Abstract
metilação do DNA aberrante foi observada no cancro do colo do útero; no entanto, a maioria dos estudos usaram abordagens não-quantitativos para medir a metilação do DNA. O objetivo deste estudo foi quantificar a metilação dentro de um painel seleto de genes previamente identificados como alvos para silenciamento epigenético no cancro do colo do útero e para identificar genes com metilação elevada que pode distinguir o cancro do colo do útero a partir de tecidos normais. Foram identificadas 49 mulheres com cancro de células escamosas invasivo do colo do útero e 22 mulheres com amostras de citologia normal. DNA genômico bissulfito-modificado foi amplificado e pyrosequencing quantitativa completado por 10 genes (
APC
,
CCNA
,
CDH1
,
CDH13
,
WIF1
,
TIMP3
,
DAPK1
,
RARB
,
FHIT
, e
Slit2
). Um Índice de metilação foi calculada como a percentagem de metilação significativo em todos os locais CpG analisadas por gene (~ 4-9 sítio CpG) por sequência. Um corte de ponto binário foi definido em 15% de metilação. foi examinado sensibilidade, especificidade e área sob a curva ROC (AUC) de metilação em genes individuais ou um painel. O índice de metilação mediano foi significativamente maior nos casos em comparação com os controlos em 8 genes, ao passo que não houve diferença na metilação mediana para 2 genes. Em comparação com HPV e idade, a combinação de nível de metilação do DNA de
DAPK1
,
Slit2
,
WIF1
e
RARB
com HPV e idade significativamente melhorada a AUC 0,79-0,99 (IC 95%: 0,97-1,00,
p-valor
= 0,003). análise pyrosequencing confirmou que vários genes são alvos comuns de metilação aberrante no cancro e DNA nível de metilação do colo do útero de quatro genes parece aumentar a especificidade para identificar o câncer em comparação com a detecção do HPV sozinho. Alterações na metilação do DNA de genes específicos em cancros cervicais, como
DAPK1
,
RARB
,
WIF1
, e
Slit2
, também pode ocorrer no início na carcinogênese cervical e deve ser avaliado
Citation:. Siegel eM, Riggs BM, Delmas AL, Koch a, Hakam a, Brown KD (2015) DNA quantitativa metilação Análise de genes candidatos no cancro do colo do útero. PLoS ONE 10 (3): e0122495. doi: 10.1371 /journal.pone.0122495
Editor do Academic: Osman El-Maarri, da Universidade de Bonn, Institut de Hematologia Experimental e medicina de transfusão, Alemanha |
Recebido: 26 de junho de 2014; Aceito: 22 de fevereiro de 2015; Publicação: 31 de março de 2015
Direitos de autor: © 2015 Siegel et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability: os dados subjacentes os resultados deste estudo estarão disponíveis mediante solicitação e não disponibilizada gratuitamente em um repositório público. Os dados não podem ser disponibilizadas ao público devido a restrições de nossa aprovação IRB, incluindo o pequeno tamanho da amostra que pode reduzir o anonimato ea inclusão de PHI paciente dentro do conjunto de dados na avaliação dos resultados dos pacientes. O conjunto de dados e matérias-pirogramas finais estão disponíveis mediante solicitação para o seguinte: Moffitt Cancer Center Informação Shared Services Department ([email protected]) ou o seguinte estudo de investigadores principais: Erin M. Siegel (assistente do departamento de Membro do Cancer Epidemiology Moffitt Cancer Center 12902 Magnolia drive, Tampa, FL 33612) e-mail: [email protected], Kevin D. Brown (Professor Associado do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade da Flórida College of Medicine Gainesville, FL 32610) e-mail: [email protected] ( 352) 273-5458
Financiamento:. O suporte para este estudo foi fornecido por uma Universidade da Flórida-Moffitt Collaborative Grant (UF09060) e concessão do National Cancer Institute 1RO3 CA143980-01 a EMS e KDB. Este trabalho foi apoiado em parte pela facilidade Tissue Core e da Facilidade Collaborative Data Services núcleo no H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, um NCI designada Comprehensive Cancer Center, nos termos do número de concessão P30-CA76292. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
silenciamento do gene epigenética via metilação do DNA denso dentro de ilhas de CpG tem sido demonstrado que ocorrem em muitos tipos de tumor, incluindo o vírus do papiloma humano (HPV) -associated cancro cervical [1]. genes supressores de tumor (ETG) que são de evidente importância na patogênese do câncer cervical são alvos comuns para silenciamento de genes nesta doença [2,3]. A identificação de um painel de ETG metilados de forma aberrante que representam um vasto espectro de funções supressoras de tumor (
i
.
