Abstract

G503 é um composto antraquinona isolado dos metabólitos secundários de um fungo endófito de mangue do Mar do Sul da China. O presente estudo elucida a actividade anti-tumoral e o mecanismo subjacente de G503. ensaio de viabilidade celular realizada em nove linhas celulares de cancro e duas linhas de células normais demonstrado que a linha celular de cancro gástrico é SGC7901 as células de cancro mais sensíveis-G503. G503 induzida morte celular por apoptose SGC7901. exposição G503 caspases-3, -8 e activados -9. O pré-tratamento com o inibidor da pan-caspase Z-VAD-FMK e caspase-9-Z inibidor de LEHD-FMK, mas não de caspase-8 IETD-inbibitor Z-FMK, atenuou o efeito de G503. Estes resultados sugerem que a via de apoptose mitocondrial intrínseca, em vez do que a via extrínseca, estava envolvida na apoptose induzida por G503. Além disso, G503 aumentou a razão de Bax para Bcl-2 nas mitocôndrias e diminuiu a proporção no citosol. tratamento G503 resultou em despolarização mitocondrial, a libertação do citocromo C e a subsequente clivagem das caspases -3 e -9. Além disso, é relatado que a via do retículo endoplasmático apoptose pode também ser activado por G503 induzindo Capase-4 clivagem. Tendo em consideração o menor concentração de 50% de inibição de células cancerosas gástricas, G503 pode servir como um candidato promissor para quimioterapia do câncer gástrico

Citation:. Huang L, Zhang T, Li S, Duan J, Ye F, Li H, et ai. (2014) antraquinona G503 induz a apoptose em células de cancro gástrico através do mitocondrial Caminho. PLoS ONE 9 (9): e108286. doi: 10.1371 /journal.pone.0108286

editor: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha |

Recebido: 19 Abril, 2014; Aceito: 19 de agosto de 2014; Publicação: 30 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Huang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento: Este estudo foi apoiado pelo National Nature Science Foundation da China, Número Grant:. 30973449, 81172163, 81272515, 81272338, 81200706; National Key Sci-Tech Projeto Especial da China, Número Grant: 2009ZX09103-642, 2013ZX09102053; Programa de Estação de Doutorado na Universidade, Número Grant: 20120171110053, 20130171110053; Projeto chave da Nature Science Foundation da província de Guangdong, China, Número Grant: 10251008901000009; Key Sci-tech Projeto de Pesquisa da província de Guangdong, China, Número Grant: 2011B031200006; Fundo de Ciência Natural Guandong, Grant Number: S2012010009250, S2012040006986; Key Sci-tech Projeto de Pesquisa de Guangzhou Município, China, Número Grant: 2011Y1-00017-8, 12A52061519; Programa de Professor novo na Universidade, Número Grant: 10YKPY28; Changjiang Estudiosos e Equipe de Pesquisa Inovativa na Universidade, número: 985. Projeto PCSIRT 0947. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses: O os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

a cirurgia, radioterapia e quimioterapia são os tratamentos de tumores clínicos primários. No entanto, a cirurgia ea radioterapia são ineficazes em câncer metastático; Se a quimioterapia é utilizada adequadamente, metástase pode ser inibida [1]. No que diz respeito ao desenvolvimento de drogas anti-câncer, antraciclinas são as drogas mais eficazes anti-câncer [2]. Produtos naturais dos oceanos são importantes fontes de drogas anti-câncer inovadoras [3]. metabolitos de microorganismos marinhos com estruturas únicas e atividades farmacológicas são normalmente utilizados como compostos antitumorais principais [4]. compostos de antraquinona, como a daunorubicina, doxorubicina, epirubicina e mitoxantrona, são os mais eficazes medicamentos clínicos anti-câncer [2]. A antraquinona marinho SZ-685C suprime a proliferação do cancro da mama humano [5] – [6] e células de carcinoma nasofaríngeo humano (NPC) [7]. Huang et ai. demonstraram que antraquinonas de ruibarbo, tais como emodina, de aloe-emodina e Rhein, inibir o crescimento e proliferação de várias células de cancro, tais como adenocarcinoma do pulmão, leucemia mielóide, neuroblastoma, carcinoma hepatocelular, cancro da bexiga e outras [8].

o mecanismo da actividade antitumoral de antraquinonas está principalmente envolvida nos seguintes aspectos [9] – [10]: interações de DNA através da ligação, intercalando e interferindo separação da dupla fita de DNA; efeitos de membrana diretos; dano do DNA em resposta à inibição topoisomerase II ou a geração de radicais livres, tais como espécies de oxigénio reactivas (ROS), e a indução da apoptose por meio de inibição da topoisomerase II, p53 funcional ou a produção de ROS. Além disso, antraquinonas também desencadear a apoptose através da JNK (quinase c-Jun N-terminal) [11], Akt /PKB (Proteína Quinase B) [5], [12] e vias mitocondriais [13] – [14].

