Abstract

O prognóstico extremamente sombrio de câncer pancreático (PC) é atribuída, pelo menos em parte, à falta de diagnóstico precoce. Portanto, a identificação de genes expressos diferencialmente em vários passos de tumorigénese de PC é de grande interesse. No presente estudo, um 7,12-dimethylbenzanthraene (DMBA) modelo PC induzida foi estabelecida em ratos Sprague-Dawley do sexo masculino. O perfil de expressão do gene foi rastreada utilizando uma micromatriz oligonucleótido, seguido de reacção em cadeia da polimerase em tempo real quantitativo (qRT-PCR) e validação de coloração imuno-histoquímica. Um total de 661 genes expressos diferencialmente foram identificados em fases de carcinogénese pancreática. De acordo com a GO classificação, estes genes estavam envolvidos em várias vias moleculares. Usando dois sentidos análise de agrupamento hierárquico, pâncreas normal, pancreatite aguda e crónica, PanIN, precoce e avançado cancro pancreático foram completamente discriminados. Além disso, 11 regulada e 142 genes regulados negativamente (sondas) foram encontrados por tendência Mann-Kendall teste Monocromático, indicando genes homólogos de rato e humano. A análise imuno-histoquímica de CXCR7 e UBE2C, dois dos genes identificados, qRT-PCR e confirmaram os resultados de microarray. Em linhas celulares PC humanos, knockdown de CXCR7 resultou na diminuição da migração e invasão. Coletivamente, os nossos dados identificaram vários marcadores promissores e alvos terapêuticos de PC com base em uma análise exaustiva e validação sistémica

Citation:. Guo JC, Li J, Yang YC, Zhou L, Zhang TP, Zhao YP (2013) oligonucleotídeo Microarray Identifica genes diferencialmente expressos durante Tumorigênese de câncer pancreático Induzido por DMBA em ratos. PLoS ONE 8 (12): e82910. doi: 10.1371 /journal.pone.0082910

editor: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de agosto de 2013; Aceito: 29 de outubro de 2013; Publicação: 23 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Guo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiada pelo fundo especial de investigação para a indústria do bem-estar público da saúde, a pesquisa translacional do diagnóstico precoce e tratamento abrangente no câncer de pâncreas (número 201202007). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer de pâncreas (PC) é um tumor maligno sólido humana com prognóstico muito pobre [1]. Vários fatores clínicos e patológicos para PC foram identificados, incluindo estágio T, linfonodo /metástases à distância, antígeno de carboidrato (CA) 19-9 nível e perineural /invasão intraneural; No entanto, os factores que afectam o prognóstico de PC devem ser esclarecidas [2], [3], [4], [5]. Além disso, os eventos moleculares envolvidos na patogênese e progressão de PC, como a mutação Kras, foram descobertos como pontos quentes [1]. No entanto, é necessária mais investigação identificar os factores celulares que afectam prognóstico.

Uma das principais desvantagens dos estudos anteriores em amostras humanas e linhas celulares é a dificuldade de recolher amostras de todas as fases de tumorigénese. Por conseguinte, os modelos animais apresentar vantagens únicas neste aspecto. Os indutores químicos do PC incluem N-nitrosobis (2-oxopropil) amina, azaserina, e 7,12-dimetilbenzantraceno (DMBA) [6], [7], [8], [9], [10]. Estes modelos podem induzir a toda a gama de carcinogénese, por meio de fase avançada e metástase. DMBA tem sido amplamente utilizada no estabelecimento de modelos de PC rat [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Nos nossos estudos anteriores, verificou-se que as células acinares podem transdiferenciar de células ductais no processo de tumorigénese no modelo de PC de rato induzido por DMBA [18]. Hoje em dia, a noção ea importância da acinar a metaplasia ductal (ADM) foram gradualmente aceite [19]. Estudos anteriores examinaram várias características destes modelos de PC, incluindo histológicas características /histoquímica [11], [12], [14], alto teor de gordura /dieta de alta proteína como um promotor da carcinogênese [13], o metabolismo da glicose [15] , e alterações em várias proteínas [16]. Uma recente investigação realizada análise proteômica no modelo de PC ratos [17]. Até agora, o rastreio de genes diferencialmente expressos neste modelo não foi relatada.

No presente estudo, o nosso objectivo foi examinar genes diferencialmente expressos em PC, utilizando o modelo de rato PC induzidos por DMBA.