E
., Sinalização celular, a transcrição do gene, do ciclo celular, apoptose, e a adesão de células ) tem grande promessa de fornecer um poderoso conjunto de biomarcadores de metilação do DNA para uso em diagnóstico da doença e /ou prognóstico [4].
os genes que codificam vários reguladores chave da via /β-catenina oncogênico Wnt, como
CDH1
(caderina-e),
APC
, e
WIF1
, são frequentemente silenciados via metilação densa de suas regiões promotoras do câncer cervical [5]. Por exemplo,
CDH1
hipermetilação do gene tem sido observada na maioria dos tumores cervicais primários e um número substancial de alto grau de neoplasia intra-epitelial cervical-3 (CIN3), sugerindo que o estado epigenético deste gene tem um potencial aplicação como um biomarcador de malignidade cervical [6]. Outros genes supostamente hypermethylated no cancro do colo do útero com pouca ou nenhuma metilação em CINs normais ou de baixo grau incluem
DAPK1
[7,8],
RARB
[8,9],
TIMP3
[10], CCNA [11] e
FHIT
[7]. No entanto, tem havido inconsistências na prevalência de hipermetilação do ADN de vários cancros cervicais TSG dentro [2,12], o que pode ser devido ao uso de métodos não-quantitativo para detectar a metilação.
Até à data, a maioria dos estudos que examinam os eventos de silenciamento epigenéticas em câncer cervical têm contado com abordagens semi-quantitativos ou qualitativos para marcar metilação do gene [2], como a metilação PCR específico (MSP) ou MSP semi-quantitativa (QMSP) [13]. No entanto, estes ensaios foram relatados a sobrestimar a prevalência de metilação aberrante de alguns loci marcador, especialmente em populações heterogéneas de DNA [4]. Na última década, pyrosequencing bissulfito emergiu como um método quantitativo para medir a metilação do DNA em sítios individuais de CpG dentro de uma população de moléculas de ADN [14,15]. Pyrosequencing pode ser usado com uma variedade de espécimes biológicos (
i
.
e
. (FFPE), congelados, arranhões de tecido embebidos em parafina fixadas em formalina,
etc
. ), o que torna esta abordagem passíveis para usar em ambiente clínico [4]. Até à data, tem havido muito poucos exames de metilação do DNA em câncer cervical usando este, ensaio quantitativo de alta precisão [16].
Para este estudo, foram selecionados um conjunto de 10 ETG (
APC
,
CCNA
,
CDH1
,
CDH13
,
DAPK1
,
FHIT
,
RARB
,
Slit2
,
TIMP3
,
e WIF1
) que, com base em uma pesquisa da literatura, já havia sido demonstrado ser alvos para metilação do DNA aberrante no cancro do colo do útero, mas não exaustivamente testados usando métodos quantitativos. Além disso, os produtos do gene funcionar através de diversas vias biológicas, cada uma das quais foi mostrado para impactar carcinogénese cervical associado ao HPV [2]. Estes genes foram submetidos a pirossequenciao análise em amostras de carcinoma de células escamosas (SCC) do colo do útero e as células cervicais normais. O objetivo deste estudo foi identificar os eventos de metilação do gene útil no câncer de distinção a partir de células cervicais normais que poderia, eventualmente, ser adicionado a testes de diagnóstico padrão para o câncer cervical.
