Sumário

Nós relatado anteriormente que pacientes com adenocarcinomas do pulmão com mutações no gene KRAS e atividade proliferativa forte teve resultados mais pobres, mesmo na fase inicial da doença. O objectivo do presente estudo foi elucidar a base molecular potencial destes tumores do pulmão altamente malignas, concentrando-se em proteínas S100 (S100A2, S100A7, e S100A11), que são alvos a jusante de KRAS oncogénicos e promotores de progressão tumoral. A expressão imuno-histoquímica das proteínas S100 foi examinada em 179 adenocarcinomas primários de pulmão, e as relações potenciais entre seus níveis e fatores clínico-patológicas foram analisados. Entre os três subtipos, os níveis S100A11 foram significativamente maiores em adenocarcinomas com mutações KRAS e actividade proliferativa forte. Eles também foram mais elevados em adenocarcinomas com tumores pouco diferenciados. Além disso, os níveis mais elevados de S100A11 foram associados com a sobrevivência livre de doença mais curto. Estes resultados sugerem que a sobre-regulação de S100A11 desempenha um papel na progressão do tumor, particularmente em adenocarcinomas do pulmão com mutação KRAS

citação:. Woo t, Okudela K, Mitsui H, Tajiri H, Rino Y, K Ohashi , et ai. (2015)-regulação de S100A11 em Lung Adenocarcinoma – sua relação potencial com o cancro progressão. PLoS ONE 10 (11): e0142642. doi: 10.1371 /journal.pone.0142642

editor: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, Estados Unidos

Recebido: 01 de agosto de 2015; Aceito: 23 de outubro de 2015; Publicação: 06 de novembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Woo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Ministério da Educação, Cultura, Esportes e Facilidade de Ciência do Japão (Japão Tóquio), e Yokohama médica (Yokohama, Japão) . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é uma das causas mais comuns de morte relacionada ao câncer no mundo desenvolvido [1-2]. Uma grande proporção de pacientes, mesmo aqueles com câncer de pulmão não-pequenas células estágio inicial, morrem devido à doença recorrente [3-4]. Apesar de alguns tumores de pulmão são sensíveis a agentes quimioterápicos convencionais ou certos agentes alvo molecular, muitos não são [5-6]. Assim, uma compreensão mais profunda das bases moleculares da carcinogênese pulmonar é necessária a fim de desenvolver novas estratégias terapêuticas.

Nós relatado anteriormente que pacientes com adenocarcinomas do pulmão com mutações no gene KRAS e atividade proliferativa forte teve resultados mais pobres, mesmo em a fase inicial da doença [6]. Por conseguinte, o objectivo do presente estudo foi elucidar a base molecular potencial destes tumores do pulmão altamente malignas, concentrando-se em proteínas S100. A família proteína S100 se liga a cálcio e modula a transmissão de vários sinais celulares. Nós já demonstrou que S100A2, S100A7 e S100A11 eram alvos a jusante de KRAS oncogênicos (Tabelas 1 e 2) [7-8]. A expressão de proteínas S100 também foi mostrado para ser alterado em vários cancros [9-20] (laringe [10], da mama [11], do pulmão [12-13], gástrica [14], colorrectal [15], hepatocelular [16 ], pancreático [17], da próstata [18], rim [19], e da bexiga cancros [20]), incluindo os cancros do pulmão [12-13], e estas proteínas têm sido sugeridos para promover a progressão da carcinogénese pela modulação celular e migração atividade proliferativa [21].

Nós aqui examinadas 179 adenocarcinomas primários de pulmão cirurgicamente ressecados para a expressão imuno-histoquímica das proteínas S100 (S100A2, S100A7 e S100A11), e analisadas as relações potenciais entre os seus níveis e fatores clínico-patológicas.

Materiais e Métodos

câncer de pulmão primário

Todos os 179 cancros do pulmão examinados foram os casos da fase I adenocarcinoma que foram submetidos à ressecção cirúrgica radical no Kanagawa Cardiovascular e respiratória Center (Yokohama, Japão). O plano de pesquisa foi aprovado pelos Comitês de Ética de Yokohama City University e Kanagawa Cardiovascular e centro respiratório. consentimento informado por escrito para o uso de materiais ressecados pesquisa foi obtido de todos os temas, constituindo-primas.

subtipos histológicos foram classificados de acordo com a classificação IASLC /ATS /ERS de adenocarcinoma de pulmão [22] de 2011, e os estágios tumorais foram determinados de acordo com o sistema de classificação internacional TNM (sétima edição do UICC) [23].

