Abstract

Grandes esforços têm sido feitos para desenvolver novos e terapêutica eficaz contra o cancro do pâncreas para melhorar os resultados do tratamento. factor de indução de apoptose relacionado com o ligando (TRAIL) de necrose tumoral é uma citocina tal terapêutica com efeito de eliminação selectiva para células malignas. No entanto, alguns cancros pancreáticos humanos são intrinsecamente resistentes a apoptose mediada por TRAIL ou terapia. Neste estudo, demonstrámos que o LBH589 inibidor da desacetilase de histona pode sinergizar com TRAIL para aumentar a apoptose em células, mesmo TRAIL-resistente. LBH589 diminuiu os níveis de c-flip em todas as linhas celulares testadas e os níveis de survivina em algumas das linhas celulares testadas. Forçada expressão de ectópica c-FLIP, mas não survivin, aboliu a indução de apoptose cooperativa pela combinação de LBH589 e TRAIL, indicando que c-FLIP downregulation desempenha um papel fundamental na sensibilização LBH589 de células do cancro do pâncreas Trail. Além disso, LBH589 diminuiu a estabilidade c-FLIP ea presença do inibidor do proteassoma MG132 impedido c-FLIP de redução de LBH589. Correspondentemente, foram detectados níveis aumentados de ubiqutinated c-FLIP em células tratadas com LBH589. Estes dados indicam, portanto, que LBH589 promove ubiqutin degradação /mediada proteassoma-de c-FLIP, levando a regulação negativa de c-FLIP. Colectivamente, LBH589 induz a degradação c-FLIP e, consequentemente, sensibiliza as células de câncer de pâncreas à apoptose induzida por TRAIL, com destaque para um romance regime terapêutico contra o câncer pancreático

Citation:. Kauh J, Fan S, Xia M, Yue P, Yang G, Khuri FR, et ai. (2010) c-FLIP Degradação Medeia Sensibilização de células do cancro do pâncreas para Trail-apoptose induzida pela histona Deacetylase Inhibitor LBH589. PLoS ONE 5 (4): e10376. doi: 10.1371 /journal.pone.0010376

editor: Dong-Jin Yan, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 12 Março, 2010; Aceito: 07 de abril de 2010; Publicação: 28 de abril de 2010

Direitos de autor: © 2010 Kauh et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo prêmio Geórgia Cancer Coalition Distinguished Scholar Câncer (para SY. S.) e fundo de investigação do departamento (JK). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é um dos cânceres mais difíceis de tratar apesar de representar apenas 3% de todos os cânceres. Apesar de vários ensaios clínicos com novos agentes quimioterápicos, ao longo dos últimos 25 anos, a taxa de sobrevida em 5 anos de 5%, ea sobrevida média de 6 meses, em grande parte manteve-se inalterada. A sobrevivência média é cerca de 6 meses [1], [2]. Uma das razões para os pobres sobrevivência de câncer de pâncreas é a insensibilidade para com a maioria das terapias convencionais, incluindo quimioterapia e radioterapia [3]. Assim, são urgentemente necessárias novas e eficazes agentes terapêuticos ou regimes para o tratamento de câncer de pâncreas.

A apoptose é uma parte essencial de mecanismos que mantêm a homeostase do tecido normal [4]. A desregulamentação da maquinaria apoptótica e evasão de apoptose é um mecanismo geral no câncer. A maioria das quimioterapias actuar pela indução de apoptose. Portanto, evasão de apoptose é o principal responsável pela insuficiência de terapias atuais [2], [5]. É bem conhecido que as células podem morrer de apoptose principalmente através da via de receptor de morte induzida por extrínseca e /ou a via mediada por mitocôndrias intrínseca [6]. A activação da via apoptótica da morte mediada pelo receptor de extrínseca envolve ligação de um ligando a morte (por exemplo, necrose tumoral relacionada factor de ligando indutor de apoptose; TRAIL) com o seu receptor da superfície da célula correspondente da morte (s) ou de agregação (por exemplo trimerização) de morte receptores, levando à formação do indutor de morte complexo de sinalização (DISCO) seguido pela clivagem de activação da caspase-8 no disco. Como o Bid serve como um substrato da caspase-8, activação da via do receptor de morte apoptótica extrínseca também liga o circuito apoptótico intrínseca [7].