G503 é um composto antraquinona isolado dos metabólitos secundários do mangue endofíticos fungo No. 1403 do Mar do Sul da China [15] .No entanto, se o G503 possui um potencial anticancerígeno como um composto antraquinona não foi investigada. Portanto, o presente estudo foi desenhado para elucidar a actividade anti-tumoral de G503 e o mecanismo subjacente envolvido.

Materiais e Métodos

produtos químicos e reagentes

3- (4 , 5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-diphenylterazolium (MTT) e ROS eliminador de N-acetil-cisteína (NAC) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Hochest 33342, carboxi-H2DCFDA, MitoProbe DiOC2 (3) Kit de Ensaio e MitoProbe Transição Pore Assay Kit (M34153) foram obtidos da Invitrogen (EUA). Anexina V-FITC (isotiocianato de fluoresceína) /PI (iodeto de propídio) Apoptosis Kit de Detecção foi comprado de Keygen (Nanjing, Jiangsu, China). meio RPMI1640 e soro fetal de bovino (FBS) foram de Hyclon (Logan, UT, EUA

).

caspase-8 IETD-inibidor Z-FMK, a caspase-9-Z inibidor de LEHD-FMK e caspase-família inibidor Z-VAD-FMK eram da Calbiochem (Gibbstown, NJ, EUA) e Beyotime (China). Os anticorpos contra a caspase-3, caspase-4, caspase-8, caspase-9 e anticorpo COXIV foram de Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EUA). Os anticorpos contra o citocromo

C

, Bax, Bcl-2, p38, p-p38 e anti-cabra IgG-HRP foram de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). De ratinho anti-β-actina e antibodywere primário anti-GAPDH da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Anti-coelho IgG-peroxidase e anti-IgG de ratinho-peroxidase eram de Vector (Burlingame, CA, EUA) estojo de isolamento de .Mitochondria foi adquirido a partir de Pierce (Pierce, IL, EUA), kit de ensaio de proteínas foram adquiridos de Bio-Rad (Hercules , CA, EUA), eo kit de detecção ECL eram de Applygen Technologies Inc (Pequim, China).

fermentação, extração e isolamento de G503 a partir de

Nigrospora

sp. No. 1403

NO.1403 foi isolado de madeira em decomposição de

Kandeliacandel

(L.) Druce e reidentificado como

Nigrospora

sp. (Número Genebank adesão: HQ891110), coletados de Mai Po, Hong Kong, e um lago de sal nas Bahamas. G503 foi isolada e purificada a partir dos metabólitos secundários de NO. 1403 [15]. fermentos foram mantidas em agar água salgada de farinha de milho. Tomadas de ágar que suportam o crescimento de micélio foram cortadas e transferidas assepticamente para um balão de Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL de meio líquido (glicose 10 g /L, peptona a 2 g /L, extracto de levedura, 1 g /L, NaCl

2 g /L, pH 7,0 D). O frasco foi incubado a 28 ° C. Depois de agitação num agitador rotativo durante 3-5 dias, o micélio foi assepticamente transferido para um balão de Erlenmeyer de 500 ml contendo meio de cultura líquido (200 ml). O frasco foi então incubado a 28 ° C durante 25 dias.

As culturas (150 L) foram filtrados através de gaze. O filtrado foi concentrado para 5 L abaixo de 50 ° C e extraiu-se três vezes por agitação com um volume igual de acetato de etilo. Os extractos orgânicos combinados foram submetidas a uma coluna de gel de sílica, e eluída com um gradiente de éter de petróleo até acetato de etilo para produzir o composto.

