Abstract

Fundo e visa

O aumento da evidência sugere que o carcinoma hepatocelular (HCC) pode originar de uma subpopulação distinta chamadas células-tronco cancerosas (CSCs), que são responsáveis ​​pela eficácia limitada de terapias convencionais. Foi anteriormente demonstrado que a granulina-epitelina precursor (GEP), um factor de crescimento pluripotentes, é regulada positivamente em HCC, mas não no tumor não-adjacentes, e que PEG é um alvo terapêutico potencial para o carcinoma hepatocelular. Aqui, nós caracterizada seu padrão de expressão e haste propriedades da célula em fígados fetais e cancerosos.

Métodos

A expressão proteica da GEP em fígados fetais e adultas foi examinada em modelos humanos e do rato por coloração imuno-histoquímica e citometria de fluxo. linhas celulares de cancro do fígado, isolado com base na sua GEP e /ou cassete de ligação dependente de ATP droga expressão transportador ABCB5 (ABC), foram avaliados para propriedades CSC hepáticas em termos de formação de colónias, chemoresistance e tumorigenicidade.

Resultados

Demonstrámos que GEP era uma proteína hepática oncofetal que expresso no fígado fetal, mas não nos fígados normais de adultos. Importante, GEP + células hepáticas fetais co-expressa as moléculas de sinalização relacionados com células-tronco embrionárias (ES), incluindo β-catenina, Oct4, Nanog, Sox2 e DLK1, e também hepáticas CSC-marcadores CD133, EpCAM e ABCB5. Caracterização fenotípica em espécimes clínicos HCC e linhas celulares revelou que as células cancerosas GEP + co-expressa estes marcadores de células estaminais de forma semelhante como a de células de fígado fetal GEP +. Além disso, foi mostrado GEP para regular a expressão das moléculas de sinalização de células ES relacionada β-catenina, Oct4, nanog, e Sox2. Isoladas GEP

células de alta cancerosas se observado aumento na capacidade de formação de colónia e chemoresistance quando comparado com os GEP

homólogos baixos. Co-expressão de GEP e ABCB5 melhor definidas as populações CSC com a capacidade tumorigénica reforçada em ratinhos imunocomprometidos.

Conclusões

Nossos resultados demonstram que a GEP é uma proteína oncofetal hepática regulação moléculas de sinalização relacionados com células ES . Co-expressão de GEP e ABCB5 enriquece ainda uma subpopulação com propriedades CSC melhorados. Os dados atuais fornecem uma nova visão sobre a estratégia terapêutica

Citation:. Cheung PFY, Cheng CKC, Wong NCL, Ho JCY, Yip CW, Lui VCH, et al. (2011) granulin-epitelina Precursor é uma proteína oncofetal Definindo células-tronco cancerosas hepática. PLoS ONE 6 (12): e28246. doi: 10.1371 /journal.pone.0028246

editor: Jovem Nyun Park, Yonsei University College of Medicine, República da Coreia

Recebido: 02 de junho de 2011; Aceito: 04 de novembro de 2011; Publicação: 16 de dezembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Cheung et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte pela Sun CY Fundação de Pesquisa da Hepatobiliar e Cirurgia pâncreas, National Natural Science Foundation da China e do Conselho Bolsas de Investigação Hong Kong (N_HKU 709/07, HKU7 /CRG /09), o Programa de financiamento de sementes e Pequenas Projeto Programa de Financiamento da Universidade de Hong Kong. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o carcinoma hepatocelular (HCC), a terceira principal causa de mortalidade por cancro em todo o mundo, é uma doença altamente maligno com nenhum tratamento eficaz atualmente [1]. Embora os mecanismos moleculares da HCC patogênese permanecem largamente desconhecidos, HCC é considerada uma doença heterogênea devido a seus vários perfis moleculares e resultados clínicos variados [2]. A heterogeneidade dos HCC ea falta de biomarcadores adequados ter impedido o prognóstico e tratamento do paciente.

