Abstract

câncer colorretal metastático (mCRC) conta com o desprendimento de células malignas agressivas do tumor primário na corrente sanguínea e, concordante, o presença destas células tumorais circulantes (CTC) está associada a um mau prognóstico. Neste trabalho, a caracterização molecular de CTC de pacientes com CCRm foi abordado, com o objetivo de entender sua biologia e melhorar a sua utilidade clínica no tratamento de pacientes com câncer colorretal. Para isso, imuno-baseados de EpCAM CTC foi combinada com a amplificação e hibridação transcriptoma todo para cDNA microarrays. dados de expressão de gene a partir de pacientes com CCRm, uma vez que o imuno-isolamento de fundo não específica a partir de um grupo de controlo tinha sido subtraído, resultou em 410 genes que caracterizaram a população CTC. Bioinformatics foram usadas para a interpretação biológica dos dados, revelando que o CTC são caracterizados por genes relacionados com o movimento e adesão celulares, a morte celular e a proliferação, e a sinalização celular e a interacção. RTqPCR numa série independente de pacientes e controlos CCRm foi utilizado para a validação de um número de genes relacionados com as funções celulares principais que caracterizam a população CTC. Comparação entre carcinomas primários e de pulmão e metástases hepáticas envolvidos ainda mais os CTC-genes na promoção da metástase. Além disso, a correlação da expressão do gene-CTC com parâmetros clínicos demonstrou detecção e prognóstico de significância. Em conclusão, a caracterização molecular de CTC de pacientes com CCRm e a identificação de biomarcadores de diagnóstico e prognóstico representam uma abordagem inovadora e promissora no manejo clínico deste tipo de pacientes

Citation:. Barbazan J, Alonso-Alconada L , Muinelo-Romay G, H Vieito, Abalo A, Alonso-Nocelo M, et al. (2012) Caracterização molecular de células circulantes do tumor em câncer colorretal metastático humano. PLoS ONE 7 (7): e40476. doi: 10.1371 /journal.pone.0040476

editor: Xin Wei Wang, do National Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 17 Janeiro, 2012; Aceito: 8 de junho de 2012; Publicação: 10 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Barbazan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi em parte financiado pelo Ministério espanhol de Saúde (CP08 /00142) e do Programa Comissão Europeia Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). Sem financiamento externo adicional recebida para este estudo. J. Barbazan e L. Alonso-Alconada são beneficiários de bolsas de estudo do Ministério espanhol da Educação e da Ciência e do Governo Basco (Espanha), respectivamente. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é o terceiro câncer mais comumente diagnosticado em homens ea segunda em mulheres, com mais de 1,2 milhões de novos casos de câncer estimados para ter ocorrido em todo o mundo em 2008 [1]. Clinicamente, a disseminação do tumor distante e metástase são os fatores mais importantes no prognóstico: enquanto estágio não-invasivo I carcinomas apresentar um 90% durante cinco anos de sobrevivência, estágio IV carcinomas com metástases à distância correlacionam-se com uma queda dramática a uma taxa de sobrevivência de 10% [2 ]. Com isso, novas estratégias terapêuticas que melhorem a eficácia contra a doença metastática e biomarcadores precisos para o seguimento dos pacientes de CRC são grandes desafios, em conjunto com a detecção precoce e triagem em populações de alto risco.