O composto foi dissolvido em dimetil sulfóxido (DMSO) a uma concentração de estoque de 50 mmol /L e diluiu-se para concentrações específicas antes da utilização

cultura celular

HUVEC foram isoladas a partir dos cordões da veia umbilical humana de partos normais e cultivadas seguindo um protocolo previamente descrito [16] -. [ ,,,0],17]. células de fígado de Chang e as linhas de células de tumor de afiar-1, 2-CNE, 5-8F, HepG2, B7402, Rb, PC3, A549 e SGC7901, AGS foram mantidas por nosso laboratório e cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, 100 U /mL de estreptomicina e 100 U /mL de penicilina (Gibco) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2. Este estudo está em conformidade com os princípios enunciados na Declaração de Helsínquia, aprovada pela Comissão de Ética Médica de Sun Yat-Sen University, e consentimento informado por escrito foi obtido a partir do doador.

A viabilidade celular ensaio

As células foram semeadas a uma densidade de 2 × 10

4 células /mL em placas de 24 poços (HUVECs foram semeadas em placas de 24 poços revestidas com gelatina). Quando as células alcançaram uma densidade de 60% -70%, foram tratados com várias concentrações de G503 durante 48 h em meio RPMI 1640 (1 mL /poço) sem FBS; os grupos de controlo negativo foram tratados com PBS. Subsequentemente, 100 pL de MTT (5 mg /ml) dissolvido em PBS foi adicionado a cada poço e incubou-se durante mais 4 horas para permitir a formação de formazancrystals. Os cristais foram solubilizados em 1 ml de DMSO em cada cavidade. Os valores de densidade óptica (OD) da solução de cor púrpura que representada a viabilidade celular foi medida a 570 nm [18] – [19]. Depois de três experiências independentes, a sobrevivência das células foi calculada utilizando a seguinte fórmula: sobrevivência (%) = (valor médio experimental /valor médio de controlo) × 100%. Os valores foram expressos como a concentração inibidora em 50% (IC

50), o qual foi calculado pelo método de regressão linear na gama.

Hoechst 33342 coloração ensaio

SGC7901 células foram plaqueadas em placas de 6 poços a uma densidade de 10

5 células por cavidade e tratadas com concentrações que variam de 0 G503 umol /L a 40 nmol /L durante 24 h. As células foram marcadas com 10 ug /ml de Hoechst 33342 [20] durante 10 min a 37 ° C e observadas utilizando microscopia de fluorescência (Olympus X71-A12FL /PH).

ensaio de coloração Anexina V-FITC /PI

SGC7901 células foram recolhidas a uma densidade de 5 x 10

5 para 5 × 10

6 /mL após tratamento G503 em concentrações que variam de 0 umol /L a 40 nmol /L durante 24 h em placas de 6 poços; células tratadas com 25 nmol /L a colchicina foram usadas como controlo positivo. As células foram então lavadas e coradas de acordo com as instruções do fabricante (Anexina V-FITC /PI Apoptosis Detection Kit). Resumidamente, as células foram ressuspensas em 500 ul de 1 × tampão de ligação. Em seguida, 5 ul AnnexinV-FITC e 5 mL de 20 ug /mL de PI foi adicionada à amostra e incubou-se à temperatura ambiente durante 15 min no escuro. As amostras manchadas foram então avaliadas por citometria de fluxo (Becton Dickinson, NJ, EUA) para identificar células apoptóticas.

Determinação do potencial de membrana mitocondrial

SGC7901 células foram plaqueadas em placas de 6 poços. Após a obtenção de uma densidade de 60%, as células foram tratadas com 20 pmol /L G503 durante 18 h e, em seguida, recolhidos para avaliar o potencial de membrana mitocondrial de acordo com as recomendações do fabricante (MitoProbe DiOC2 (3) Kit de Ensaio). Resumidamente, 1 x 10

6 células /mL foram novamente suspensos em 37 ° C de PBS. Os grupos de controlo positivo foram pré-tratadas com 1 mL de 50 mmol /L de CCCP a 37 ° C durante 5 min. Todos os grupos foram então tratadas com 5 L de 10 umol /L DIOC

2 (3) durante 30 min a 37 ° C e avaliadas por citometria de fluxo. O potencial de membrana mitocondrial foi calculado com base na seguinte equação:. Mitocondrial potencial de membrana = (intensidade de fluorescência vermelha) /(intensidade de fluorescência verde)