Materiais e Métodos
seleção dos pacientes e dados
Usando um desenho de caso-controle, foram identificadas 49 mulheres com cancro da SCC invasivo que frequência foram pareados por idade e etnia para as mulheres com amostras de citologia normais (controles). Os casos foram incluídos se tivessem (1) um procedimento cirúrgico entre 1991 e 2006 no Moffitt Cancer Center, (2) arquivados blocos tumorais FFPE, e (3) sem tratamento de radiação antes da cirurgia. Para controles, foram coletadas células cervicais normais de mulheres com citologia normal e uma alta probabilidade de ser HPV positivo. Em breve, a citologia em base líquida espécimes (LBC) (N = 22) foram coletadas de mulheres que consentiram em participar de nosso estudo durante uma visita à clínica em cada um de alto risco clínica de doença sexualmente transmissível do Departamento de Saúde Hillsborough County ou uma clínica de colposcopia em Tampa general Hospital, Tampa, Fl. Também examinamos um conjunto de parafina fixado em formalina cervical normal incorporado (FFPE) quarteirões mulheres arquivados de mulheres que foram diagnosticadas com qualquer leiomioma benigno do tecido mole uterino (N = 15) para examinar os níveis de metilação em todo por métodos de preservação de tecidos (LBC vs. FFPE). Todos os tecidos foram patologicamente ou citologia revistos e, se for caso disso, o estágio do tumor, grau e diagnóstico histológico confirmado. dados clínico-patológicos e os resultados foram obtidos a partir do Registro de Câncer Moffitt.
Ética Declaração
Todas as atividades de estudo e procedimentos de consentimento foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade do Sul da Flórida (IRB # 102998) . FFPE blocos de tecido de casos e controles foram coletados como parte do atendimento clínico. A renúncia de consentimento informado foi aprovado para o uso de tecidos arquivados de-identificados a partir de mulheres que não forneceu consentimento informado pela University of South Florida IRB. Não foi possível obter o consentimento para utilizar as amostras residuais identificados para este estudo, que foram todos pelo menos 5 anos de idade, quando obtido. Mulheres forneceram consentimento informado por escrito em um IRB aprovado formulário de consentimento para a recolha de amostras de citologia em meio líquido (N = 22).
O isolamento de ADN e extração
tecidos FFPE foram macrodissected a partir de três a 10 mM secções espessas e extraiu-se o ADN utilizando o Kit Qiagen QIAamp DNA de tecidos FFPE (Valencia, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. Para amostras LBC, uma alíquota de 1-4 ml de PreservCyt foi centrifugada e o ADN extraído das células peletizadas usando o Qiagen QIAmp DNA Mini Kit (Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante. concentração de ADN foi determinada usando um NanoDrop1000 espectrofotômetro (Wilmington, DE).
Detecção de DNA do HPV e Typing
A AMP extra INNO-LiPA HPV Genotyping (Innogenetics, Bélgica) foi realizada para amplificar um 65 -bp fragmento usando o FPS
10 iniciador de PCR definida de acordo com as instruções do fabricante. SFP
10 amplímeros de amostras HPV-positivos foram posteriormente analisados por hibridização reversa sobre o HPV ensaio de hibridização linha de sonda inversa (LiPA). ensaio de LiPA detecta 13 cancerígena (HPV-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59 e -68), 3 provavelmente cancerígena (HPV-53, -66 e -70) e 9 tipos de HPV não-cancerígenas (HPV-6, -11, -34, -40, -42, -43, -44, -54 e -74) [17]. Os controlos positivos e negativos incluído DNA a partir de linhas de células HeLa, de água e a amostra de controlo positivo incluídas no kit.