A propagação do cancro baseia-se em o desprendimento de células malignas agressivas do tumor primário na corrente sanguínea como principal fonte de uma maior metástase [3]. É amplamente aceito que circulantes células tumorais (CTC) própria ou adquirir a capacidade de iludir o sistema imune do hospedeiro e para chegar a um órgão distante, geralmente o fígado no CRC, onde eles estabelecer um local de crescimento do tumor secundário em um processo altamente ineficiente, mas dramática [4]. Concordantemente, a presença de CTC no sangue periférico tem sido associado com prognóstico pobre em diferentes tipos de cancro, incluindo CRC [5], [6]. Como fundadores presuntivos na geração de metástase, CTC estão se tornando um campo de interesse, ea compreensão de sua biologia pode abrir novas perspectivas na área da oncologia. No que diz respeito a sua caracterização molecular, nos últimos anos, um número de grupos apresentaram dados de expressão de genes específicos focalizadas em vias de sinalização ou relacionadas com o cancro para a melhoria da sensibilidade e especificidade da detecção de [7], [8]. Smirnov et al. aproximou-se do perfil da CTC através de um peito variado, próstata e perspectiva metastático colorectal [9]. Além disso, os dados são emergente sobre a possibilidade de estudar a biologia e o utilitário para avaliar terapias direcionadas com base no perfil genômico da CTC [10], [11].

Dentro deste cenário, definido por uma eficácia limitada de quimioterapias atuais no tratamento de câncer colorretal metastático (mCRC) e CTC como jogadores-chave na gestão de doença metastática, perfilamento molecular específico da população CTC foi abordado. A combinação de imuno-isolamento à base de EpCAM CTC extracção e precisas de ARN a partir de um número muito reduzido de mais amplificação CTC transcriptoma conjunto, tornaram possível a hibridar de cDNA a partir da população do CTC para microarranjos de expressão genética. Ao aplicar este procedimento para um grupo de pacientes com CCRm em comparação com o fundo de células hematopoiéticas isolado inespecíficas, a população de CTC immunoisolated foi perfilado especificamente. Para além da caracterização molecular do CTC para a compreensão da biologia de uma fonte principal de metástases em CRC, estes dados fornecem potenciais alvos terapêuticos e /biomarcadores de prognóstico de diagnóstico.

Resultados

CTC imunoisolamento e Molecular Profiling

Os procedimentos para CTC imuno-isolamento, extração de RNA e amplificação para hybridisa; ção em microarrays de cDNA estão representados na Figura 1A. Resumidamente, CTC foram immunoisolated de 7,5 ml de sangue periférico de fase IV pacientes com CCRm (n = 6; Tabela S1). pérolas magnéticas foram utilizados, os quais foram revestidos com um anticorpo monoclonal em relação a células epiteliais humanas Molécula de adesão (EpCAM), uma molécula de superfície altamente expressa em tumores com origem no epitélio como o CRC. ARN isolado a partir CTC foi purificado utilizando um kit especificamente concebido para amostras de baixa abundância. Em paralelo, o mesmo protocolo foi aplicado a amostras de sangue de dadores saudáveis ​​(n = 3) para estabelecer a linha de base a partir do fundo não específico não imuno-CTC. Antes da análise da expressão do gene, a presença de isolado CTC foi confirmada por visualização de imunofluorescência directa utilizando um cocktail de anticorpos contra citoqueratinas 8, 18 e 19 (Figura S1), e por uma combinação de dois biomarcadores validado para a quantificação exacta de CTC em CCRm pacientes (GAPDH-CD45; [12]) (teste de Mann-Whitney, p-valor 0,05) (Figura 1B). Além disso, a exactidão da metodologia avaliado como a taxa de recuperação durante a imuno-isolamento resultou em uma média de 91,56% (Métodos S1).

(A) Representação esquemática do processo utilizado para a caracterização molecular do CTC. CTC foram isolados a partir de 7,5 ml de sangue periférico por separação imunomagnética utilizando anticorpos anti-EpCAM esferas magnéticas revestidas. As células isoladas foram submetidas a uma extracção de RNA seguida de um processo de amplificação de toda transcriptoma (WTA). Finalmente ADNc amplificado foi hibridizado para Agilent matrizes de expressão de genes. (B) os níveis de GAPDH-CD45 em controles e pacientes com CCRm medidos por PCR em tempo real. As barras horizontais representam o valor mediano de cada grupo (* p 0,05). (C) Spearman análise de correlação entre os níveis de GAPDH-CD45 obtidos tanto a partir de dados pós-matriz e qPCR anterior à amplificação WTA. gráfico de saída análise (D) SAM mostrando diferenças de expressão gênica entre o grupo de pacientes e controles. Dots destaque correspondem a genes com níveis de aumento estatisticamente significativos de expressão no grupo de pacientes em comparação com o plano de fundo de controle, sendo considerado para caracterizar a população CTC de mCRC.