O ligando TRAIL morte tem emergido recentemente como um potencial agente terapêutico do cancro porque preferencialmente induz a apoptose em células transformadas ou malignas [8]. Actualmente TRAIL humano recombinante está a ser testado na Fase I de ensaios clínicos. Além disso, anticorpos agonistas contra DR4 e DR5, que activam directamente a via apoptótica extrínseca, foram também testados em ensaios de fase I ou II [9]. Assim, o receptor de morte, em particular a apoptose mediada por TRAIL de receptor de morte tenha sido sob intensa investigação como um alvo terapêutico do cancro [10], [11]. Muitos estudos pré-clínicos demonstraram o potencial terapêutico de direccionamento a TRAIL /apoptose mediada pelo receptor de morte no cancro pancreático [12] – [20]. No entanto, uma questão importante a este respeito é a resistência intrínseca de determinadas células cancerosas, incluindo as células do cancro do pâncreas apoptose TRAIL /morte induzida pelo receptor [17], [18].

Cellular proteína FLICE-inibitória (c- FLIP), que inibe a activação de caspase-8, evitando o recrutamento de caspase-8 para o disco, é o principal inibidor da apoptose induzida pelo receptor de TRAIL /morte [21], [22]. Os níveis de c-FLIP, incluindo tanto FLIP

L e FLIP

S estão sujeitas a regulamentação por ubiquitina degradação /mediada por proteassoma [23] – [25]. Elevada expressão de c-FLIP protege as células da apoptose mediada pelo receptor de morte, enquanto que a regulação negativa da proteína c-FLIP por produtos químicos ou pequeno ARN interferente sensibiliza as células para a apoptose mediada pelo receptor de morte [26]. A sobre-expressão da c-FLIP tem sido sugerida para ser o mecanismo de resistência TRAIL subjacente chave no cancro pancreático [13], [17].

LBH589 (panobinostat) é uma desacetilase de histona-Pan (HDAC) com anticancerígeno promissor actividade [27]. actividade de agente único contra o cancro pancreático, foi demonstrada em modelos pré-clínicos experimentais [28]. Neste estudo, que revelaram uma nova actividade de LBH589, que sensibiliza as células cancerígenas pancreáticas a apoptose induzida por TRAIL. Além disso, temos mostrado que LBH589 facilita ubiqutin /degradação c-FLIP mediada por proteassoma, levando ao aumento da apoptose induzida por TRAIL em câncer pancreático.

Materiais e Métodos

Reagentes

LBH589 foi fornecido pela Novartis (Basileia, Suíça). O TRAIL humano recombinante solúvel foi comprado de PeproTech, Inc. (Rocky Hill, NJ). O MG132 inibidor de proteassoma e o cyclohexemide inibidor de síntese de proteínas (CHX) foram adquiridos a Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). anticorpo anti-DR5 policlonal de coelho foi adquirido de ProSci Inc (Poway, CA). anticorpo anti-DR4 monoclonal de ratinho (B-N28) foi adquirido a partir de Diaclone (Stamford, CT). anticorpo monoclonal de ratinho anti-caspase-3 foi adquirido a Imgenex (San Diego, CA). Policlonal de coelho anti-XIAP, anti-caspase-8, anti-Mcl-1, e anticorpos anti-PARP e anticorpo monoclonal de ratinho anti-survivina foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA). anticorpo anti Bcl-2 de ratinho foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Anticorpo policlonal de coelho anti-GAPDH e do anticorpo monoclonal anti-Bax rato foram adquiridos à Trevigen (Gaithersburg, MD). anticorpo anti-β-actina monoclonal de ratinho foi adquirido à Sigma Chemical Co.

Linhas Celulares e Cultura de células

linhas de células de cancro pancreático humano utilizadas neste estudo foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection ( Manassas, VA). Para o estabelecimento de linhas celulares de cancro do pâncreas que expressam estavelmente ectópica c-FLIP ou survivina, Panc-1 As células foram infectadas com lentivírus abrigando vectores de expressão de lentivírus de FLIP

L, e a survivina, respectivamente, como descrito anteriormente [29], [30]. Também as células infectadas com lentivírus que transportam Lac Z vector de expressão como um controlo [29]. Os clones individuais de células resistentes a blasticidina foram expandidos e sujeitos a rastreio da expressão da proteína alvo por Western blotting. Estas linhas celulares foram cultivadas em meio DMSM contendo 5% de soro fetal de bovino a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 e 95% de ar.

celular Ensaio de sobrevivência

as células foram semeadas em placas de cultura celular de 96 poços e tratadas no dia seguinte com os agentes indicadas. Os números de células viáveis ​​foram determinadas utilizando o ensaio de sulforrodamina B (SRB), tal como previamente descrito [31]. índice de combinação para interacção fármaco (por exemplo, a sinergia) foi calculada utilizando o software CompuSyn (ComboSyn, Inc .; Paramus, NJ). A significância estatística das diferenças entre os dois tratamentos foram analisados ​​com aluno não pareado frente e verso

t

testes de uso de Graphpad InStat 3 software (GraphPad Software, San Diego, CA). Os resultados foram considerados estatisticamente significativos a

P

. 0,05

A detecção de apoptose

A apoptose foi avaliada por coloração de anexina V usando o kit de detecção de apoptose com anexina V PE comprado da BD Biosciences (San José, CA) seguindo as instruções do fabricante. Nós também detectada activação de caspase por Western blotting (como descrito abaixo) como um indicador adicional da apoptose.