pirossequenciao
conversão de sódio bissulfito de ADN genómico (10 ug) foi feita utilizando a metilação do DNA EZ kit -Direct (Zymo Research, Orange, CA) de acordo com as recomendações do fabricante. Análise de metilação do DNA quantitativa foi realizada por pyrosequencing como previamente descrito [18]. Os segmentos dos genes foram amplificados a partir de ADN convertido pelo bissulfito por PCR utilizando os iniciadores indicados na Tabela S1. Para o isolamento do fragmento amplificado de cadeia simples, o iniciador inverso utilizado em todas as reacções de PCR foram sintetizados com uma porção de biotina na extremidade 5 ‘. Em resumo, a PCR foi realizada num volume de reacção de 30 ul, o qual continha 1 ul do modelo modificado com bissulfito de ADN, PyroMark PCR master mix (Qiagen, Valencia, CA), concentrado de carga coral, MgCl 25 mM
2 ( para Slit2), 10 uM de cada um específico para a frente para o gene e o iniciador inverso. A termociclagem foi realizada utilizando as seguintes condições gerais: 95 ° C durante 15 min, seguido de 50 ciclos a 95 ° C durante 30 s, 47-55 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 1 min e extensão final a 72 ° C durante 10 min. A seguir à amplificação, 5-20μl de produto da PCR foi misturado com contas de estreptavidina-Sepharose conjugada (GE Healthcare) em tampão de ligação (Qiagen, Germantown, MD) e diluiu-se para 60-80μl de volume total com dH
2O. As esferas foram subsequentemente recolhidas usando uma estação de trabalho preparação vácuo, iniciador de sequenciação (Tabela S1) adicionado, e aqueceu-se a 80 ° C durante 2 min. A sequenciação do iniciador hibridado com a cadeia de ADN biotinilado como a mistura de reacção arrefecida até à temperatura ambiente. As amostras foram pyrosequenced usando um sistema PyroMark MD e metilação de CpG medida utilizando software de PyroMark CpG. Todos pyrosequencing foi conduzido em média em duas reacções de PCR independentes. Os controlos incluíram análise pyrosequencing de ADN genómico humano universal metilado (CpGenome ADN, Millipore, Billerica, MA), de ADN genómico humano não metilado (ADN de esperma humano), e nenhum ADN molde adicionado à reacção pyrosequencing.
A análise estatística
As diferenças entre casos e controles características foram testadas usando Chi de Pearson
2, T-test ‘Exact ou Students’ Fishers. Um Índice de metilação (IM) foi calculada como a percentagem de metilação significativo em todos os locais CpG analisadas por sequência do gene (~ 4-9 sítio CpG). Lanceiros coeficiente de correlação com Bonferoni corrigido
p-valor
foi usado para determinar se MI foram correlacionados entre genes. Diferenças no MI entre casos e controles, globais e estratificada por idade ( 44. Anos vs. ≥ 44 anos) e status de HPV (positivo versus negativo), foram determinados utilizando o teste de Mann-Whitney. foi examinado sensibilidade, especificidade e precisão [área sob a curva (AUC)] do MI para diferenciar casos e controles. Nós avaliamos o valor incremental adicional de nível de metilação do DNA de modelos de previsão que incluíam fatores de risco conhecidos para o câncer cervical, idade (contínua) e positividade HPV (qualquer tipo vs. nenhum) utilizando o método pelo Janes
et al
. [19]. Em primeiro lugar, modelos de regressão logística foram ajustados com e sem as variáveis de metilação; os valores previstos associados para todos os assuntos dentro do conjunto de dados são calculados a partir de cada modelo e plotados. Nós testamos a igualdade das duas curvas ROC usando o STATA roccomp comando (Stata v12.0) [20]. Binários pontos de corte para classificar um gene como metilado foram definidos usando um
a priori
corte de ponto-de MI 15%. Os critérios de inclusão no painel de gene de metilação do DNA foram: (1) diferenças significativas MI entre casos e controles; (2) MI não foi significativamente correlacionados em genes (Rho 0,65); se Rho≥0.65, apenas um gene foi incluído; e (3) AUC 0,60 para MI . 15% para diferenciar casos de controles
Entre os casos, foi avaliada a associação entre metilação (genes ou o painel de genes) e (DFS) livre de doença e sobrevida global ( OS). DFS foi definido como o tempo desde o diagnóstico até a primeira recorrência, segundo tumor ou morte devido a cancro do colo do útero e OS como o tempo desde o diagnóstico até o momento da morte. estimativas de sobrevivência de Kaplan-Meier e modelos de regressão de Cox multivariados examinou associação com DFS e OS, o controle de fatores prognósticos conhecidos (por exemplo, localmente estágio avançado (≥Stage IIB2), categoria, idade, tratamento e HPV). A p-valor de 0,05 (frente e verso) foi considerado significativo. Todas as análises foram realizadas utilizando Stata /MP Versão 12.1 (StataCorp LP, College Station, TX, EUA).