Materiais e Métodos

Animais

Adulto Sprague-Dawley (SD) ratos foram fornecidos pelo Centro Experimental animal, Peking College Hospital Union Medical, Beijing, China. Os ratos foram alojados em condições normais, incluindo um ambiente livre de patógenos e livre acesso a alimentos e água potável. amostras de urina de vinte e quatro horas foram coletadas com gaiolas metabólicas em que foi fornecidas apenas água, mas não comida. A Institutional Animal Care e do Comitê Use em Pequim College Hospital Union Medical aprovado especificamente este estudo e o uso de ratos. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Estabelecimento de PC Modelo induzida por DMBA em ratos

O modelo de PC induzida por DMBA foi criada em ratos SD machos de acordo com o nosso método anterior [14]. Um total de 75 ratos foram divididos em grupos experimentais simulados, controlo e. DMBA ou cristais de NaCl (5 mg) foram utilizados para ratos nos grupos experimental e controle, respectivamente, ao passo que nenhum agente foi aplicado no grupo sham. Nos grupos experimentais e de controle, os ratos foram sacrificados aos 7 dias, 2 semanas, 1 mês e 3 meses após o implante. Cinco ratos no grupo de placebo foram sacrificados a 1 mês. Agrupamento de todos os ratos é mostrada na Tabela 1.

Extração de RNA e Análise de Microarray

O ARN total foi extraído a partir de -80 ° C amostras de tecidos congelados de pâncreas recolhidos em todos os pontos de tempo usando o mini kit RNeasy (Qiagen, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração total de amostra de ARN e a pureza foram examinados e estimado por medições de densidade óptica a 260/280 nm utilizando um espectrofotómetro NanoDrop e electroforese em gel de agarose. Os dados de medição e a avaliação da qualidade detalhado é mostrado na Tabela 2. O kit de transcrição reversa Superscript II (Invitrogen, EUA), kit de Genechip (Affymetrix, EUA) e um ciclo de etiquetagem alvo e reagentes de controlo (Affymetrix) foram também utilizados nas análises . A hibridação foi realizada usando a expressão Rato Genechip Definir 230 (Affymetrix), de acordo com as instruções do fabricante. análises de expressão de genes foram realizadas utilizando o Affymetrix Rat Genome 230 A array (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA). Sequências utilizadas na concepção da matriz foram seleccionados a partir de GenBank, dbEST e RefSeq. gene chip 230 A contém um total de 15166 conjuntos de sondas representando cerca de 4700 genes de ratos conhecidas e 10460 não anotadas etiquetas de seqüências expressas. O número de acesso no GEO é GPL1355.

quantitativa transcrição reversa Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR)

O RNA total foi extraído utilizando TRIzol (Invitrogen). A transcrição reversa foi realizada utilizando o kit de transcrição reversa Superscript II (Invitrogen, EUA). O TaqTM R-PCR SYBR Green I kit (Takara, Tóquio, Japão) foi usada para PCR. etapas de amplificação foram como se segue: 95 ° C durante 30 s (pré-desnaturação), e 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s e 61 ° C durante 31 s. Beta-actina foi designado como o controlo interno. Todas as experiências foram repetidas três vezes. Primers estão listadas na Tabela 3.

A imuno-histoquímica e coloração Avaliação

Os anticorpos contra CXCR7 e UBE2C foram comprados formulário de R D e Abnova, respectivamente, e o kit de coloração de duas etapas PowerVisionTM (PV-9000) era de Beijing Zhongshan Biotech Co., China. Resumidamente, os cortes foram montados, desparafinadas por xileno e re-hidratadas por etanol. A recuperação de antígenos foi realizada por microondas amostras durante 3 min. Após o bloqueio da peroxidase endógena, as lâminas foram então incubadas durante a noite a 4 ° C com o anticorpo primário a uma diluição de 1:200. Após lavagem em solução salina tamponada com fosfato (PBS), as lâminas foram incubadas com peroxidase de rábano (HRP) marcado com anticorpo secundário por 30 minutos à temperatura ambiente. Diaminobenzidina foi utilizada como um cromogénio. Finalmente, as lâminas foram contrastadas com hematoxilina. coloração castanha no citoplasma ou no núcleo foi definida como um sinal positivo. A percentagem de proporção de células coradas positivas coloração mais do que 50% foi classificada como um forte sinal positivo.