A fim de caracterizar a população CTC isolado a partir de pacientes com CCRm, a metodologia descrita por Gonzalez-Roca et ai. foi adaptado, para precisas perfil de populações celulares muito pequenos [13] a expressão do gene. Basicamente, o RNA purificado foi adicionalmente tratada com a ADNasel, amplificado usando o método de amplificação transcriptoma WTA2 todo, e ADN complementar foi marcado e hibridado para arranjos de expressão Agilent (Figura 1A) (Gene Expression Omnibus, GEO Número de acesso:. GSE31023). Após o pré-processamento inicial de dados brutos, uma média de 21,070 pontos foram filtrados de acordo com os critérios descritos em Materiais Métodos, o que representou 47,35% dos pontos em micro-arranjo com um máximo de 32443 e um mínimo de 13.247. Após a filtração, o coeficiente% de variação (CV) para as sondas replicados variou de 5,98% para 12,13%. A normalização dentro de cada micromatriz foi levada a cabo usando o método do loess, que assume que a maioria dos genes de microarranjos não são expressos diferencialmente em comparação com o controlo, de modo a normalização entre todos os dados de microarray foi realizada pelo método Aquantile implementado no pacote Limma do R estatística Programas. Este método garantiu que os valores A (intensidades médias) tinha a mesma distribuição empírica através microarrays deixando, porém, valores M (log-rácios) inalterada. Análise da correlação entre níveis RTqPCR GAPDH-CD45 antes e após a amplificação indicou uma linearidade robusta durante o processo de amplificação transcriptoma (coeficiente de Spearman: 0,8667; valor-p 0,005). (Figura 1C)

O próximo passo envolvido gene-expressão profiling da CTC isoladas de pacientes com CCRm contra o fundo de células contaminar durante a imuno-isolamento. Para isso, intensidades normalizado de expressão genética de pacientes com CCRm e para o grupo de controles foram processados ​​usando software MeV (MultiExperiment Viewer) (ver Métodos S1). Os sinais obtidos a partir de controlos saudáveis ​​foram consideradas como o fundo a partir de células do sangue não-especificamente isolados, que eram sobretudo linfócitos. O sinal obtido a partir de pacientes com CCRm representada a soma deste fundo não específico mais o padrão de expressão genética específica do CTC. Subtraindo este pano de fundo, a população não-contaminante CTC foi removido, e os genes resultantes que mostram expressão estatisticamente significativa foram consideradas para caracterizar a população de CCRm CTC pacientes (Figura 1A). Concordantemente, todos os genes significativos apresentaram expressão positiva em pacientes com CCRm mediante subtracção do fundo de dadores saudáveis ​​(Figura 1D), o que era consistente com a presença de CTC apenas nas amostras CCRm. Esta estratégia conduziu à identificação de um conjunto final de 410 genes que eram específicos para a população CTC (Tabela S2), com a análise de agrupamento hierárquico claramente discriminar entre pacientes e controlos (Figura 2A) CCRm.