Resultados
Características dos casos (n = 49) e controles (N = 22) são apresentados na Tabela 1. A média de idade dos casos era ligeiramente mais elevado do que os controlos (47 ± 15 anos
vs 43 ± 16 anos, respectivamente.); no entanto, esta não foi uma diferença significativa (
p-valor
= 0,32). DNA do HPV foi detectado em 96% (47/49) dos casos e 55% (11/22) dos controles (
Valor de p Art 0,0001). Entre os casos, 88% dos tumores eram de HPV-16 ou -18 positiva em comparação com 14% dos controlos. Cinqüenta e um por cento dos casos teve um diagnóstico fase inicial (fase IA1 /1B1), enquanto 41% tinham doença localmente avançada (fase 1B2 ou superior).
Quantitative DNA análise de metilação
metilação do DNA dentro do
APC
,
CCNA
,
CDH1
,
CDH13
,
DAPK1
,
FHIT
,
RARB
,
Slit2
,
TIMP3
,
e WIF1
genes, cada um dos quais foi previamente mostrado ser um alvo para aberrante metilação de ADN em cancro cervical [2], foi quantificada por pirossequenciao. Esta metodologia quantifica, numa região genómica alvo de 30-50bp, a metilação de CpG em locais cento individuais dentro de uma população de moléculas de ADN. metilação da citosina denso dentro de ilhas de CpG, e mais especificamente na vizinhança imediata do local de início da transcrição (TSS), está associado com o conjunto impedido da maquinaria transcricional do promotor basal dentro do núcleo, resultando na iniciação da transcrição e bloqueado silenciamento de genes [21]. Assim, ensaios pyrosequencing desenvolvidos pelo nosso grupo foram projetados para medir metilação da citosina em, ou perto, a TSS (Fig 1). Constrangimentos tais como a sequência de nucleótidos da região a ser analisada e os aspectos técnicos do ensaio (
i
.
E
., Os iniciadores de amplificação /sequenciação não deve conter dinucleótidos CpG, eficazes e específicos de PCR amplificação,
etc
.) em última instância, influenciou a região analisada para cada gene em nosso painel. Todos os ensaios pyrosequencing utilizadas neste estudo foram desenvolvidas pelo nosso grupo e não foram anteriormente descritos, excepto para um ensaio disponível comercialmente para
DAPK1
. Fig 1 ilustra a arquitetura gene (
i
.
e
., A localização eo tamanho do CPG ilha, região e número de dinucleótidos CpG analisados) e fornece um pyrogram representante de cada gene que indica a metilação por cento de cada dinucleótido CpG examinados. índice de metilação de ADN (MI) foi calculada como a média de todas as metilação locais de CpG dentro da região sequenciada por pyrosequencing.
ilustrada é a arquitectura genómica do locus de cada examinados neste estudo. Está incluído o local relativo do exão 1, o local de início da transcrição (TSS), associada ilha de CpG, e a região ensaiadas para a metilação por pyrosequencing. Também é mostrado um pyrogram representante e medidos metilação da citosina em cada dinucleótido CpG analisados no ensaio pyrosequencing concebido. Genes analisados são
APC
(A),
CDH1
(B),
CCNA
(C),
CDH13
(D),
FHIT
(E);
RARB
(F);
Slit2
(G);
TIMP3
(H);
WIF1
(I) e
DAPK1
(J).
Em geral, encontramos todos os ensaios pyrosequencing para um bom desempenho, com taxas de falha do ensaio de baixa, alta coeficientes de correlação intra-classe (ICC), e os níveis consistentemente elevados de metilação para controlos positivos. Observou-se taxas muito baixas de falha (≤1%) para os ensaios com amplicons PCR 190 bps de tamanho. A exceção foi o projetado
TIMP3
ensaio em que encontramos uma taxa de falha ~ 6% para amplificar a região de destino e uma taxa de falha ~ 8% para obter dados pyrosequencing de qualidade suficiente. APC, que tinha um tamanho de fragmento amplificado de 194 pb, também tiveram uma taxa de falhas para amplificar a região alvo de ~ 6%; no entanto todos os amplicons gerados dados pyrosequencing de alta qualidade. Foram obtidos dados de alta qualidade a partir de ≥90% das amostras dos pacientes, com apenas uma amostra excluídos devido a DNA inadequada para a amplificação. O ICC para os ensaios pyrosequencing foi 0,94 para todos os genes, exceto FHIT (ICC = 0,69), que tinha baixa dentro e entre as pessoas variabilidade (1,41 e 2,11, respectivamente). Finalmente, o controlo positivo para o ADN totalmente metilado foi consistentemente metilado em todos os ensaios e os lotes pirossequenciao (média ± DP = 90 ± 6%). No caso de
CCNA
, nosso estudo inclui a análise de 20 casos e 22 controles (Tabela 2), devido a quantidades insuficientes de DNA para completar o estudo deste gene em todas as amostras.