Western blotting

lisados ​​de tecido foram submetidas a electroforese em gel de SDS-poliacrilamida e transferidos para membranas de PVDF (Amersham, Piscataway, NJ). As membranas foram então incubadas com leite em pó magro em solução salina tamponada com Tris contendo Tween-20 (TBS-T), a fim de bloquear a proteína não imuno-específico de ligação, e, em seguida, com um anticorpo primário contra S100 A11 (Santa Cruz, Santa Cruz, CA ), e beta-actina (Sigma, St. Louis, MO). Após a lavagem com TBS-T, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com HRP correspondência animais (Amersham). A imunorreactividade foi visualizada com um sistema de quimioluminescência aumentada (Amersham).

A imuno-histoquímica

secções de tumor foram cortadas de blocos de tecidos, embebidos em parafina e fixados em formalina. Os cortes foram desparafinados, re-hidratados, e incubou-se com peróxido de hidrogénio a 3%, seguido de soro de cabra a 5% para bloquear a peroxidase endógena e actividades não-proteína de ligação imuno-específico. As secções foram fervidas em tampão de citrato (0,01 M, pH 6,0) durante 15 minutos para recuperar epitopos mascarados e, em seguida, incubadas com anticorpos primários contra S100A2, S100A7, e S100A11 (Santa Cruz) bem como o Ki-67 (DAKO, Ely, Reino Unido ). A imunorreactividade foi visualizada utilizando um sistema de detecção Envision (DAKO), e os núcleos foram contrastadas com hematoxilina. Os níveis de expressão de proteínas imuno-histoquímicos S100 foram avaliadas por um sistema de pontuação tal como descrito na secção Resultados. O índice de marcação de Ki67 foi calculado como a proporção de células com núcleos positivos entre 500-1000 células cancerosas. Ki-67 índices de rotulagem de 10% e = 10% foram classificados como níveis baixos e altos com base nas conclusões do nosso estudo anterior [6].

Análise Estatística

As diferenças de pontuação entre os grupos classificados com base em temas clínico-patológicas foram analisados ​​por o teste de Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis. As relações entre os escores e assuntos clínico-patológicas foram analisados ​​usando um modelo de regressão linear múltipla. O vão livre doença pós-operatório foi definida como o período entre a data da cirurgia para a data em que a recorrência foi diagnosticada. Uma observação foi censurado no último follow-up se o paciente estava vivo ou tinha morrido de uma causa diferente do câncer de pulmão. curvas de recorrência foram plotados utilizando o método de Kaplan-Meier, e o risco absoluto de recorrência em cinco anos foi estimada a partir dessas curvas. As diferenças nos vãos sobrevida livre de doença foram analisadas pelo teste de Log-rank. P valores inferiores a 0,05 foram considerados significativos. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando software SPSS (SPSS para Windows versão 10.0; SPSS, Chicago, IL, EUA).

Resultados

Expressão imuno-histoquímica de proteínas S100

O S100A11 proteína foi expressa nos núcleos e citoplasma das células epiteliais normais de bronquíolos (Fig 1a), enquanto que a proteína S100A2 foi expressa predominantemente no lado apical do citoplasma sob a forma granulada (Figura 1E).

Representante fotografias de bronquíolos normal (a, e) e tumores, em que a expressão de S100A11 e S100A2 foi negativa (B, F), fraco (C, G) e forte (D, H), são mostrados.

os níveis de proteína S100 variou em células neoplásicas, e até mesmo em tumores individuais. A expressão destas proteínas foi maior em algumas células neoplásicas que em células epiteliais bronquiais (Figura 1D e 1H), ao passo que outras células expressa fracamente eles (Fig 1C e 1G) ou a um nível não detectável (Fig 1B e 1E). Por outro lado, a proteína S100A7 só foi expressa em algumas células de adenocarcinoma. Ele foi fortemente expressa nas células queratinizantes de carcinomas de células escamosas (S1 FIG). Assim, a proteína S100A7 foi excluído da análise seguinte.