Análise Western Blot

foram preparadas e analisadas por transferência de Western como descrito anteriormente lisados ​​de proteína de célula inteira [33] [32].

Immunoprecipitation para a detecção de Ubiqutinated c-FLIP

Panc-1 /FLIP

L-5 células, que FLIP estavelmente expressa

L, foram transfectadas com o plasmídeo de HA-ubiquitina utilizando o reagente de transfecção FuGENE 6 (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN), seguindo as instruções do fabricante. Após 24 h, as células foram tratadas com LBH589 ou MG132 mais LBH589 durante 4 h e depois foram lisadas por imunoprecipitação de Flag-FLIP

L, utilizando o anticorpo monoclonal Flag M2 (Sigma Chemicals) como anteriormente descrito [34] seguido pela detecção da FLIP ubiquitinada

L com transferência de Western utilizando anti-HA anticorpo (Abgent; San Diego, CA):

Resultados

LBH589 sensibiliza células do cancro do pâncreas para induzida Trail-apoptose

.

em primeiro lugar, determinou as sensibilidades de linhas celulares de cancro do pâncreas utilizados neste estudo para TRAIL. Como apresentado na Fig. 1A, quatro linhas celulares de cancro pancreático mostraram sensibilidades diferenciais: MiaPaCa-2 e BxPC3 exibiu diminuição dependente da dose, da sobrevivência das células após tratamento TRAIL e, assim, foram sensíveis a TRAIL, enquanto que Panc-1 e Capan-2 eram resistentes a TRAIL porque eles mostraram mínimo resposta a fuga em termos de diminuição da sobrevivência celular. Quando combinado com LBH589, efeitos que matam células melhoradas não foram observados apenas nas células sensíveis a TRAIL (por exemplo, BCPC-3), mas também em linhas de células de TRAIL-resistente (por exemplo, Panc-1 e Capan-2), porque a combinação de LBH589 TRAIL e foram muito mais do que qualquer dos agentes por si só na redução da sobrevivência das células de cancro do pâncreas (Fig. 1B). Os índices de combinação para LBH589 (por exemplo, 12,5 nM) e TRAIL (3,125-26 ng /ml) em combinação das linhas celulares testadas foram 0,5 (Fig. 1C), indicando que LBH589 e combinação TRAIL exerce efeitos sinérgicos sobre a sobrevivência celular diminuindo de células de câncer de pâncreas. Além disso, detectamos diretamente apoptose medindo células V-positivos anexina e clivagem caspase em células expostas a LBH589 sozinho, TRAIL sozinho e sua combinação. De acordo com os dados de sobrevivência celular, a combinação de LBH589 e TRAIL foi muito mais potente do que cada agente individual por si só na indução da clivagem de caspase-9, caspase-8, caspase-3 e PARP (Fig. 2A) e aumentando a anexina V-positiva células (isto é, as células apoptóticas) (Fig. 2B). Especificamente, LBH589 e TRAIL sozinho causou cerca de 18% e 21% de apoptose, respectivamente; No entanto, a combinação de LBH589 e TRAIL induziu cerca de 62% de apoptose, o que é obviamente maior do que o efeito aditivo. Colectivamente, estes resultados indicam que LBH589 sensibilizar células de cancro do pâncreas para a apoptose induzida por TRAIL.

Um

, As linhas celulares indicadas foram semeadas em placas de 96 poços de cultura de células e tratou-se no dia seguinte com as concentrações indicadas de TRAIL por 24 h. Os números de células foram estimadas usando o ensaio SRB. Os dados são os meios de quatro determinações replicadas; bares, ± SDs. *,

P Art 0,01 comparar com células não tratadas.