níveis de metilação em todo locais CpG dentro de um gene eram relativamente estáveis, conforme ilustrado na Fig S1 para
DAPK1
,
RARB
,
e Slit2
. Fig 2 apresenta a distribuição de MI (
i
.
e
., Mediana e intervalo interquartil) para cada gene examinado por pyrosequencing. O MI média foi significativamente maior no DNA colhido a partir de amostras de CEC em comparação com DNA a partir de amostras de citologia normais em 8 dos 10 genes analisados (
DAPK1
,
RARB
,
CCNA
,
Slit2
,
WIF1
,
APC
,
CDH1
, e
FHIT
). Por outro lado,
CDH13
, e
TIMP3
mostrou nenhuma diferença significativa no MI médio entre casos e controles. A Tabela 2 apresenta um resumo detalhado do MI para todos os genes de status do caso. Entre os controles, o MI mediana foi 5% para todos os genes, exceto
TIMP3
(12,4%) e
Slit2
(7,1%) e de metilação níveis acima de 15% foram observadas apenas para dois genes (
TIMP3 e CDH13)
. Entre os casos, o MI mediana foi 10% para
DAPK1
,
CCNA
,
Slit2
,
WIF1
,
e TIMP3
(Tabela 2). Sublinhando a natureza heterogénea de metilação do DNA em células cancerosas, medimos uma ampla gama de MI por vários genes em todos os casos analisados. Por exemplo, a mediana
DAPK1
MI foi de 12% com uma gama de 1% a 96%. Testamos uma correlação potencial na metilação entre genes e só
Slit2
e
CCNA
mostrou uma correlação significativa (Rho = 0,68;
Valor de p Art 0,001).
Os genes estão ordenados por Mann-Whitney
p-value (
** valor de p 0,0001 e * valor de p 0,05). índice de metilação (IM) de cada gene é apresentada para amostra normal do colo do útero (N) e cancro (T) como um boxplot. Suiças dos boxplot marcar o 5
th e 95
th percentis, a caixa marca o 25
th (baixo limite da caixa), mediana e percentis 75 (limite superior da caixa) e valores extremos (●).
Nós exploramos se os níveis de metilação do DNA diferiam por idade e status de HPV. No geral, mediana
RARB
,
CDH1
,
e CDH13
metilação foi maior entre as mulheres do grupo controle ≥ 44 anos de idade (
valor p = 0,02
,
p-valor = 0,01
, e
p-valor = 0,04
, respectivamente). As diferenças significativas na metilação média entre casos e controles foram mantidos quando estratificados por idade ( 44 anos de idade ou ≥44 anos) para
DAPK1
,
RARB
,
CCNA e WIF; Considerando Slit2
,
APC
,
CHD1 e FHIT só foram significativamente diferentes entre os casos mais jovens e controles
(dados não mostrados). Entre os controles, DNA MI foi semelhante entre HPV mulheres negativos positivos e HPV. Além disso, quando restringir a casos e controles HPV-positivos, encontramos resultados muito semelhantes para as diferenças medianas na metilação e sensibilidade /especificidade (dados não mostrados).
níveis de metilação Distinguir Casos de Controles
usando um
a priori
limiar conservadora de MI 15% para definir um gene como metilado, o
gene DAPK1
foi classificada como metilado em 44% dos casos, e 0% dos controles.