Detecção da abertura das mitocôndrias Transição de Permeabilidade Pore (PTPm)

SGC7901 células foram plaqueadas em placas de 6 poços. Após a obtenção de uma densidade de 60%, as células foram tratadas com 20μmol /G G503, durante 18 h e recolhido para avaliar PTPm abertura por citometria de fluxo (Becton Dickinson, NJ, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante (MitoProbe Transição Pore Assay Kit). Em resumo, cada amostra foi dividida em 3 partes alíquotas e tratadas como se segue: uma ali quota foi tratada com 5 mL de 2 pmol /L calceína AM no escuro; aliquota foi tratada com 2 5 ul de calceína AM e 5 ul de 80 mmol /L CoCl

2 no escuro; e 3 aliquota foi tratada com 5 ul de calceína AM, 5 uL CoCl

2 e 5 mL de 100 umol /L ionomicina. As alíquotas foram então incubadas a 37 ° C durante 15 min no escuro. Depois de ter sido lavada com HBSS /Ca

2+ e re-suspensas em 400 uL de HBSS /Ca

2+, as células foram avaliadas por citometria de fluxo dentro de 1 h. A condição de abertura PTPm é calculado como se segue: (fluorescência de 2- alíquota a fluorescência da alíquota 3) /(a ​​fluorescência da alíquota 1- a fluorescência da alíquota 3). A calceina AM penetra no citoplasma e organelos, incluindo as mitocôndrias. CoCl

2 sacia calceína AM de fluorescência no citoplasma, mas não nas mitocôndrias. A calceina AM transloca-se para o citoplasma da mitocôndria quando MPTP é aberta, e a fluorescência é atenuada por CoCl

2.

Isolamento de mitocôndrias de células e citoplasma

SGC7901 células foram plaqueadas em placas placas de 100 mm; cada grupo foi plaqueada em duas placas. Depois de atingir 60% -70% de confluência, as células foram tratadas com ou sem 20? Mol /L G503 durante 18 h. Após o tratamento, as fracções mitocondriais e citoplasmáticos foram obtidos de acordo com as instruções do fabricante (kit de isolamento de mitocôndrias).

análise de transferência de Western

Como descrito anteriormente, as células foram lisadas em tampão RIPA [21] . As concentrações de proteína de mitocôndria, e citoplasma de células inteiras foram detectadas pelo método de BCA utilizando o kit de ensaio de proteína Bio-Rad. No total, 60 ug de proteínas de cada grupo foram separados por 12% ou 15% de electroforese em gel de dodecilsulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE) de sódio. As proteínas a partir de SDS-PAGE foram transferidas para uma membrana de PVDF. Após os locais de ligação não específicos das membranas foram bloqueadas durante 1-2 h à temperatura ambiente com tampão de TBST contendo 10% de leite não gordo, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com o anticorpo primário de acordo com as instruções do fabricante. Os anticorpos secundários, com ou sem fluorescência conjugados com os anticorpos primários relevantes foram incubadas durante 2 h à temperatura ambiente. As membranas com anticorpos secundários fluorescentes foram avaliados usando o sistema Odyssey (Li-COR, Nebraska, EUA) para digitalizar as bandas fluorescentes [22], e as membranas com anticorpos secundários normais foram visualizados utilizando o kit de detecção ECL para imunotransfer�cias. As membranas foram retirados e re-sondadas com β-actina ou anticorpos COXIV. β-actina foi utilizado como padrão interno para o lisado de células totais e extracções citoplasmáticos, enquanto COXIV foi utilizado como controlo para as extracções mitocondriais. A análise densitométrica das bandas foi realizada utilizando Quantidade One (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) [23].

A análise estatística

Todos os dados foram apresentados como médias ± SD, pelo menos, triplicado determinações . SPSS 13.0 foi utilizado para análise t-teste e one-way de Student de variância (ANOVA), em todas as análises estatísticas. A

P

valor 0,05 foi considerado estatisticamente significativo em todos os casos.