A expressão níveis de S100A2 e S100A11 foram classificados em negativo (nível 0), fraco (nível 1), e forte (nível 2). O nível fraco foi definida como o nível quase equivalente ao de células epiteliais bronquiais. O nível forte foi definido como um nível inequivocamente mais forte do que em células epiteliais bronquiais. A pontuação expressão imuno-histoquímica foi determinada como o nível médio de uma secção do tumor máxima (se 30%, 10%, e 60% das células neoplásicas na secção do tumor máxima foram negativos, fraco, e níveis fortes, respectivamente, o nível médio foi calculado como “0.3×0 0.1×1 + + 0.6×2 = 1,3”). Os níveis de expressão de S100A2 e S100A11 em todos os tumores examinados são mostrados na Fig. 2A e 2B

pontuações de expressão medianos foram de 1,30 em S100A11 (A) e 0,10 em S100A2 (B). S100A11 não foi expressa em 8 casos (A), enquanto S100A2 não foi expresso em quase metade dos casos analisados ​​(83 casos) (B). ADC, Adenocarcinoma.

A validade da avaliação imuno-histoquímica foi apoiada pela análise de Western blot, porque os níveis de proteína S100 avaliados pela imuno-histoquímica e aqueles por transferência de Western foram aproximadamente paralela (O resultado de um Western blot para S100A11 foi mostrado em S2 Fig).

os níveis de proteína S100 e fatores clínico-patológicas

níveis S100A11 foram significativamente maiores em adenocarcinomas com mutações KRAS e atividade proliferativa forte (P = 0,038 no teste de Kruskal-Wallis , Fig 3). Eles também foram significativamente mais elevados em adenocarcinomas com tumores pouco diferenciados (p = 0,021 no teste de Kruskal-Wallis, Tabela 3) e linfático ou envolvimento vascular (P = 0,026 no teste de Mann-Whitney, Tabela 3). A análise de regressão linear múltipla mostrou que os tumores pouco diferenciados correlacionadas com níveis mais elevados S100A11 (p = 0,039, Tabela 4). Por outro lado, os níveis de S100A2 não foram associados com mutações KRAS, actividade de proliferação, ou qualquer um dos outros factores clinicopatológicas (dados não mostrados).

As linhas espessas indicam a pontuação média de expressão S100 A11, o qual foi 1.00 no KRAS do tipo selvagem /Ki-67 casos de baixo (n = 94), 1,50 no KRAS do tipo selvagem /Ki-67 casos de alto (n = 62), 1,20 no KRAS do tipo Mutante /Ki-67 casos de baixo (n = 11) e 1,80 no KRAS mutado-type /Ki-67 casos de alto (n = 11). Os níveis de expressão S100A11 foram significativamente maiores em adenocarcinomas com mutações KRAS e actividade proliferativa forte (P = 0,038 no teste de Kruskal-Wallis). Em peso, de tipo selvagem; Mt, do tipo mutado.

Os níveis de proteína S100A11 e sobrevida livre de doença

Uma vez que os resultados obtidos sugerem que o aumento da regulação do S100A11 estava envolvido em a progressão do tumor, particularmente em adenocarcinomas de pulmão com mutação KRAS, seu valor prognóstico foi posteriormente verificada. Cento e setenta e nove pacientes com adenocarcinoma pulmonar em estágio I foram examinados. S100A11 pontuações de expressão de 1,65 e = 1,65 foram classificados como de alta e baixa com base em uma curva ROC (área sob a curva de 0,629, 95% de intervalo de confidencial 0,501-0.757). Cento e dezoito pacientes eram baixas expressadores, enquanto 61 foram de alto expressadores. as taxas de sobrevida livre de doença de cinco anos foram de 90,1% e 76,3% em expressadores-S100A11 baixa e alta, respectivamente. A forte expressão de S100A11 correlacionada com menor sobrevida livre de doença em adenocarcinomas pulmonares pós-operatórias (p = 0,0182 no teste de Log-rank, Fig 4). Por outro lado, a correlação não foi encontrada entre os níveis de expressão S100A11 e local da doença recorrente (dados não mostrados).

Cinco anos as taxas de sobrevida livre de doença foram 76,3% em expressadores de alta S100A11 (n = 61) e 90.1% em expressores de baixa S100A11 (n = 118). A forte expressão de S100A11 correlacionada com sobrevida livre de doença menor em adenocarcinomas pulmonares pós-operatórias (p = 0,0182 no teste de Log-rank).