Slit2
e
RARB
foram metilado acima de 15% em 61% e 23% dos casos, respectivamente, e nenhum dos controles. Usando MI 15%,
DAPK1
e
Slit2
teve 100% de especificidade e 43% e 61% de sensibilidade, respectivamente (Tabela 3). Todos, mas dois genes tiveram alta especificidade (100%) sem controles classificados como metilado acima de 15% (
i
.
e
., Sem falsos positivos). A seguir, nós examinamos se a MI medido de ADN dentro de uma combinação de genes melhorou a separação de grupos. O painel de genes foi selecionada usando
a priori
critérios (ver Materiais e Métodos). Dos 8 genes com significativamente maior MI em casos, (1)
CCNA
foi excluído devido à correlação significativa com a
Slit2
e (2)
APC
,
CDH1
e
FHIT
foram excluídos por causa da baixa AUC ( 0,60). Os genes restantes (
DAPK1
,
RARB
,
Slit2
e
WIF1
) foram avaliados quanto à sua capacidade de identificar casos de câncer cervical em relação ao HPV infecção e idade. Nós avaliamos o valor incremental da adição de níveis de metilação de DNA para modelos de previsão que incluiu conhecidos fatores de risco para o cancro do colo do útero, a idade (contínua) e status do HPV (positivo vs negativo) utilizando um método pelo Janes
et al
. [19,20]. O modelo ROC com qualquer infecção pelo HPV (sim x não) e idade (contínua) tinha uma AUC previsto de 0,79. Utilizando isto como uma referência, em relação a AUC estatisticamente prevista a partir de modelos que adicionado ADN MI para os quatro genes, em todas as combinações. A combinação de
DAPK1
,
Slit2
,
WIF1
e
RARB
(contínua) melhorou significativamente a AUC previu 0,79-0,98 (IC 95% : 0,97-1,00,
p-valor
= 0,002) (Fig 3) para identificar casos vs. controles. Ao definir metilação positiva como um MI 15%, a combinação de
DAPK1
,
Slit2
,
WIF1
e
RARB
(nenhum
vs
1-4 genes 15% metilados) teve a maior sensibilidade (90%) e especificidade (100%), com AUC de 0,95 (95% CI: 0,91-0,99)
ROC da sensibilidade prevista e 1-especificidade quando DNA MI para
DAPK1
,
RARB
,
Slit2
e
WIF1
genes foi adicionado a um modelo com o estatuto de HPV e idade. O teste da igualdade entre AUC para o HPV e idade (AUC = 79%, linha tracejada) em relação ao índice de metilação para
DAPK1
,
RARB
,
Slit2
e
WIF1
, HPV, e idade (AUC = 98%, linha sólida),
valor de p = 0,0002
.
Gene metilação, características do tumor , e paciente sobrevivência
casos de câncer do colo do útero foram diagnosticados entre 1993 e 2001, com um tempo médio de follow-up de 5 anos (2,4 meses-17 anos).
TIMP3
foi classificada como aberrante metilado ( 15%) com mais frequência em tumores pouco diferenciados em comparação com aqueles bem-moderadamente diferenciado (63% vs. 8%;
p
= 0,004).
DAPK1
foi mais frequentemente metilado (MI 15) em tumores localmente avançados (estágio 2B2) (65% vs. 22%,
Valor de p
= 0,007). Houve uma tendência para uma maior
DAPK1
metilação em tumores que recorreram para distal (mediana MI = 36%) em comparação com aqueles que nunca recorreram (mediana MI = 13%) ou recorrência local (mediana MI = 5%) (
p-valor
= 0,08). O DFS mediana e OS foram 10,3 anos e 8 anos, respectivamente. Não houve associação significativa entre a metilação do gene indivíduo ou o painel definido de genes (
DAPK1
,
Slit2
,
WIF1
e
RARB
) e DFS ou oS (dados não mostrados).