Durante anos, a heterogeneidade das células tumorais tem sido explicada pelo modelo de evolução clonal [3]. No entanto, evidências recentes sugerem que os tumores são organizadas hierarquicamente com uma subpopulação distinta chamadas células-tronco cancerosas (CSCs) que encontram-se no ápice da hierarquia. Estas células não são apenas responsáveis ​​para a iniciação e progressão tumoral, mas também dotado de propriedades de células-tronco, incluindo a auto-renovação, a capacidade de diferenciação e chemoresistance [4]. Embora, inicialmente, as terapias existentes podem eliminar a população de grandes quantidades de tumor, as propriedades de células estaminais de CSCs lhes permitir sobreviver e repovoar o tumor, resultando em recidiva da doença [5].

O conceito de CCC tem sido documentada em diversos malignidades, incluindo da mama [6], cólon [7] e cancros do fígado [8], [9]. Apesar dos recentes avanços na identificação CSC hepática, a origem exacta dessas células permanece em grande parte desconhecido. Tumorigênese e embriogênese são conhecidos por compartilhar muitas propriedades comuns, incluindo plasticidade celular, motilidade celular dinâmica [10] e da convergência das vias de sinalização, o que sugere uma possível ligação entre células embrionárias e câncer [11]. Curiosamente, o conceito de CSC é notavelmente similar à teoria “resto embrionário”, a qual foi proposta com base nas semelhanças histológicas de tecidos embrionários e cancerosas, sugerindo que os tecidos adultos contêm restos embrionárias que normalmente estão latentes, mas pode ser activado para se tornar cancerosa [12]. Portanto, a identificação de uma molécula-chave que estão na base da comunhão de tronco embrionárias (ES) e células tumorais pode resultar em novas estratégias terapêuticas para suprimir a transformação maligna de células-tronco normais, ou erradicar a CSCs.

granulin-epitelina precursor (GEP, também chamado progranulin, proepithelin, acrogranin, ou factor de crescimento derivado de PC) é um factor de crescimento que regula o desenvolvimento fetal pluripotente [13], a reparação de tecidos [14] e a tumorigénese em vários cancros [15]. Verificou-se para regular eventos de desenvolvimento, incluindo cavitação em embriões de ratos pré-implantação [16] e diferenciação do cérebro-específico masculino do hipotálamo de ratos recém-nascidos [17]. Anteriormente, nós demonstramos superexpressão GEP na maioria dos espécimes de carcinoma hepatocelular humano [18], [19] e o seu papel na regulação da proliferação celular HCC, invasão e tumorigenicidade [19]. Além disso, a neutralização da GEP poderia inibir o crescimento de HCC estabelecida [20]. Apesar do grande interesse em seus dois papéis na embriogênese e tumorigênese, a informação para o seu padrão de expressão e funções biológicas nos fígados ainda é escassa.

Neste estudo, relatamos pela primeira vez que o GEP é uma proteína oncofetal hepática que regula a expressão de moléculas de sinalização relacionados com células estaminais β-catenina, Oct4, nanog e Sox2. Estudos funcionais confirmou que células que expressam GEP possuíam maior capacidade de formação de colónia e chemoresistance. Além disso, as células cancerosas GEP que co-expressam e cassete de ligação de ATP-dependente B5 (ABC) demonstraram capacidade aumentada tumorigénico em ratinhos imunocomprometidos. Nossas descobertas são cruciais não só para a compreensão do desenvolvimento do fígado fetal, mas também para a construção de terapias específicas destinadas GEP e ABCB5 para erradicar as CSCs quimiorresistentes em pacientes com CHC.

Materiais e Métodos

ensaios celulares

linhas celulares de cancro do fígado humano Hep3B e HepG2, foram adquiridos da American Type Culture Collection (Manassas, VA) e cultivados como descrito anteriormente [19], [20]; enquanto Huh7 foi comprado de Ciências da Saúde Research Resources Bank (Osaka, Japão) e mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro fetal de bovino inactivado pelo calor 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os transfectantes estáveis ​​para GEP superexpressão e supressão foram descritos [19]. GEP bloqueio em Hep3B foi realizado por incubação das células com ou sem 50 ug /ml de PEG anti-anticorpo monoclonal A23 (caseiro, anteriormente descrito [20] ou de anticorpo de controlo de isotipo IgG de murganho (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 24 h.