(A) agrupamento hierárquico de genes diferencialmente expressos entre os pacientes (n = 6) e controles (n = 3) (genes específicos CTC). validação (B) RTqPCR de onze genes seleccionados a partir de dados de matriz. diferenças de mudança vezes CD45 normalizada entre pacientes com CCRm (n = 20) e controles saudáveis ​​(n = 10) (barra cinza) no CTC fração enriquecida (barras pretas; *** p 0,0001). De nota, não foram observadas diferenças entre os pacientes com CCRm (n = 5) e controles (n = 5) na fração remanescente após CTC imunoisolamento (barras brancas).

análise bioinformática com Ingenuity Pathway Analysis ( IPA) e Genecodis (para software Gene Ontology) serviu para interpretar a lista resultante de genes que caracterizam a população CTC. As principais funções celulares definidas por esses genes específicos CTC-estavam relacionados com o movimento celular, a adesão celular, a morte celular e a proliferação, a sinalização célula-célula e interacção, e reorganização do citoesqueleto (Figura S2A e C). Curiosamente, a análise de IPA de vias canónicos, que era representativo destes genes, também uma série de vias de sinalização conhecidos envolvidos na migração celular /invasão e a adesão de células, como a proteína quinase A, RhoA, integrinas, ILK, ou moléculas do citoesqueleto sinalização Actina (Figura S2B). Além disso, a análise da interacção gene-gene rendeu redes biológicas que caracterizam a população de pacientes com CCRm CTC. Entre eles, o câncer e movimento celular e morfologia foram encontrados para ser os principais eventos associados a um fenótipo CTC, ao passo que essa interpretação pode ser influenciado pela importante contribuição do câncer para bancos de dados (Figura S3). Todas estas análises apontam para um equilíbrio entre os genes subjacentes a sobrevivência da célula, a interação com o meio ambiente e movimento celular como os processos biológicos fundamentais que devem convergir na população de CTC para o êxito do desenvolvimento de metástases em CRC.

real-Time PCR quantitativa validação e Identificação de diagnóstico e prognóstico Biomarkers

o próximo passo envolveu a validação RTqPCR de onze genes que apresentam altos índices de log2 em pacientes com CCRm e uma relevância funcional nos processos biológicos caracterização da população CTC em um séries independentes de pacientes e controles CCRm. A expressão específica destes genes foi avaliada comparando as populações CTC a partir do grupo de pacientes com CCRm (n = 20) com o fundo de controlos saudáveis ​​(n = 10), uma vez que eles foram normalizados para CD45 como um marcador de não especificidade durante CTC isolamento. Estes genes incluídos APP, CLU e TIMP1, que estão associadas com a morte celular e a actividade anti-apoptótica; VCL, ITGB5, BMP6 e TGF-p1, que são genes envolvidos na migração celular e invasão e morfologia celular; e TLN1, ITGB5, LIMS1, RSU1 e CD9, que estão associadas com a adesão celular. Como pode ser observado na Figura 2B (barras pretas), todos os genes candidatos seleccionados foram validados nesta nova série de amostras por RTqPCR com diferenças significativas entre o grupo de pacientes e o grupo de controlos (p-valor 0,0001).

importante, para garantir que a expressão dos genes seleccionados era característica do CTC e não de um artefacto, devido à variação da expressão de genes em linfócitos de doentes com cancro, a sua expressão foi comparada na restante fracção não isolado após enriquecimento CTC num conjunto de pacientes com CCRm (n = 5) e controlos (n = 5). Como mostrado na Figura 2B (barras brancas), não foram encontradas diferenças entre os dois grupos para os genes candidatos onze, reforçando a sua especificidade de expressão na população CTC. Quando cinco amostras na fracção CTC isolados foram seleccionados aleatoriamente, níveis significativamente mais elevados foram consistentemente encontrado em amostras CCRm, demonstrando que a falta de diferenças entre os pacientes e controles na fracção não isolado não foi devido a amostra artefactos de tamanho (dados não mostrados) .

