas imunes às linhas de células GC humanos.

As células de baço de quatro linhas celulares GC humanos camundongos imunizados foram fundidos com SP2 0 células /rato de mieloma para gerar o hibridoma de anticorpos. FACS-HTS foi usada para o rastreio de ligação mais forte Ag de um grande conjunto de ligantes (isto é, os mAbs) no repertório de hibridoma. Os mAb liga-se principalmente aos epitopos conformacionais na superfície de células cancerosas vivas. Utilizando FACS-HTS, que seleccionaram-se colónias de hibridoma com sinais fortes de ligação utilizando um total de 20000 colónias em sessenta e sete placas de 96 poços contra as células vivas GC mistos e PBMCs humanas normais (contador de células de controlo). Depois destas células de hibridoma foram desmamados do meio de selecção, foram selecionados os cinco hibridomas com os maiores sinais de ligação para subclonagem e purificação por afinidade de anticorpos. Nós escolhemos o clone MS17-57 para um estudo mais aprofundado. (Os outros quatro mAbs será avaliada em uma data posterior.)

MS17-57 Caracterização

Nós caracterizado MS17-57 mAb com uma variedade de métodos. Informação sobre IgG1 para a cadeia pesada e κ para a cadeia leve foi obtido a partir de isotipagem de anticorpos do rato [20]. As regiões variáveis ​​de cadeia leve (cadeia pesada) e do fragmento Fab de MS17-57 foram sequenciados para ácidos de ADN e de aminoácidos (Figura 2). As regiões de ligação únicas Ag demonstrou que as CDRs entre os FWRs das cadeias leve e pesada estavam presentes na região variável do fragmento Fab como a identidade MS17-57.

FWRs estão localizados entre as CDR.

MS17-57 Encadernação aos lisados ​​de células cancerosas GI

para definir algumas características biológicas de MS17-57 mAb, lisados ​​de MKN45, BGC823 e GES-1 linhas de células (o último gerado e imortalizadas a partir de células da mucosa do estômago normais e transformadas com vírus de símio 40) [21] foram revestidos individualmente em placas de ELISA. O MS17-57 purificado adicionados na placa e secundário, anticorpo-HRP amplificado os sinais de ligação (Figura 3). Este ELISA indirecta mostrou que MS17-57 ainda poderia ligar-se especificamente ao alvo desnaturado (s) de proteína de membrana de célula a partir dos lisados ​​celulares de cancro. células MKN45 expressa o alvo MS17-57 em um nível mais elevado do que BGC823 ou GES-1 células fizeram, indicando que os níveis de expressão de destino pode ser diferente entre as linhas celulares.

células MKN45, BGC823, SGC7901 e MKN28 foram utilizados em experimentos, mas linhas celulares MKN45 e BGC823 foram selecionados aleatoriamente como exemplos neste figura. MS17-57 expressa sinais fortes de ligação a células MKN45 e sinais de ligação moderada para BGC823 células e GES-1 células. Os lisados ​​celulares foram revestidas com 1,0 ug /mL de PBS para Immulon II-HB placas de 96 poços de ELISA (100 ul /poço). As concentrações de proteína destes lisados ​​celulares foram equilibradas, mas não para os alvos de ligação (AGS) que pode ser uma grande variação. Irrelevante mAb foi utilizado como um controlo de isotipo.

Localização de MS17-57 alvos em células de câncer

MS17-57 ligado a todas as linhas de células de quatro GC utilizadas para a imunização, embora a ligação os sinais não eram de igual intensidade (Figura 4A). O nível de MS17-57 alvo expressão foi maior em células MKN45 e mais baixa em células SGC7901. Semelhante aos resultados contra-rastreio, MS17-57 mAb não se ligou a PBMC humanos. Ela se liga a outros tipos de células GC (Figura 4B), mas não para células GI (Figura 4C). Assim, o alvo (s) de MS17-57 não são universalmente expresso, embora eles parecem ser mais comuns em células GC do que as células gastrointestinais.

A.MS17-57 ligado a todas as linhas de células de quatro GC que eram utilizado para a imunização de células vivas. B. MS17-57 exibiu sinais de ligação fortes em GES-1 e células AGS, mas nenhum sinal obrigatório em PBMC humanos. C. MS17-57 não se ligou a PBMC humanas nem qualquer um dos cinco células de tumor gastrointestinal. MAb irrelevante foi utilizado como o controlo de isotipo de mAb.

tecidos tumorais frescas e tecidos não cancerosos adjacentes de seis pacientes do GC foram coradas para MS17-57 e mAb isotipo de controlo e, em seguida quantificado com dose-dependentes obrigatório em FACS HTS. Em geral, o sinal de ligação de MS17-57 foi mais forte em tecidos tumorais do que em tecidos cancerosos (

P

0,03) (Tabela 1 e Figura 5). Esta experiência demonstrou que MS17-57 pode ligar aos seus alvos na sua forma nativa na superfície das amostras de tumor frescas.

Paciente GC

Tissue

mAb

IMF

% corado Pico

A subtração MFI

2

Normalizada MFI

3

Patient-1TumorIsotype Ctrl6.150.5113.0611.56MS17-5719.2118.23NormalIsotype Ctrl11.620.3215.898.76MS17-5727.5111.58Patient-2TumorIsotype Ctrl10.962.836.155.78MS17- 5717.1111.94NormalIsotype Ctrl28.3110.48-12.592.06MS17-5715.728.26Patient-3 * TumorIsotype Ctrl —- MS17-57 – NormalIsotype Ctrl —- MS17-57 – paciente-4TumorIsotype Ctrl3.760.18.2711.83MS17-5712.0313