espécimes clínicos

o protocolo do estudo foi aprovado pelo Conselho de Administração da Universidade de Hong Kong /Autoridade Hospital Hong Kong Oeste Cluster (HKU /HA HKW IRB) Institutional Review. Seis pacientes foram submetidos hepatectomia parcial curativo ou transplante de fígado para HCC no queen Mary Hospital, Hong Kong, foram recrutados com o consentimento informado por escrito com o estudo. os pacientes tinham sido diagnosticados com carcinoma hepatocelular primário e confirmado por exames patológicos. a idade dos pacientes variou de 42 a 67 anos, com uma idade média de 60 anos. Havia 4 homens e 2 mulheres, e todos foram hepatite portadores do vírus B. O tamanho dos tumores variou de 3,5 a 19,5 cm, com um tamanho médio de 8,3 cm. Notavelmente, cada espécime tem número limitado de células (pequeno espécime de investigação para garantir que não haja interferência em exame patológico) e, portanto, não é suficiente para o painel completo de análise de expressão do marcador com células-tronco. Os dados de cada marcador de expressão apresentados os valores médios de pelo menos quatro amostras. O espécime normais do fígado foi obtido a partir de doadores de órgãos durante a operação de transplante, eo doador não tinha nenhuma doença hepática subjacente e foi negativo no teste de sorologia de hepatite B. A amostra de fígado fetal foi obtido de recuperação de formol fixa parafina bloco de tecido arquivadas tomadas durante o exame de rotina do abortus após o aborto espontâneo em 10 semanas e 6 dias. Aprovação ética para o uso de tecidos fetais arquivados identificados a partir de uma base de dados informática foi obtido a partir do Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Hong Kong /Hospital Autoridade de Hong Kong Oeste Cluster (HKU /HA HKW IRB).

Mouse espécimes

os fígados de adulto, neonatal e ratinhos ICR fetais foram recolhidas e o protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê sobre o Uso de Animais vivos em Ensino e Pesquisa da Universidade de Hong Kong (Aprovação de Referência No. CULATR 1968 -09). Para o isolamento de hepatócitos de rato, os fígados foram picadas e digerida com colagenase tipo IV (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Após a filtração e a lise de células vermelhas do sangue, as células foram contadas por coloração de imunofluorescência e análise de citometria de fluxo (FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA). As células isoladas a partir de fígados embrionários foram coradas com anticorpo anti-AFP (R D systems, Minneapolis, MN) e o anticorpo anti-albumina (R D systems) para distinguir os hepatócitos para posterior caracterização de células GEP-expressam

a imuno-histoquímica

a imuno-histoquímica foi realizada em secções embebidas em parafina e fixado em formalina com Dako Envision Além disso Sistema (Dako, Carpinteria, CA) seguindo as instruções do fabricante, com modificações tal como descrito [18], [19].

imunofluorescência e análise citométrica de fluxo

Para a expressão da GEP, ABCB5, β-catenina, Oct4, Sox2, Nanog e DLK1, as células foram permeabilizadas com gelada de 0,1% de saponina e, em seguida, incubadas com FITC ratinho anti-humano conjugado PEG (descrito anteriormente [20]), não conjugada de cabra anti-humano ABCB5 (Everest Biotech Ltd, Oxfordshire, Reino Unido), rato Alexa Fluor 647 conjugado anti-humano β-catenina, PerCP-Cy5.5-conjugado de ratinho anti-humano Oct4, Alexa Fluor rato 647-conjugado anti-Sox2, rato conjugado com PE anti-humano Nanog (BD Biosciences), de rato não conjugado anti-DLK-1 (MBL International, Woburn, MA), ou uma quantidade igual de correspondentes Os anticorpos de controlo de isotipo. Para ABCB5 e DLK1, as células foram incubadas com NorthernLights (NL) anticorpo secundário IgG anti-cabra de burro conjugado ou 557-anticorpo secundário de rato anti-IgG de cabra conjugados com NL637, respectivamente, antes da coloração com anticorpo anti-PEG. Para CD133 e a expressão de superfície de EpCAM, as células foram coradas com o mouse de APC-conjugado anti-humano CD133 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha), rato de APC-conjugado EpCAM anti-humano (BD Biosciences) ou a mesma quantidade de anticorpos de controlo de isotipo correspondente, antes da permeabilização e coloração com anticorpo anti-GEP.