Para avaliar ainda mais o envolvimento dos genes candidatos, no potencial metastático de CTC no CRC, a sua expressão foi comparado numa série de carcinomas primários (N = 14) e pulmão (n = 7) e no fígado ( n = 7) metástases. Como mostrado na Figura 3A, a totalidade dos genes seleccionados foram regulados positivamente em metástases em comparação com lesões primárias, com sete das onze genes apresentando significância estatística. Entre eles, TIMP1 CLU e apresentou uma sobre-regulação específico nas metástases do fígado, sugerindo um papel potencial para estes genes na capacidade específica de tecido de CCRm CTC para colonizar o fígado (Figura 3B). Além disso, três dos onze genes seleccionados demonstrou um aumento significativo da expressão na frente invasiva dos tumores primários em comparação com a área superficial não-invasiva emparelhado, sugerindo uma ligação para a aquisição de um fenótipo agressivo (Figura 3C). Todos estes resultados comprovaram a estratégia para molecularmente perfil CTC em pacientes com CCRm, confirmando a presença da população CTC e o imuno-isolamento eficiente de CTC a partir de pacientes com CCRm, bem como a capacidade de caracterizar especificamente estas células ao nível molecular.

(a) diferenças de expressão gênica entre metástases pulmonares e hepáticas de pacientes com CCR (n = 14) e tumores primários (n = 14) para os onze genes validados. (B) As diferenças na expressão do gene para CLU e TIMP1 entre pulmão (n = 7) e no fígado (n = 7) metástases (M) em comparação com o tumor primário. (C) específico sobre-regulação de TGF-p1, TIMP1 e CLU na frente invasiva de tumores primários de CRC (n = 14) em comparação com a área de não-invasiva (* p 0,05; ** p 0,01; *** p 0,001).

Finalmente, o perfil molecular do CTC deve resultar na identificação de biomarcadores potencialmente fiáveis ​​para a detecção da população de pacientes com CCRm CTC. Para avaliar este ponto, a precisão dos genes RTqPCR validado na detecção de doença metastática foi avaliada numa série de pacientes e controlos CCRm. Como mostrado na Tabela 1, todos os genes validados apresentou excelentes valores em termos de discriminar AUROC (valores variando de 0,94 a 1; p-valor 0,0001). Além disso, e com a excepção de CD9 e TLN1, os biomarcadores seleccionados demonstrou um excelente comportamento como preditores de progressão da doença. Estes dados garantir novos estudos em grandes grupos de pacientes para o uso desses biomarcadores no contexto clínico.

Discussão

profiling Molecular é amplamente utilizada como uma poderosa estratégia para caracterizar tipos específicos de tumores, subtipos específicos de carcinomas ou eventos específicos associados com a carcinogênese. Para além de contribuir para a compreensão dos eventos moleculares associados com a génese e progressão do cancro, gene-expression profiling levou à identificação de alvos terapêuticos e marcadores, num esforço para melhorar a gestão de pacientes com cancro no ambiente clínico. Neste trabalho, procurou-se abordar com uma população muito específico e atraente de células tumorais que estão na origem de metástase, as células tumorais circulantes (CTC). Uma combinação de CTC imuno-isolamento, extração de RNA precisa de muito baixo número de células, a amplificação de todo o genoma e maciça gene-expressão de perfil para a caracterização e interpretação da biologia da CTC no câncer colorretal metastático é apresentado aqui. Para validar tecnicamente esta estratégia, o perfil dos CTC a partir de pacientes com CCRm foi abordado pela subtração do fundo da isolação não-específico de um grupo de controles saudáveis. O desafio seguinte é para comparar o perfil da população CTC gene-expressão com as lesões CRC primários e com as metástases evidentes, a fim de melhor compreender os mecanismos da adaptação das células tumorais durante o processo de metástase e a interferência com o meio ambiente. A subtracção do fundo de um grupo de controlo também foi considerado como mais relevante do que o fundo dos mesmos pacientes CCRm uma vez que exigiria duas rondas de isolamento CTC dentro das mesmas amostras, que representa uma fonte significativa de artefactos técnicos. Diferenças no fundo não podia ser excluída devido à doença metastática sistêmica, embora a análise da fracção restante após o isolamento CTC não prestou quaisquer diferenças dentro dos genes selecionados.