Resultados

G503 mediada por inibição da proliferação é a mais potente em células SGC7901 entre as 11 linhas celulares examinadas

Utilizou-se o ensaio MTT para determinar se o composto de antraquinona G503 é citotóxico nas seguintes linhas de células: duas linhas celulares normais (células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) e células de fígado Chang e nove linhas celulares de tumores (HONE -1, 2-CNE, 5-8F, HepG2, B7402, Rb, PC3, A549 e SGC7901). Todas as células foram incubadas com 0, 2,5, 5, 10, 20 ou 40 umol /L G503 durante 48 h. As viabilidades celulares foram medidos utilizando o ensaio de MTT como se referiu, e o

valor de IC50 para SGC7901 células era a mais baixa, ao passo que o IC

50 valores para as linhas de células normais, as células do fígado HUVEC e Chang, foram significativamente maiores do que SGC7901 ( tabela 1).

G503 induz a apoptose em células de cancro gástrico SGC7901 e AGS

Dado que a linha de células SGC7901 foi o mais sensível ao G503 das onze linhas celulares examinadas (tabela 1 ), nós investigamos ainda mais esta linha celular separadamente. SGC7901 células foram corados com Hoechst 33342 para determinar se o efeito inibidor foi relacionada com apoptose. Os resultados indicam um aumento no número de células que exibem o encolhimento e a condensação da cromatina nuclear com concentrações crescentes G503 (Figura 1A). Além disso, para investigar se G503 induz a apoptose em outras linhas de células do cancro gástrico, também foram examinadas células de cancro gástrico AGS. coloração de anexina V /PI foi utilizada para analisar os efeitos de G503 em SGC7901 e células de cancro gástrico AGS por citometria de fluxo. Para estas experiências, 25 umol /L colchicina foi utilizado como controlo positivo. Após tratamento com 0 nmol /L, 2,5 nmol /L, 5 nmol /L, 10 nmol /L, 20 nmol /L e 40 mmol L G503 /e 25 umol /L colchicina durante 24 h, a percentagem de células SGC7901 apoptóticas estavam 5,625% ± 0,50%, 6,19% ± 0,13%, 10,25% ± 0,47%, 16,99% ± 1,73%, 25,72% ± 0,55%, 31,03 ± 1,03% e 20,69% ± 1,91%, respectivamente (Figura 1B); a percentagem de células AGS apoptóticas foram 15,37% ± 2,36%, 19,30% ± 4,45%, 22,72% ± 4,89%, 24,93% ± 4,76%, 30,44% ± 9,42%, 47,51% ± 18,29% e 31,49% ± 2,45%, respectivamente (Figura 1C). A detecção de apoptose em células AGS e os resultados acima indicaram que G503 induz apoptose de células de cancro gástrico de uma forma dependente da dose.

células SGC7901 (A) foram tratados com várias concentrações de G503 (0-40 umol /L ) durante 24 h e corados com Hoechst 33342. as setas vermelhas indicam as células apoptóticas. células AGS (C) (B), (C) SGC7901 células (B) e foram analisados ​​por citometria de fluxo após tratamento com vários concentrations- G503 durante 24 h. Para a análise quantitativa de SGC7901 induzida por G503 e apoptose celular AGS, todos os dados são apresentados como a média ± DP de três experiências independentes. * E ** representam

P Art 0,05 e

P

. 0,01, respectivamente

G503 induz a apoptose em um dependente de caspase forma

Para investigar adicionalmente o mecanismo envolvido na apoptose induzida por G503 em células de cancro gástrico, estudamos SGC7901 células. Caspase-3 é uma caspase efectora, que pode entrar núcleo e interagir directamente com o seu substrato, promovendo assim a apoptose das células [24]. Caspse-9 é a caspase iniciador que activa caspse-3 [25]. As células foram tratadas com várias concentrações de G503 para os tempos indicados e recolhidos para avaliar a caspase-3 e -9 por Western blotting. A expressão do precursor da caspase-3 diminuiu em uma dose e modo dependente do tempo, ao passo que os fragmentos de clivagem de caspase-3 em um aumento da dose e dependente do tempo da forma (Figura 2A, B). A expressão do precursor da caspase-9 e também diminuiu os fragmentos de clivagem aumentou depois as células foram tratadas com 20 pmol /L durante 24 h G503 (Figura 2C). Estes efeitos são abolidos pelo inibidor da pan-caspase Z-VAD-FMK (Figura 2C, D). Consistente com a activação de caspase-9 e -3, as taxas de células apoptóticas induzidas por 20 induzida umol /L G503 em SGC7901 células foram marcadamente reduzida após pré-tratamento com Z-VAD-FMK (Figura 2E). Estes dados sugerem que a G503 induz a apoptose em células SGC7901 em uma maneira dependente da caspase.