triagem celular

Isolamento de GEP- e /ou células que expressam ABCB5 foi realizada por triagem de células activadas magnética (Miltenyi Biotec), de acordo com o fabricante do instruções. Resumidamente, as células foram marcadas com GEP rato conjugado com FITC anti-humano (anteriormente descrito [20]) ou coelho ABCB5 anti-humano conjugado com biotina (Rockland, Gilbertsville, PA), anticorpo, e depois incubadas com anti-FITC ou anti-biotina microesferas magnéticas (Miltenyi Biotec), seguido de separação magnética. Note-se que as células foram classificadas com base na expressão de superfície de PEG e ABCB5, mas não na sua expressão intracelular, porque permeabilização não era viável para manter as células viáveis ​​para ensaios funcionais subsequentes. Após isolamento de células, 2.000.000 de cada população classificados foram recolhidos para avaliar a viabilidade celular por coloração com azul de tripano e a pureza por citometria de fluxo usando o rato GEP anti-humano (R D systems) ou de cabra ABCB5 anticorpo humano anti-(Everest Biotech) reconhecendo epítopos diferentes dos anticorpos usados ​​para separação de células. As células foram então coradas com coelho conjugado com PE anti-rato ou um anticorpo secundário IgG de burro NL557-conjugado anti-cabra de GEP ou ABCB5, respectivamente. Para a avaliação da pureza de células por citometria de fluxo, as células foram permeabilizadas ordenados antes da coloração para que a expressão total de GEP e ABCB5 das populações classificadas poderia ser determinado. Pós-triagem análise tipicamente indicado purezas de 80% de morte celular mínima ( 10%).

acumulação de doxorrubicina e apoptose

As células foram incubadas com ou sem 0,5 mg /ml de doxorrubicina durante 24 h. acumulação de doxorrubicina intracelular foi analisada por citometria de fluxo no espectro de FL2; enquanto a apoptose das células foi determinada por anexina V-FITC (FL1) e iodeto de propídio (PI) (FL2) coloração e análise citométrica de fluxo.

Colónia ensaio de formação de

células isoladas de fresco foram cultivadas a uma densidade de 1000 células /poço e deixadas a crescer durante 10 dias. A formação de colónias foi avaliada por um ensaio colorimétrico de violeta cristal (Sigma Aldrich).

In vivo

tumorigenicidade experimentos

BALB /c atímicos camundongos nus de 5 semanas de idade foram utilizados para testar a

in vivo

potencial tumorigénico das células. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê sobre o Uso de Animais Vivos em Ensino e Pesquisa da Universidade de Hong Kong. Vários números de células foram inoculadas por via subcutânea na região dorsal do tronco de cada animal. Os ratinhos foram sacrificados entre pós-injecção, no qual os tumores foram colhidos para exame posterior 8 e 16 semanas. Esses camundongos injetados com células de carcinoma hepatocelular, mas sem nenhum sinal de carga tumoral eram geralmente terminada 5 meses após a injeção de células.

análises estatísticas

Todos os dados foram expressos como valores médios ± desvio padrão (SD) a partir de pelo menos, três experiências independentes. As diferenças entre grupos foram avaliadas pelo teste t de Student. Uma probabilidade (p) 0,05 foi considerado significativamente diferente. Todas as análises foram realizadas utilizando o software estatístico GraphPad Prism para Windows, versão 3.00 (GraphPad Software, CA, EUA).