Cultura de Células e Queda de CXCR7

Duas linhas celulares de cancro pancreático humano (PANC-1 e SU86.86) foram presentes amáveis ​​de Professor Helmut Freiss, Universidade de Heidelberg, Alemanha [20], [21]. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 e meio DMEM. com 10% de soro fetal de bovino (Invitrogen) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2. As células cultivadas em placas de 6 poços foram transfectadas com CXCR7 ou controlo (mistura) pequeno ARN interferente ambos na concentração de 40 nM utilizando Lipofectamina RNAiMax (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. O CXCR7 ARNi foi adquirido a Invitrogen e a sequência é a seguinte: AGAUGUAGCAGUGCGUGUCAUAGCC

Western Blotting

As células foram lavadas com PBS e recolhidas por raspagem em tubos individuais.. As proteínas foram extraídas de acordo com protocolos de extracção de proteína, e as concentrações de proteína foram determinadas utilizando o kit de ensaio de proteínas Pierce BCA (Thermo Scientific, Meridian Rd, Rockford). Os extractos de proteína (80 pg /pista) foram sujeitas a electroforese em géis de poliacrilamida a 10% (SDS-PAGE) seguido de transferência para membranas de PVDF e o bloqueio com leite seco não gordo a 5% durante 2 h. As membranas foram incubadas com o anticorpo primário contra CXCR7 (Abgent, San Diego, CA) durante a noite a 4 ° C. O anticorpo secundário (anti-IgG de coelho) foi incubada durante 1 h a 37 ° C. As membranas foram lavadas três vezes com PBS, exposta a reagentes de quimioluminescência (da Merck, Darmstadt, Alemanha), e exposto a película fotográfica. Todos os experimentos foram realizados em triplicado.

migração e invasão celular Assays

Transwell inserções (tamanho de poro 8,0) (CORNING, Chelmsford St) foram utilizados para ensaios de migração e invasão. A câmara inferior foi preenchida com 500 ul de meio RPMI 1640 ou DMEM com 10% de FBS. células PANC-1 e SU86.86 foram ressuspensas no meio de migração (RPMI 1640 isento de soro ou meio DMEM) e 4 × 10

5 PANC-1 ou SU86.86 células em 200 uL de meio foram adicionadas à câmara superior depois sendo lavadas duas vezes com PBS. Após 24 h de incubação a 37 ° C, as células na superfície superior da membrana foram suavemente e cuidadosamente raspado utilizando pontas de algodão. As células migrantes que eram aderentes à superfície inferior da membrana foram fixados em formalina a 10% à temperatura ambiente durante 30 min, e depois coradas com H E (hematoxilina-eosina). Os resultados do ensaio de migração de células foram avaliadas por meio da contagem do número de células na superfície inferior da membrana, sob um microscópio invertido em cinco campos diferentes com uma ampliação de × 200.

Para os ensaios de invasão celular, a superfície inferior da membrana foi revestida com gel de ECM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) em PBS durante 5 horas a 37 ° C. células PANC-1 ou SU86.86 (8 × 10

5 células) em meio RPMI 1640 isento de soro ou meio DMEM foram semeadas em câmaras superiores ECM gel revestidas, de acordo com as instruções do fabricante. As células que tinham atravessado o ECM e passados ​​através dos poros do filtro foram contados em cinco campos em × 200. Os resultados são representativos de três experiências diferentes.

Análises Estatísticas

Para obter resultados de microarray, foram realizadas correcção de fundo e normalização. one-way análise de variância (ANOVA) e teste de Student-Newman-Keuls (SNK) foram usados ​​para detectar genes diferencialmente expressos estatisticamente entre os diferentes grupos. Na análise bioinformática, genes diferencialmente expressos foram submetidos a GO análise de agrupamento hierárquico, análise de componentes principais, SOM e Mann-Kendall. Os testes t de Student e qui-quadrado foram aplicados para mostrar as diferenças de medição e os dados categóricos. Foi utilizado o SPSS13.0 pacote de software estatístico (SPSS Inc., Chicago, Illinois). Um estatisticamente significativa

valor P

foi definida como

P

. 0,05

Resultados

sucesso da criação Modelo PC induzida por DMBA em ratos

foi observada pancreatite aguda em ratos (7 dias após a implantação), em ambos os grupos experimentais e de controlo. Pancreáticas neoplasia intra-epitelial (pancreáticas intraepiteliais) estava presente em 6 de 15 ratazanas (40%) no grupo experimental de 2 semanas após a implantação, ao passo que nenhum PC foi encontrada em ratos no grupo de controlo. Um mês e 3 meses após o implante, 12 dos 15 (80%) e 14 dos 14 (100%) ratos no grupo experimental, respectivamente, PC desenvolvido (Fig. 1A, 1B). Quatro ratos no grupo de 3 meses desenvolveram metástases pequeno intestino ou metástases do fígado (Fig. 1C, 1D). No entanto, PC estava ausente em ratos nos grupos de controle. A velocidade de formação de PC no grupo experimental foi maior do que no grupo de controlo (

P

0,05). Um rato morreu antes do endpoint (3 meses), causando uma taxa de mortalidade de 6,7% (1/15).