(A), (B) As células foram tratadas com várias concentrações de G503 durante 24 h (a) e tratou-se com 20 mmol /L G503 para vários tempo (B). Todas as proteínas foram extraídas celluar e os níveis da proteína caspase-3 foram analisados ​​por transferência de Western. (C) – (E) As células foram pré-incubadas com Z-VAD-FMK durante 30 min antes tratados com 20μmol /L G503 durante 24 h. Todas as proteínas foram extraídas celluar e caspase-9 (C), -3 (D), os níveis de proteína foram analisados ​​por transferência de Western. As taxas apoptóticas celulares foram determinados por citometria de fluxo (E). Todos os valores são apresentados como a média ± SD de pelo menos três experiências independentes (*

P Art 0,05, **

P Art 0,01 vs. controlo).

G503 induzida por apoptose não é dependente de caspase-8

Para investigar se o circuito apoptótico mediado por receptor de morte é induzida por G503, que estudou a caspase-8, caspase o iniciador da morte receptor- via apoptótica mediada [26]. SGC7901 células foram tratadas com diferentes doses de G503 para os tempos indicados. As células foram recolhidas para se medir a caspase-8 por Western blotting. Os resultados indicam que a caspase-8 precursora diminuiu e clivada da caspase-8 aumentado em um tempo e dose-dependente maneira (Figura 3A, B). As células foram pré-tratados com 20 nmol /L de inibidor de caspase-8 IETD-Z-FMK durante 30 min e depois tratou-se com 20μmol /L G503 durante 24 h. A proforma da caspase-8 aumentado em células co-tratadas com o inibidor de caspase-8 e G503 comparado com as células tratadas apenas com G503. No entanto, a proforma de caspase-9 clivada, caspase-9 e caspase-3 foram mantidas a níveis semelhantes em células tratadas com o inibidor de caspase-8 e G503 ou G503 sozinho (Figura 3C). Consistente com a Figura 3C, as taxas de células apoptóticas induzidas por G503 em SGC7901 células não foram reduzida pelo pré-tratamento com Z-IETD-FMK (Figura 3D). Estes dados sugerem que, apesar de activação por G503, a caspase-8 não está envolvido na actividade pró-apoptótica de G503.

(A), (B) As células foram tratadas com 20μmol /L G503 durante vários tempos (A ) e tratados com várias concentrações de G503 (0-40 umol /L) durante 24 h (B). As proteínas celulares totais foram extraídos para detectar os níveis de caspase-8 por Western blotting. (C), (D) As células foram pré-incubadas com 20 nmol /L Z-IETD-FMK durante 30 min e subsequentemente tratada com 20 pmol /L durante 24 h G503. As proteínas celulares foram extraídos para detectar os níveis de caspase -8, -9 e -3 por Western blotting (C). As taxas apoptóticas celulares foram determinados por citometria de fluxo (D). Todos os valores são apresentados como a média ± SD de pelo menos três experiências independentes (*

P Art 0,05, **

P Art 0,01 vs. controlo).

G503 induzida pela é dependente de caspase-9

a caspase-9, caspase o iniciador da via apoptótica mitocondrial, pode ser activada através da combinação com o citocromo

C

(Cyto

C

) e apoptótica-protease factor de activação-1 (Apaf-1) [25] – [26]. Para investigar se a via mitocondrial está envolvida na apoptose induzida por G503, a activação de caspase-9 foi avaliada após o tratamento G503 a várias concentrações e os tempos. Além disso, a taxa celular apoptótica também foi medido em presença de co-tratamento com G503 e caspase-9-Z inibidor de LEHD-FMK. Os resultados indicam que a caspase-9 proforma diminuída e os fragmentos de clivagem aumentada de tempo e modo dependente da dose (Figura 4A, B). Em seguida, as células foram pré-tratados com 20 nmol /L Z-LEHD-FMK durante 30 min e co-incubadas com 20 nmol /L durante 24 h G503. Para quantificar as células apoptóticas, as células foram coradas com AnnexinV /PI e analisadas por citometria de fluxo. Os resultados indicaram que a taxa de diminuição de células apoptóticas quando as células foram co-tratados com Z-LEHD-FMK e G503 (Figura 4C). Tomados em conjunto, estes dados indicam que a apoptose induzida por G503 SGC7901 célula é dependente de caspase-9 activação.