Resultados

GEP é uma proteína oncofetal hepática

Anteriormente , ARNm GEP foi relatado no fígado de rato embrionário [13], mas se GEP traduz em proteína e o seu tempo de activação /-off fígado durante o desenvolvimento permanece desconhecida. Desde fígado fetal tem abundância de células-tronco hematopoiéticas, além de hepatócitos fetais, precisamos identificar o tipo (s) célula que expressa GEP. Aqui, nós descrevemos pela primeira vez, o padrão de expressão da proteína GEP em fígados humanos e de ratinho. Por coloração imuno-histoquímica, proteína GEP foi detectado em mouse e fígados fetais humanos, enquanto fígados adultos eram desprovidas de GEP-expressando hepatócitos (Figura 1A).

(A) Análise imuno-histoquímica mostrando proteína GEP em fígados fetais de rato ( dia embrionário 17,5) e humana (10 semanas e 6 dias), mas não no fígado adulto (ampliação x 400). (B) as análises de citometria de fluxo mostrando a expressão de marcadores de células estaminais GEP e hepática em hepatócitos de rato embrionários. A co-expressão de GEP e marcadores de células estaminais hepáticas CD133, EpCAM, DLK1 e β-catenina foram realizadas por quádruplo cor-de citometria de fluxo, gating na AFP + e /ou albumina + hepatócitos de fígado embrionário. As células que co-expressam os respectivos marcadores foram mostradas no quadrante superior direito de gráficos de pontos. Os dados são expressos como percentagem média de células + SD.

No modelo de rato, de modo a distinguir expressão GEP especificamente nos hepatócitos, a análise do nível de PEG foi realizada por tripla cor-de citometria de fluxo, gating em AFP + e /ou albumina + para hepatócitos em todas as fases de desenvolvimento. Inclusão da AFP + e /ou albumina + células em todas as fases de desenvolvimento iria reflectir melhor a população de hepatócitos no fígado, porque a proporção de células AFP + e albumina + células eram diferentes em fígados embrionárias, neonatais e adultos (Figura S1). expressão GEP aumentou gradualmente a partir E11.5 embrionária dia (14,8% + 6,9%) para E17.5 (30,8 + 9,2%). Imediatamente após o nascimento, o nível de PEG diminuiu abruptamente de um dia (4,4 + 1,5%) para day7 (1,2 + 0,4%), e tornou-se quase indetectável nos fígados de ratinho adulto (0,9 + 0,4%) (Figura S1). Juntamente com as nossas descobertas anteriores de que GEP expressos na maioria dos espécimes HCC, mas não nos tecidos do fígado não-tumor adjacentes [18], [19], confirmou-se que GEP era uma proteína oncofetal hepática.

Para caracterizar a assinatura de células estaminais de GEP + hepatócitos fetais, examinámos a co-expressão de PEG e várias células estaminais hepática ou caule marcadores relacionados com células, incluindo CD133, EpCAM, DLK1 e β-catenina [21], [22], [23] , [24] no fígado embrionário (Figura 1B). Hepatoblasts teria mudanças de série ao longo estágios de desenvolvimento e dão origem a hepatócitos e cholangiocytes. No dia embrionário 11,5 (E11.5), expressão de CD133, EpCAM, DLK1 e β-catenina foi elevada em hepatoblasts e a maioria das células positivas GEP-co-expresso de todos estes marcadores de células estaminais hepáticas. No E13.5, expressões de CD133 e EpCAM começou a declinar e na maioria das células CD133 + ou EpCAM + foram observados para co-express GEP. Para DLK1 e β-catenina, seus níveis de expressão manteve-se elevada a E13.5 e a maioria das células GEP-expressam também foram positivos para ambos os marcadores. Ao E17.5, as expressões de CD133, EpCAM, DLK1 e β-catenina diminuiu para níveis baixos, enquanto que a expressão atingiu o pico GEP nesta fase. A discrepância de tendências de expressão entre PEG e estes marcadores de células estaminais pode ser atribuído às propriedades do factor de crescimento de PEG. Embora investigação adicional é necessário para elucidar o mecanismo subjacente ao padrão de GEP, a co-expressão de GEP com estas células estaminais hepática ou haste marcadores relacionados com células sugere um fenótipo de células estaminais de células que expressam GEP-expressão.