Discussão

Entre as proteínas S100 (S100A2, S100A7 e S100A11) examinada no presente estudo, os níveis S100A11 foram significativamente maiores em adenocarcinomas com mutações KRAS e atividade proliferativa forte (Fig 3). Eles também foram mais elevados em tumores com adenocarcinomas pouco diferenciados (Tabelas 3 e 4). Além disso, a forte expressão de S100A11 correlacionada com menor sobrevida livre de doença (Fig 4). Estes resultados sugerem que as alterações na expressão de S100A11 desempenhado um papel na progressão do tumor, particularmente em adenocarcinomas do pulmão com mutação KRAS.

S100A11, também chamado S100C ou calgizzarin, pertence à família de cálcio S100 multi-gene proteínas de ligação. Ele está localizado em 1q21, com 15 outros membros da família de S100 e tem um peso molecular de 11.7kDa [24]. membros da família S100 regular eventos intracelulares importantes, tais como as actividades enzimáticas, a dinâmica de componentes do citoesqueleto, e Ca

2+, a fim de modular o crescimento celular e a motilidade, bem como a diferenciação [9]. A sobre-regulação de S100A11 foi avaliado em vários cancros [9], tais como a laringe [10], da mama [11], do pulmão [12-13], gástrica [14], colorrectal [15], pancreático [16], e cancros da próstata [17], e tem sido frequentemente associado com a progressão do câncer, implicando o seu papel oncogênico [10-17]. Tian T et al. anteriormente demonstrado que S100A11 foi regulado para cima em uma linha de células de cancro do pulmão altamente metastático através de uma análise proteômica [13]. Wang et al. também relataram que os níveis S100A11 aumentou com a progressão da doença em fase cancro colorrectal [15]. Os nossos resultados são consistentes com estes resultados.

No entanto, estudos anteriores demonstraram que os níveis de expressão S100A11 foram reduzidos em tumores com maior actividade maligno no rim [19] e cancros da bexiga [20]. Memon AA et ai. mostrou que S100A11 foi regulada para baixo em uma linha de células de categoria superior de cancro da bexiga através de uma análise do proteoma, ea expressão fraca de S100A11 foi associada com a sobrevivência pobre [20]. Esta discrepância implica a complexidade da progressão do câncer. Por exemplo, várias proteínas relacionadas com o cancro, tais como fator de crescimento transformador-beta, têm funções opostas como inibidores ou promotores em diferentes fases de progressão do câncer [25]. Portanto, o papel potencial da expressão aberrante de S100A11 na carcinogénese podem diferir entre vários tipos de malignidades.

Em resumo, os resultados do presente estudo sugerem que a sobre-regulação de S100A11 desempenhado um papel na progressão tumoral , particularmente em adenocarcinomas do pulmão com mutação KRAS. A função biológica de S100A11 ainda permanece incerto. Novas investigações são necessárias para elucidar os mecanismos pelos quais S100A11 promove a progressão do câncer de pulmão.

Informações de Apoio

S1 Fig. exame imuno-histoquímica de S100A7 níveis de expressão da proteína em tumores e epitélios não-tumoral de pacientes com cancro do pulmão submetidos a ressecção cirúrgica.

fotografias representante de bronquíolos normais (A), adenocarcinoma (B) e carcinoma de células escamosas (C) são mostrados. S100A7 não foi expressa nas células epiteliais normais de bronquíolos (A), e só foi expressa em alguns adenocarcinoma (ADC) células (B). Por outro lado, foi fortemente expressa nas células queratinizantes de carcinomas de células escamosas (SQC) (C)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0142642.s001

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S2 Fig. Os lisados ​​de proteína

de tumores (T) e tecidos não tumorais (N) de tecidos de adenocarcinoma do pulmão de pacientes submetidos a ressecção cirúrgica foram sujeitos a uma análise de Western blot para S100A11 e β-actina (ACTB) nos casos representativos (A) . As intensidades do sinal das bandas foram avaliadas por meio de imagens NIH. níveis S100A11 foram normalizados para os de ACTB. níveis normalizados são mostradas (B). A expressão imuno-histoquímica de S100A1 nos mesmos tumores foi mostrado (C). Os níveis de proteína S100 avaliada por imuno-histoquímica e aqueles por Western blot foram aproximadamente paralelo. . Cs, caso

doi: 10.1371 /journal.pone.0142642.s002

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Reconhecimentos

Agradecemos especialmente Emi Honda e Misa Otara (Departamento de Patologia, Kanagawa Cardiovascular e centro respiratório) por sua assistência técnica.