(A), (B) As células foram tratadas com 20μmol /L G503 durante vários tempos (A) e tratada com várias concentrações de G503 durante 24 h (B). As proteínas celulares foram ectracted e os níveis da proteína caspase-9 foram analisados ​​por transferência de Western. (C) As células foram pré-incubadas com Z-LEHD-FMK durante 30 min seguido por 20 pmol /L durante 24 h G503. A taxa de apoptose celular foi detectada por citometria de fluxo. Todos os valores são apresentados como a média ± DP de pelo menos três experiências independentes. * E ** denotam

P Art 0,05 e

P

. 0,01, respectivamente

G503 induz a apoptose através da via apoptótica mitocondrial

é bem conhecido que a via mitocondrial é importante uma via apoptótica. Para investigar se a G503 induz a apoptose através da via mitocondrial, examinámos as proteínas relacionadas com a apoptose, o potencial de membrana mitocondrial (MMP), e a abertura do PTPm para confirmar a indução da via apoptótica mitocondrial. Siga por tratamento G503, fluorescência mitocondrial diminuiu em comparação com o grupo controle (Figura 5A), sugerindo assim que MPTP foi aberta pelo G503. Além disso, como mostrado na Figura 5B, a intensidade considerável vermelho /verde fluorescente foi observada no grupo de controlo. No entanto, após o tratamento com 20 nmol /L de G503, a /intensidade da fluorescência verde vermelho foi reduzida. Este resultado sugeriu que G503 diminui o potencial de membrana mitocondrial de células SGC7901. Além disso, o total Cyto

c

níveis de proteína não variou significativamente entre o grupo controle e de drogas; No entanto, Cyto

C

foi relocalizada para o citoplasma da mitocôndria (Figura 5C). Bax e Bcl-2 são fatores cruciais na regulação dos canais mitocondriais ea liberação de várias proteínas relacionadas à apoptose [27]. Portanto, estudamos a distribuição de Bax e Bcl-2 em diferentes compartimentos celulares e não observamos uma mudança importante nos níveis de proteínas totais de Bax e Bcl-2 entre o grupo controle e de drogas; No entanto, G503 promoveu a translocação de Bax do citoplasma para as mitocôndrias, bem como a translocação da proteína Bcl-2 a partir das mitocôndrias para o citoplasma (Figura 5D). Tomados em conjunto, G503 induz a apoptose em células SGC7901 através da via mitocondrial.

Células (A) foram tratados com 20 nmol /L de G503 durante 18 h, e a abertura PTPm foi detectada utilizando a permeabilidade da membrana mitocondrial de fluorescência corante calceína AM e citometria de fluxo. (B) As células foram tratadas com 20 pmol /L G503 durante 18 h, e o potencial de membrana foi detectado utilizando citometria de fluxo. “CCCP” é o reagente de controlo positivo no kit de ensaio. (C), (D) As células foram tratadas com G503 durante 18 h. extratos de proteína total foram coletadas para Western blot para avaliar os níveis de Cyto

c

(C) e Bax /Bcl-2 (D) na proteína total, mitocondrial e frações citoplasmáticos. Todos os valores são apresentados como a média ± SD de pelo menos três experiências independentes (*

P Art 0,05, **

P Art 0,01 vs. controlo).

G503 induz a apoptose em células SGC7901 em parte por meio de caspase-4 activação

caspase-4 pode activar directamente caspase-9, mas não através da via mitocondrial [28] – [29]. Para investigar se a caspase-4 é activado por G503 e se activado caspase-4 ativa a caspase-9, foram examinados os fragmentos de clivagem de caspase-4 e -9. Os resultados indicaram que o fragmento de clivagem de caspase-4 aumentou significativamente em células tratadas com G503 em comparação com o grupo controlo (Figura 6A). O tratamento com o inibidor de caspase-4-Z-FMK LEVD aumento da proforma de caspase-9, o que não foi detectado no grupo tratado com G503 (Figura 6B). Estes resultados indicaram que induz G503 SGC7901 apoptose de células de cancro gástrico, em parte, através da activação de caspase-4.