a expressão GEP nos hepatócitos de rato foi investigada por nossa home-made anti-GEP A23 anticorpo. A especificidade de A23 foi analisada por Western blot (Figura S2 e o resultado mostrou que poderia reconhecer o GEP rato como única banda a partir do extracto de proteína de fígado embrionário do rato. Além disso, o padrão de expressão GEP como mostrado no western blot foi consistente com o fluxo de citometria de dados em que o nível de proteína GEP aumentou de E11.5 e E13.5 a E17.5, fornecendo dados consistentes para refletir a expressão GEP nos fígados embrionárias.

caracterização fenotípica de células GEP-expressam em HCC

Para caracterizar melhor se as células GEP-expressam tinha as propriedades das células estaminais em CHC, examinámos a co-expressão de PEG e um painel de marcadores de células estaminais utilizando citometria de fluxo em linhas celulares de carcinoma hepatocelular humano Hep3B e Huh7. marcadores examinadas incluem marcadores de superfície de células precursoras hematopoéticas CD31, CD34, CD117, precursor hepática superfície celular marcador CD123, caule marcadores da superfície celular moléculas de sinalização relacionados com células CD24, CD29, marcadores de superfície CSC hepática CD44, CD90, CD133, EpCAM, ES β-catenina, Oct4, Sox2 e Nanog, ABC transportadores de drogas ABCC1 e ABCB5. Note-se que os transportadores de ABC de drogas também foram incluídos porque ambas as células estaminais normais e cancerosas expressa um nível mais elevado de transportadores de fármacos ABC, contribuindo para uma maior resistência aos agentes quimioterapêuticos do que as células diferenciadas [4], [21]. Entre os marcadores sendo investigado, as células GEP + foram mostrados para preferencialmente co-expresso com β-catenina, Oct4, Nanog, Sox2, CD133 e EpCAM quando comparado com células GEP- em ambos HCC linhas celulares Hep3B (Figura S3) e Huh7 (Figura S4 ). Nossos resultados, portanto, sugeriu uma característica de células-tronco de células GEP-expressando nas células do fígado, tanto embrionárias e cancerosos.

GEP regula a expressão de marcadores de células-tronco

Nós modulada os níveis de expressão GEP em células Hep3B por via transfecção e investigou se os níveis de proteína dos marcadores de células estaminais seria alterado. Os resultados mostraram que a sobre-regulação de nível GEP reforçada, enquanto a supressão de nível PEG diminuiu a expressão de β-catenina, Oct4, Nanog, Sox2 e ABCB5 (Tabela 1). A modulação dos níveis de PEG não alterou a expressão de tronco hepática marcadores de superfície celular CD133 e EpCAM. A razão pode ser devido ao facto de que a maioria das células Hep3B foram positivos para CD133 e EpCAM (maior do que 95%), assim, a mudança de uma molécula (por exemplo, PEG) pode não ser capaz de deslocar a população. Enquanto PEG foi relatada anteriormente pelo nosso grupo para regular ABCB5 para mediar quimiorresistência em células de carcinoma hepatocelular [25], a correlação positiva entre PEG e β-catenina, Oct4, Sox2 e Nanog sugeriu que GEP pode regular a expressão destes relacionados de células ES moléculas de sinalização para manter a pluripotência das células estaminais.

para validar ainda mais o papel regulador da GEP na expressão dessas moléculas de sinalização, GEP bloqueamento com anti-anticorpo monoclonal A23 GEP foi realizada em células Hep3B ( Mesa 2). A23 foi encontrada para reduzir significativamente os níveis de GEP endógenos em células Hep3B. GEP bloqueio também suprimiu significativamente a expressão de β-catenina, Oct4, Nanog e Sox2, confirmando assim o papel regulador da GEP na expressão dessas moléculas de sinalização relacionados com células-tronco.