Em relação imuno-isolamento, e apesar de enriquecimento CTC com EpCAM anticorpos -coupled demonstrou ser superior a outros métodos de citometria e um método fiável para a detecção CTC em pacientes com CCRm [14], este procedimento de captura CTC suscitou algum debate devido à dependência desta técnica na expressão de EpCAM. Inicialmente descrito há 30 anos como um antigénio dominante em tecido de carcinoma de cólon humano, presume-se que uma diminuição da expressão de marcadores epiteliais ocorre durante o epitelial para mesenquimal (EMT) associado com a invasão tumoral [15]. Importante, EpCAM é aparentemente necessária para manter atributos de células de cancro distintas e, potencialmente, o fenótipo de células estaminais do cancro [16]. CD133 + células, atualmente um dos melhores marcadores para caracterização de células-tronco de câncer de cólon e um marcador de prognóstico independente que se correlaciona com baixa sobrevivência, são positivos para EpCAM [17]. Da mesma forma, os anticorpos contra EpCAM pode eficientemente direcionar células-Iniciando tumores colorretais [18], conferindo um valor considerável para a população CTC isolada-EpCAM em termos de intervenção terapêutica. Os dados aqui apresentados demonstraram conclusivamente o isolamento eficaz de CTC de pacientes com CCRm.

A principal realização deste trabalho foi a tradução do método descrito por Gonzalez-Roca et al. para o perfil de expressão exacta das populações de células muito pequenos [13], para uma população de células clinicamente relevante. amplificação transcriptoma Total permitiu a caracterização da população CTC isolado a partir de pacientes de CRC metastáticas, a nível molecular. Até à data, a maioria dos estudos têm descrito os níveis de um número limitado de genes em diferentes populações CTC expressão, principalmente para fins de detecção de [19], [20]. A abordagem aqui utilizada permitiu a caracterização molecular do CTC de CCRm, e a sua definição como uma população de células com capacidades migratórias e adesivas presumidos. Isto é consistente com uma sub-população de células de tumor que deve adquirir um fenótipo permitindo dissociação agressivo e invasivo da lesão primária, levando à invasão do estroma circundante e sua intravasamento e sobrevivência no fluxo sanguíneo. Além disso, estas células podem também extravasam e implantar com sucesso no tecido alvo distante para gerar um micrometástases [19]. A lista de genes fenotipicamente que caracterizam a população CTC a partir de pacientes com CCRm inclui candidatos relacionados a todas as funções acima descritas (Figura 4), garantindo mais estudos para definir sua implicação no comportamento metastático da população CTC no CRC. Os genes tais como VCL, ITGB5, BMP6 ou TGF-p1 têm sido associadas com a aquisição de um fenótipo invasivo [8], [21], [22], em parte através de EMT. Da mesma forma, TLN1, APP, CD9, LIMS1 e RSU1 têm sido relacionadas com a adesão e migração, com CD9 modulando a localização de TLN1, um regulador crítico da activação de integrina, para adesões focais [23], ou LIMS1 sendo associado com a adesão celular e integrina sinalização, e, em particular, com RSU1 e a via de Ras durante a migração celular [24]. Um passo fundamental no processo de disseminação do câncer é a capacidade de migrar e se avançar para e intravasate capilares sanguíneos próximos. Uma vez na circulação, CTC deve superar o sistema imunitário do hospedeiro, aumentando a sua resistência a apoptose entre outros mecanismos. Genes como TIMP1 e CLU são moléculas-chave relacionados a este processo [25]. Curiosamente, TIMP1 tem sido associada ao processo de resistência anoikis em diferentes modelos de cancro, permitindo a evasão de morte celular na ausência de ancoragem de substrato [26]. Ao atingir um órgão alvo, CTC deve ser capaz de extravasar e formam colónias, e CD9 tem sido descrita como essencial para o processo de implantação e formação de micrometástases associada com atributos de células estaminais, a qual está relacionada com estes eventos [27]. Curiosamente, uma sobreposição significativa foi encontrada com uma assinatura metástase específico do fígado no CRC [28] (ver Tabela S4), sugerindo uma implicação activa na tropismo e micrometástases potencial do CTC a este órgão no CRC. Em particular, e de acordo com a correlação da expressão em TIMP1 CTC e metástases do fígado, que tem sido descrito como um regulador do microambiente do fígado, aumento da susceptibilidade deste órgão a células tumorais [29]. No geral, o envolvimento dos genes selecionados nas capacidades de metástase do CTC também foi reforçado pela sua sobre-regulação nas metástases de pulmão e fígado em comparação com carcinomas colo-rectais primários.