Células (A) foram tratados com 20 nmol /L de G503 durante 24 h, e extractos de proteínas totais foram recolhidos para western blotting. (B) As células foram SGC7901 pré-incubadas com 20 nmol /L Z-LEVD-FMK durante 30 min seguido por 20 pmol /L durante 24 h G503. Os extratos de proteínas celulares foram usados ​​para detectar os níveis de caspase-9 por transferência de Western.

Discussão

É relatado que

p

porção -quinona de quinona contendo molecular desempenha um papel muito importante no potencial anti-cancro [30]. Perchellet et ai. Também descobriu que J4 p-quinona, o-quinona J1 e não substituído J7 modelo p-quinona reduziu a viabilidade das células do tumor L1210 mais entre oito compostos sintetizados e rastreados no seu estudo preliminar [31]. Para compreender a relação entre o potencial anti-cancro de altersolanol A e estrutura-actividade, Teiten et ai. avaliado o efeito dos seus derivados de antraceno relacionados altersolanol A e: tetraacetylaltersolanol A, B e tetrahydroaltersolanol ampelanol. Eles descobriram que apenas altersolanol A e o seu derivado acetilado tetraacetylaltersolanol Um presente um efeito citotóxico sobre células K562, enquanto que derivados com a redução de um dos grupos carbonilo, tais como tetrahydroaltersolanol B e ampelanol, não têm qualquer efeito [32]. O

p

-quinona estrutura do G503 (Figura S1) também podem ter contribuído para a apoptose de células cancerígenas, e na próxima pesquisa vamos analisar o G503 e seus derivados para identificar a relação preliminar estrutura-actividade. Neste estudo, descobrimos que a linha celular de cancro gástrico SGC7901 é a linha de células de cancro mais sensíveis G503-examinada utilizando um ensaio de viabilidade celular em nove linhas celulares de cancro e duas linhas de células normais. G503 induz a morte celular de cancro gástrico SGC7901 através de apoptose de um modo dependente da dose. Outro gástricas células cancerosas AGS também é examinada, e é sensível à apoptose induzida por G503 bem. Como resultado, 20 umol /L G503 é a concentração óptima, que induz a apoptose grave.

O genoma humano codifica, pelo menos, 10 tipos de homólogos de caspases. Os seguintes homólogos de caspases participam na apoptose: Caspase-2, -3, -8, -9 e -10 [33]. Embora as caspases desempenhar um papel na apoptose, existem existem várias vias independentes de caspase. Por exemplo, na presença de inibidores de caspase, factor de necrose tumoral (TNF), induz a necrose celular, que possui as características de apoptose e necrose [34] – [36]. Além disso, o factor indutor de apoptose (FIA) é uma enzima que degrada o ADN directamente ADN. Quando o potencial de membrana mitocondrial é alterada, FIA é libertado para o citoplasma das mitocôndrias e é activado pela sua interacção com cyclophilinA [37] – [38]. Endo G também pode degradar DNA diretamente em um modo independente de caspase [39].

Em nosso estudo, a exposição G503 ativa a caspase-3, -8 e -9 em uma dose e forma dependente do tempo (Figura 2A, B; 3A, B; 4A, B). É apoptose induzida por G503 dependente de caspases? Quando as células foram co-tratados com Z-VAD-FMK e G503, Z-VAD-FMK inibe a caspase-9 e -3 de activação (Figura 2C, D), e o número de células apoptóticas induzidas por G503 diminuiu (Figura 2E), indicando, assim, que a apoptose celular induzida SGC7901-G503 é dependente da caspase. Para distinguir se a apoptose induzida por G503 é dependente da caspase-8, -9, ou ambos, SGC7901 células foram pré-tratadas com Z-IETD-FMK e Z-LEHD-FMK e, em seguida, co-tratados com G503. Os resultados indicam que o Z-IETD-FMK não inibem a caspase-9 e -3 de activação (Figura 3C) ou diminuir o número de células apoptóticas induzidas por G503 (Figura 3D); No entanto, Z-LEHD-FMK diminuiu o número de células apoptóticas (Figura 4C). Assim, G503 induzida por apoptose celular SGC7901 não é dependente de caspase-8, mas é em caspase-9.

As mitocôndrias consistem de uma membrana externa, de membrana e o espaço da matriz. proteínas relacionadas com a apoptose, tais como pró-enzimas de caspase, Cyto

C

e FIA ​​existir no espaço de membrana.