células que expressam GEP possuem propriedades CSC

in vitro

Para melhor caracterizar as propriedades de células-tronco de células GEP-expressando, GEP

alto e GEP

baixos subpopulações foram isolados a partir de linhas celulares de cancro de fígado humano Hep3B, Huh7 e HepG2, e examinadas quanto à sua expressão de marcadores de células estaminais utilizando citometria de fluxo. As células foram classificadas com base na expressão de superfície de PEG, mas não sobre a sua expressão intracelular, porque permeabilização não era viável para manter as células viáveis ​​para ensaios funcionais subsequentes. Após isolamento de células, 2.000.000 de cada população classificados foi recolhido para avaliar a viabilidade celular por coloração com azul de tripano e a pureza por citometria de fluxo utilizando um anticorpo anti-GEP diferentes que reconhecem epitopos distintos dos anticorpos usados ​​para separação de células. A pureza dos GEP

altos e GEP

subpopulações baixas eram cerca de 80% a 90%, respectivamente, como revelado pela análise pós-triagem (Figura 2A). GEP

células de alta foram encontrados para expressar níveis mais altos de células ES relacionados com moléculas de sinalização beta-catenina, Oct4, Nanog, Sox2 e ABC transporter droga ABCB5 do GEP

baixos homólogos dos três linhas de células de carcinoma hepatocelular (Figura 2B) . Para hepática CSC CD133 marcador de superfície, a expressão de superfície maior em GEP

células de alta do que GEP

baixo homólogo foi encontrado em HepG2 e Huh7, mas não Hep3B, que foi provavelmente devido ao nível extremamente elevado de CD133 ( 95 %) expressa constitutivamente nas células Hep3B (dados não mostrados). Para EpCAM, foi observada maior expressão de superfície em GEP

alta do que GEP

baixas populações em Huh7, mas não Hep3B e HepG2, em que a maioria das células; foram encontrados para expressar o EpCAM ( 0,05, **

P Art 0,01, ***

P Art 0,001, quando comparado com GEP

células de baixa. (C) Colony eficiências de formação de GEP

altos subpopulações foram maiores do que os seus respectivos

células Hep3B e HepG2 baixas e não ordenados GEP. (D, E) Após a exposição à doxorrubicina (0,5 ug /ml para 24 h), GEP

subpopulações elevados retida significativamente menos doxorrubicina e menos do que a apoptose de células GEP

células de baixa e não ordenados Hep3B e HepG2. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P

. 0,001 quando comparados com os controles não triados

para determinar se as células que expressam GEP foram enriquecidos para CSCs, comparou o potencial tumorigénico e haste propriedades da célula de GEP

células de alta com os seus homólogos

in vitro em células

Hep3B e HepG2, que representam linhas celulares elevadas e baixas que expressam GEP, respectivamente. Clonogenicidade das células foi avaliada por ensaio de formação de colónias. GEP

células de alta Hep3B foram capazes de formar significativamente mais colônias em comparação com o GEP

células de baixa eo controle indiferenciados. observação semelhante foi mostrado com uma célula de cancro do fígado independente HepG2 (Figura 2C).

Para examinar o papel da GEP em quimiorresistência, as células foram incubadas com doxorrubicina e avaliadas para a acumulação de drogas intracelulares e apoptose celular. GEP

altos subpopulações, em ambas as células Hep3B e HepG2, demonstrou significativamente menor absorção de doxorrubicina (Figura 2D) e apoptose celular (Figura 2E), quando comparado com o controle não separados; enquanto GEP

baixos subpopulações mostrou aumento da captação de doxorrubicina e apoptose celular, quando comparado com as populações não triados.

GEP

highABCB5 + células demonstrar maior capacidade de formação de colónia e chemoresistance

De acordo com a hipótese de CSC, CSCs representam apenas uma população rara de tumor [4]. Isto implica que GEP

alta subpopulação ainda é heterogêneo e, possivelmente, consiste em subconjuntos com potenciais tumorigênicos diferenciais. Por isso, procurou-se dissecar ainda mais o GEP

alta população por meio do marcador co-expressando adicional.

Em células Hep3B, a maioria das células ABCB5 + expressa GEP, mas apenas um subconjunto de células GEP + foram ABCB5 + (Figura 3A, painel esquerdo). Além disso, temos mostrado recentemente que ABCB5 regulamentados marcadores de células-tronco do câncer hepático CD133 e EpCAM [21]. Nós, portanto, a hipótese de que GEP em combinação com ABCB5 pode definir com mais precisão a população CSC hepática.