In vitro

culturas CTC primárias e

in vivo

modelos para CTC em CRC vai certamente proporcionar pesquisadores com evidências robustas para validar o papel desses genes na capacidade da CTC para gerar micrometástases, e definir estratégias visando especificamente essa população de CTC metastático.

do conjunto de dados microarray resultante, alguns dos genes mais relevantes são mostrados em relação com certas características do processo de metástase.

do mesmo modo, em termos de biomarcadores para a gestão de pacientes com CCRm, a caracterização molecular dos CTC a partir de pacientes com CCRm rendeu ferramentas valiosas para a detecção e quantificação de doença metastática, bem como para a previsão da progressão da doença. A alta especificidade e sensibilidade demonstrada pelos genes acima descritos validados na população CTC a partir de pacientes com CCRm garante o estudo desses biomarcadores na avaliação da resposta terapêutica ou na seleção de pacientes para terapias direcionadas.

Em conclusão, este estudo descreveu, ao nosso conhecimento, o primeiro perfil molecular específica do CTC isoladas de pacientes com CCRm. Esta análise de expressão genética foi aplicada à caracterização desta população específica com adesivo presumido, capacidades migratórias e invasivos, bem como uma resposta modulada à morte da célula para a conclusão do processo de metástase. Além disso, a identificação de estratégias terapêuticas que visam especificamente a população CTC deve melhorar a eficácia na erradicação e prevenção da CRC metástase, enquanto um arsenal de marcadores valiosos altamente específicos e sensíveis deve ter impacto sobre a gestão e acompanhamento de pacientes com CCR metastático.

Materiais e Métodos

os pacientes

Todos os participantes assinaram termo de consentimento aprovado especificamente para este estudo pela Comissão de Ética do Complexo Hospitalar Universitário de Santiago de Compostela (código de aprovação: 2009/289). Os critérios de inclusão para os pacientes com CCRm foram a presença de mCRC mensurável e um performance status Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) não superior a 2. Saudável controla com a ausência de um episódio de câncer anterior e uma idade combinada com os pacientes foram selecionados. Informação detalhada sobre os pacientes incluídos na análise está disponível na Tabela S1.

CTC imunoisolamento

CTC foram isolados usando o kit CELLection ™ epitelial Enrich (Invitrogen, Dynal), de acordo com as instruções dos fabricantes. Resumidamente, 7,5 mL de sangue de pacientes com CCRm e controlos saudáveis ​​foram incubadas durante 30 minutos a 4 ° C com 100 ul de contas magnéticas. Após a lavagem, as CTC acoplado a pérolas magnéticas foram directamente ressuspensas em 100 ul de solução RNAlater® (Ambion) e armazenados a -80 ° C até ser processado para extracção de ARN.