(A) tumor pancreático do grupo 1-mês. (B) tumor pancreático do grupo 3 meses. (C) nódulos intestino delgado metástase de tumor pancreático. nódulos (D) metástase hepática de tumor pancreático.

As alterações histológicas foram avaliadas utilizando coloração HE e microscopia de luz. pâncreas normal (Fig. 2A), pancreatite aguda (Fig. 2B), pancreatite crónica (Fig. 2C), PanIN 2a (Fig. 2D), PanIN 2 (Fig. 2E), PanIN 3 (Fig. 2F), bem foram observadas PC diferenciada (Fig. 2G) e PC mal diferenciado (Fig. 2H).

(A) pâncreas normal (ampliação original × 60). (B) A pancreatite aguda (ampliação original x 150). (C) A pancreatite crônica (aumento original x 150). (D) PanIN 1a (ampliação original × 60). (E) PanIN 2 (aumento original x 150). (F) PanIN 3 (ampliação original × 60). (L) PC bem diferenciado (ampliação original × 60). (H) PC mal diferenciado (ampliação original × 60).

genes diferencialmente expressos em induzida por DMBA Rat Modelo PC

Um total de 661 genes diferencialmente expressos foram detectados em condições normais pâncreas do grupo controle e os grupos experimentais (Tabela 4). De acordo com a GO classificação, os genes estavam envolvidos em várias categorias funcionais e vários processos biológicos, incluindo o transporte de gás, processo metabólico de carboidratos, processamento e apresentação de antigénios (Fig. 3A). Por dois sentidos análise de agrupamento hierárquico, pâncreas normal, pancreatite aguda e crónica, PanIN e cedo e amostras de câncer pancreático avançado foram completamente discriminados (Fig. 3B). Havia 11 genes regulados positivamente (sonda) e 142 genes regulados negativamente (sonda) por Mann-Kendall teste Monotone tendência (

P Art 0,05) (Fig. 3C). Os 20 melhores genes regulados positivamente e regulados negativamente no grupo DMBA 3 meses cujos níveis de expressão foram alterados por duas vezes em comparação com o grupo de controlo (P

0,01) são mostradas na Tabela 5. Além disso, os genes homólogos no rato e humana em diferentes fases do modelo de rato foram examinados com sucesso (Tabela 6, a Fig. 3D).

(a) GO genes de classificação mostrando envolvidos nas diferentes categorias de função molecular. (B) Two-way análise de agrupamento hierárquico. (C)

P valores

em tendência de Mann-Kendall teste monótono. (D) os genes homólogos em ratos e humanos em diferentes fases do modelo de rato.

Genes Validação de diferencialmente expressos

Foram selecionados três os genes diferencialmente expressos, CXCR7, ATP6v1g2 e UBE2C, para uma análise mais aprofundada. Em primeiro lugar, examinamos seus perfis de expressão por qRT-PCR. Os valores de ΔCt CXCR7 gradualmente diminuída, juntamente com o tratamento prolongado com DMBA (

P

0,05) (Tabela 5), ​​indicando a expressão regulada positivamente. Não houve diferenças significativas para ATP6v1g2 e UBE2C (

P Art 0,05) (Tabela 7). Utilizando imunohistoquímica, através de diagnóstico e confirmação de um patologista, significativamente melhorada CXCR7 e expressão UBE2C foram detectados, juntamente com a progressão da PC em ratos (

P

0,05). (. Tabela 8, as Figs 4)

(aumento original x 200). (A), (C) de pâncreas de rato normal, a coloração HE. (B), (D) do rato PC, coloração HE. (E), (G), de pâncreas de rato normal, CXCR7 imuno coloração. (F), (H) de rato PC, UBE2C imuno coloração.

a diminuição da migração e invasão após transfecção de CXCR7 siARN em PANC-1 e SU86.86 linhas celulares

Expressão de CXCR7 foi regulada negativamente com sucesso nas duas linhas de células humanas de PC, PANC-1 e Su86.86 (Fig. 5A), ap a transfeco com siRNA CXCR7, em comparação com a transfecção com ARNsi de controlo. Foram observadas diferenças significativas na migração e invasão celular em CXCR7 siRNA células transfectadas em comparação com células de controlo (P 0,05). (. Figuras 5B e 5C)

(A) Knockdown de CXCR7 por siRNA transfecção. (B) A migração após transfecção de CXCR7 ou ARNsi de controlo. (C) Invasion após transfecção de CXCR7 ou controle siRNAs.