(A) GEP e expressão ABCB5 em células Hep3B indiferenciados, ea GEP recém isolado

highABCB5 +, GEP

highABCB5- e GEP

lowABCB5- subpopulações. As células foram classificadas com base na expressão de superfície de PEG e ABCB5. Após isolamento de células, 2.000.000 de cada subpopulação classificados foi recolhido para avaliar a pureza por citometria de fluxo utilizando diferentes anti-GEP e anticorpos anti-ABCB5 que reconhecem epitopos distintos daqueles dos anticorpos usados ​​para separação de células. Note-se que a maioria das células eram também ABCB5 + PEG +, assim, não houve GEP

lowABCB5 + células (painel da esquerda). A percentagem média de células ± desvio padrão é mostrada em cada quadrante. (B) Colony eficiências de formação de GEP

highABCB5 + subpopulação foram superiores GEP

highABCB5-, GEP

lowABCB5- e células não triados. (C, D) Após a exposição à doxorrubicina (0,5 ug /ml para 24 h), as células GEP

highABCB5 + retida significativamente menos doxorrubicina e menos apoptose celular do que as outras subpopulações. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01 quando comparado com controles não triados; #

P Art 0,05, # #

P Art 0,01, # # #

P

. 0,001 entre os grupos indicados por linhas horizontais

Nós isolado GEP

highABCB5 +, GEP

highABCB5- e GEP

lowABCB5- células de Hep3B. As células foram classificadas com base na expressão de superfície de PEG e ABCB5, mas não na sua expressão intracelular, porque permeabilização não era viável para manter as células viáveis ​​para ensaios funcionais subsequentes. Após isolamento de células, as subpopulações ordenadas foram avaliadas quanto a viabilidade celular por coloração com azul de tripano e a pureza por citometria de fluxo utilizando diferentes anticorpos anti-ABCB5 que reconheceram epitopos distintos daqueles anticorpos usados ​​para separação de células anti-GEP ou. Pelo menos 80% de pureza foi obtida em cada subpopulação (Figura 3A) e seus potenciais tumorigênicos foram examinados tanto

in vitro

e

in vivo

.

GEP

highABCB5 + células demonstraram indução de o maior número de colónias, enquanto o GEP

highABCB5- células mostraram capacidade intermediária para formar colônias, mas ainda significativamente mais elevados do que o controle indiferenciados. Importante, GEP

lowABCB5- subpopulação era quase incapaz de formar colónias (Figura 3B).

Após a exposição a doxorubicina, GEP

+ highABCB5 células demonstraram significativamente menor nível de absorção de doxorrubicina e a apoptose de células, quando comparado com GEP

highABCB5- células e controle indiferenciados. Pelo contrário, GEP

lowABCB5- células foram altamente sensíveis à doxorrubicina em termos de acumulação de drogas e apoptose celular (Figura 3C e D)

GEP

highABCB5 + células são mais tumorigênico

in vivo

experimentos desenvolvimento do tumor usando GEP

highABCB5 + e GEP

lowABCB5- subpopulações isoladas a partir de células Hep3B foram realizados em ratos pelados imunocomprometidos. Todos os ratos injectados com GEP

highABCB5 + células tumores desenvolvidos. Os ratinhos injectados com 1 x 10

6 células duplamente positivas formaram tumores no prazo de 2 a 4 semanas após a inoculação. Pelo contrário, apenas 2/10 ratinhos injectados com PEG

células geradas lowABCB5- tumores relativamente pequenos e necessário mais tempo de latência (12 semanas) (Figura 4A e B).

(A) ratinhos nus injectados subcutaneamente com GEP

highABCB5 + e GEP

lowABCB5- células após 8 semanas. O painel da direita mostra os tumores subcutâneos derivados de 2,5 × 10

5 GEP

highABCB5 + e 1 × 10

6 GEP

lowABCB5- células na semana 16. (B) tumorigenicidade de GEP

highABCB5 + e GEP

lowABCB5- células.