Gene Expression Análise

o ARN total a partir CTC foi extraída com o ARN viral Mini kit QIAmp (Qiagen), especificamente desenhado para amostras muito baixa celularidade. RNA purificado foi próxima submetido a uma reacção de amplificação transcriptoma todo (WTA2, Sigma Aldrich), Cy3 marcado e hibridado para Agilent 4 × 44 k matrizes de expressão genética. O processamento de sinal e de filtragem, assim como análise de dados de expressão de genes são descritas em detalhe em material suplementar. dados de expressão gênica é acessível em banco de dados (número de acesso: GSE31023) Gene Expression Omnibus NCBI (GEO).

Real-Time PCR quantitativa Validação

validação

RTqPCR foi realizado em um conjunto independente de 10 controles saudáveis ​​e pacientes com câncer colorretal metastático 20 estádio IV (ver Tabela S1). CTC foram isolados como descrito, e o ARN foi purificado com um veículo de ARN para aumentar o rendimento e a estabilidade. O ADNc foi sintetizado utilizando química SuperScriptIII (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante. Para optimizar ainda mais a sensibilidade de detecção, foi realizada uma etapa de pré-amplificação utilizando o kit TaqMan ® PreAmp Master Mix (Applied Biosystems) com 14 ciclos de reacção. produtos foram submetidos a pré-amplificado TaqMan® em tempo real a amplificação por PCR para onze genes candidatos (ver Tabela S3 para detalhes de ensaio).

Além disso, avaliou-se por RTqPCR os níveis de expressão dos genes candidatos na fracção celular remanescente upon CTC imuno, em 5 pacientes com CCRm e 5 controlos saudáveis. Em resumo, foi realizada uma lise vermelhas do sangue na fracção remanescente após incubação EpCAM-imune grânulo e isolamento CTC, e o RNA foi purificado a partir das restantes células sanguíneas nucleadas com o RNeasy Mini Kit (Qiagen). quantidade e a pureza do RNA foram avaliados por medição NanoDrop, o ADNc foi sintetizado utilizando transcriptase reversa MuLV sistema (Applied Biosystems) e TaqMan® qPCR foi realizado para os genes candidatos onze.

valores de expressão para cada um dos genes foram normalizados para CD45 como um marcador de isolamento não-específica. Dobre diferenças de mudança entre pacientes e controles foram analisados ​​estatisticamente com o software GraphPad Prism, aplicando-se o teste t de Mann-Whitney não paramétrico e considerando um valor de p . 0,05 como significativo

Análise

Expressão Gênica em tumores primários e metástases

carcinomas colo-rectais primários (n = 14) e metástase (metástase hepática, n = 7; metástases pulmonares, n = 7) foram processadas pelo Departamento do Complexo Hospitalar Universitário de Santiago de Compostela Patologia. A zona não-invasivo superficial e profunda área invasivo dos tumores primários foram macroscopicamente dissecados, garantindo percentagens de tumores semelhantes. O ARN foi purificado (reagente TRIZOL, Invitrogen; kit RNeasy, Qiagen), o ADNc foi sintetizado (MuLV da transcriptase reversa, Applied Biosystems), e a expressão do gene foi avaliada (TaqMan RTqPCR, Applied Biosystems). Os dados foram representados como a mudança vezes relativamente à expressão na região superficial não-invasivo. GAPDH foi usada como controlo de carga. Não paramétrico t-teste de Mann-Whitney foi usado para significância estatística considerando valor-p . 0,05

Área sob a Curva ROC (AUROC) e Análise de Kaplan-Meier

A precisão do os genes onze candidatos como biomarcadores para o diagnóstico foi avaliado com curvas ROC, enquanto as curvas de Kaplan-Meier foram construídas para a sua avaliação como marcadores para prognóstico. valores de corte foram definidos como os valores de melhor ajuste para cada marcador. vezes os pacientes sem progressão de sobrevivência foram estabelecidos como o tempo decorrido entre o início linha de quimioterapia e progressão da doença avaliada por imagem, ou paciente mortos por qualquer causa.

Informações de Apoio

Figura S1.

Imagens representativas de células epiteliais isoladas do sangue do paciente mCRC.