Discussão

Várias alterações em vias moleculares têm sido conhecida a desempenhar um papel importante na iniciação e progressão de PC [1 ]. No entanto, uma das complicações em estudos baseados em amostras humanas é que as características de cada uma das fases da doença não pode ser facilmente visualizada. Neste aspecto, os modelos animais transportar uma vantagem única. No domínio da investigação PC, grandes modelos têm incluído modelos transgênicos [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [22] induzida por DMBA e. Em estudos do modelo de rato induzido por DMBA, diferentes doses DMBA e taxas de desenvolvimento PC têm sido relatados [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. O estudo, que foi baseado em nosso método relatado anteriormente [14], alcança resultados de indução PC satisfatórios. Portanto, estes resultados indicam estabelecimento bem sucedido do modelo.

Microarrays têm sido largamente aplicado no rastreio de genes diferencialmente expressos em PC [23], [24], [25], [26]. No entanto, esta técnica não tem sido utilizada no modelo de PC induzida por DMBA. O presente estudo analisou o perfil de expressão gênica neste modelo de rato PC. análise de microarray Affymetrix identificou um total de 661 genes que foram diferencialmente expressos no pâncreas normais do grupo controle e os grupos experimentais. Estes genes incluídos facilitadores críticos de funções importantes durante a tumorigénese pancreático [27], tais como Kras, CDKN2A, SMAD4, e TP53. Estes genes foram regulados positivamente ou regulados negativamente durante a duração formação de tumor pancreático. classificação GO, nos dois sentidos análise de agrupamento hierárquico e Mann-Kendall teste Monotone tendência genes ainda identificados, incluindo nm23, ciclina B1 e FGFR3. Um estudo anterior demonstrou que nm23 foi associada com o potencial metastático de linhas celulares PC humanos [28]. No estudo actual, que mostraram que a expressão nm23 foi significativamente diferente entre pâncreas normal e o grupo de DMBA um mês, o que sugere que a molécula pode também ser envolvido na fase inicial da patogénese da PC. Há poucos dados disponíveis sobre os papéis de ciclina B1 e FGFR3 no PC [23], [29]. Assim, aqui, nós fornecemos mais provas de que fundamenta o seu envolvimento nesta doença. Novas investigações sobre os mecanismos subjacentes à sua participação no PC são necessários.

padrões de expressão de três genes diferencialmente expressos, CXCR7, ATP6v1g2 e UBE2C, foram avaliados por qRT-PCR e coloração imuno-histoquímica. Os resultados mostraram gradualmente upregulated expressão CXCR7 ao nível do ARNm, e expressão aumentada de CXCR7 positiva e UBE2C, juntamente com o tratamento prolongado com DMBA. Estes resultados principalmente seguida os dados de microarray. CXCR7 foi previamente demonstrada para ter um impacto sobre o crescimento, a apoptose, invasão /metástase e prognóstico em muitos cancros [30], [31], [32], [33]. Um estudo recente revelou que CXCR7 promovido o crescimento de células PC em [34]. No entanto, o seu significado prognóstico em PC permanece controverso [35], [36]. No modelo de rato e linhas de células humanas utilizadas nas nossas experiências, foi indicada a associação de CXCR7 e progressão bem como propensão invasiva de PC. Portanto, mais estudos sobre os mecanismos para os fatores moleculares envolvidos na pena PC são garantidos.

UBE2C foi criado para ser associado com o crescimento e inibição da apoptose em células cancerosas, desempenhando assim um papel na tumorigénese e mostrando potencial para ser um biomarcador de ambos diagnóstico e prognóstico [37]. No entanto, UBE2C não foi previamente investigado em PC. No presente estudo, encontramos expressão positiva aprimorada de UBE2C juntamente com o tratamento DMBA prolongado, sugerindo seu potencial papel na progressão do PC. Notavelmente, a expressão de ARNm UBE2C não foi significativamente alterada, indicando que a regulação pós-transcrição pode estar envolvido na alteração da sua expressão. dados mecanicistas detalhados subjacentes a esta activação é necessária.

Em resumo, os nossos dados identificaram vários potenciais marcadores de PC com base em uma análise exaustiva e uma verificação posterior.