Discussão
Este estudo utilizou pyrosequencing quantitativo para medir o nível de metilação do DNA dentro de 10 TSG em amostras de cancro do colo do útero e do colo do útero normais. Desde a sua introdução, esta técnica tem conquistado favor como uma ferramenta preferida para medição de metilação do DNA [14]. Vários estudos têm avaliado tanto a exatidão e precisão de pyrosequencing para a análise de metilação do DNA em misturas heterogéneas de DNA. Usando proporções definidas de DNA metilado e não metilado, Murphy
et al
. [22] medidos uniformemente altos coeficientes de correlação de Pearson (R
2 0,99) ao correlacionar medido
vs
. A metilação do DNA calculado dentro de um painel de genes. A partir destes e de outros estudos semelhantes [23,24], pyrosequencing tem consistentemente comprovada para medir com precisão a metilação CpG dentro de misturas heterogéneas de DNA. Reed
et al
. [23] observaram que quando se mede a metilação do DNA em misturas contendo baixa ( 10%) CpG metilação, pyrosequencing metilação do DNA comumente um pouco superestimada, o que é consistente com os resultados obtidos por outros grupos [22,24]. Por exemplo, foram medidos valores de metilação que variam de 0 a 4% de CpG metilação quando as amostras de ADN de controlo (não metilado esperma ADN genómico humano) foram analisadas para
APC
metilação do gene (dados não mostrados). Esta variabilidade na análise dos baixos níveis de metilação do DNA, o que é semelhante ao Combinado Restrição Bissulfito Análise (COBRA), solicitado Colella
et ai. [14] a propor pelo menos um limiar de metilação de 10% ser aplicado para declarar um gene como metilado. Devido a esta preocupação, que utilizou um
a priori
nível de . 15% para classificar genes como metilado
O uso de métodos quantitativos para determinar os níveis de metilação do DNA é fundamental para classificar com precisão a metilação estado. métodos não e semi-quantitativos utilizados para avaliar a metilação do DNA tendem a superestimar a prevalência de metilação levando a um elevado número de falsos positivos (
i
.
e
. baixa especificidade). Esta superestimação é evidente pelo fato de que genes previamente relatado como metilado no cancro do colo do útero usando métodos não ou semi-quantitativos tinham níveis muito baixos de metilação medidos em ensaios pyrosequencing utilizados neste estudo (
i
.
e Art . 10% metilação). Por exemplo, a frequência média metilação relatada para
CDH1
(58%, gama: 0-91%) [2] é mais elevada do que a observada no presente estudo, em que não há tumores foram metilados superior a 10%. Entre os estudos que usaram métodos semi-quantitativos [6,10,25], Wisman
et al
. também não relataram metilação do
CDH1
no CEC [25]. Shivapurkar
et al
. relatou um por cento metilação mediana como 3,65 (Intervalo de 0-53%); no entanto, quando aplicado o corte de ponto comum QMSP ao classificar um gene como metilado (PFM 0), 89% dos tumores foram classificados como tendo
CDH1
metilado [6]. Isso destaca a superestimação potencial do
CDH1
frequência de metilação no câncer cervical. Observou-se que apenas 7% dos casos e nenhum dos controles tinha
APC
MI 15%, que é semelhante a dois estudos que utilizaram QMSP para medir
APC
metilação [25,26] e difere de Yang
et al
. que reportaram que 63% do cancro do colo do útero foram metilados [9]. A frequência de metilação do DNA relatada para
FHIT
usando MSP foi de 39% (intervalo de 8% -80%) [7,27-29]; no entanto semelhante aos nossos achados, Wisman
et al
. relatada uma ausência de
FHIT
metilação no SCC usando QMSP [25].
CDH13
metilação por QMSP foi relatado para ocorrer em 40% e 82% dos tumores [2], que difere de nossas descobertas de 6% dos tumores com MI acima de 15%.
pirossequencia�o análise confirmou estudos anteriores que indicam que
DAPK1
,
Slit2
,
WIF1
e
R a R b
genes são alvos comuns de metilação aberrante no cancro do colo do útero [8, 9,25,27-32]. O
DAPK1
gene codifica uma serina-treonina quinase dependente de calmodulina, que é um mediador positivo de gama-interferão induzida morte celular [33] e resistentes apoptose
DAPK1
silenciamento é pensado para produzir um /pró-sobrevivência fenótipo [34]. Curiosamente, descobrimos que
DAPK1
metilação foi um dos melhores indicadores globais de câncer cervical.