B

, As linhas celulares indicadas semeadas em placas de cultura celular de 96 poços foram tratadas com as concentrações indicadas de TRAIL sozinho, LBH589 sozinho, ou a respectiva combinação de LBH e TRAIL durante 24 h. Os números de células foram estimadas usando o ensaio SRB. Os dados são os meios de quatro determinações replicadas; bares, ± SDs. Em BxPC-3 e células Panc-1, cada combinação é significativamente mais eficaz do que qualquer um sozinho de TRAIL ou LBH589 sozinho na redução da sobrevivência das células (

P

0,05 ou 0,001). Em células Capan-2, LBH589 a 50 nM em combinação com 12,5 ng /mL ou ng 25 /ml é significativamente mais eficaz do que LBH589 ou TRAIL sozinho na redução da sobrevivência das células (

P

0,001). Portanto, são o LBH589 a 25 nM ou 50 nM combinado com TRAIL (

P

0,05).

C

, índices combinações (IC) foram calculados com base nos dados apresentados na Fig. 1B usando software CompuSyn.

A

, As linhas celulares indicadas foram tratados com controle de DMSO, 50 nM LBH589 25 ng TRAIL /ml sozinho, ou LBH589 além de TRAIL. Após 16 h, as células foram sujeitas a preparação de lisados ​​proteicos de células inteiras para detectar a clivagem de caspase utilizando Western blotting. Casp, caspase; CF, clivado fragmento.

B

, células Panc-1 foram tratadas com 25 ng /ml de TRAIL sozinho, 50 nM LBH589 sozinho ou a sua combinação, durante 24 h. As células foram então sujeitas a medição de apoptose utilizando coloração de anexina V. As células positivas por cento no canto inferior direito quadrantes superior direito e representam o total da população celular por apoptose.

LBH589 diminui os níveis de c-FLIP e Survivin em células de cancro do pâncreas

Para entender os mecanismos pelos quais LBH589 sensibiliza linhas celulares de cancro do pâncreas à apoptose induzida por TRAIL, analisamos primeiro os efeitos moduladores de LBH589 no c-FLIP, DR5, DR4 e TRAIL, que estão diretamente envolvidos na regulação da apoptose mediada pelo receptor TRAIL /death , em três linhas de células do cancro do pâncreas. Panc-1 e células Capan-2 tinham níveis basais mais elevados de c-FLIP (particularmente LANCE

L) do que as células BxPC-3. O tratamento destas linhas celulares com LBH589 diminuiu os níveis de c-FLIP em todas as três linhas celulares de um modo dependente da concentração (Fig. 3A). A redução c-FLIP ocorreu às 3 h e tornou-se ainda mais pronunciada às 12 h pós e, posteriormente, após o tratamento LBH589 (Fig. 3B). LBH589 não alterou os níveis de TRAIL em qualquer uma das linhas celulares testadas (Fig. 3A) e apenas minimamente aumentado de expressão de DR5 em uma das três linhas de células testadas (i.e., BxPC-3) (Figs. 3A e 3B). Estes resultados sugerem claramente que o C-FLIP donwregulation é um acontecimento importante induzida por LBH589.

As linhas celulares indicadas foram tratadas com diferentes concentrações de LBH589, tal como indicado, durante 12 h (

Um

) ou com 50 nM LBH589 durante os tempos indicados (

B

). Após os tratamentos, as linhas celulares foram submetidos a preparação de lisados ​​de proteína de célula inteira e posterior análise de Western blot para detecção das proteínas indicadas.

Além disso, nós também examinou os efeitos moduladores de LBH589 em outras proteínas incluindo a survivina, XIAP, Bcl-2, Mcl-1, e Bax, que regulam a apoptose mediada por mitocôndrias. LBH589 diminuição dos níveis de survivina em Panc-1 e células Capan-2, mas não as células BxPC-3 (Fig. 3A). Tempo de análise curso de níveis de survivina em células Panc-1 demonstrou que a redução pronunciada survivina ocorreu às 12 h pós-tratamento LBH589 (Fig. 3B). LBH589 não alterou os níveis de Bax e XIAP nestas linhas celulares; No entanto, o aumento dos níveis de Mcl-2 nestas linhas celulares, bem como os níveis de Bcl-2 em células BxPC-3 (Fig. 2A). Juntos, estes resultados também sugerem que a redução survivin também pode ser um evento importante induzida por LBH589.

Expression forçado de ectópica c-FLIP, mas não Survivin, protege as células de indução de apoptose pela combinação de LBH569 e TRAIL

Ambos c-FLIP e survivin estão envolvidos na regulação da sensibilidade das células TRAIL [35]. Para determinar o envolvimento de c-FLIP e downregulation survivin na sensibilização das células do cancro do pâncreas apoptose induzida por TRAIL por LBH589, estabelecemos linhas de células Panc-1 que expressam de forma estável ectópica FLP

L ou survivina através de um sistema de expressão lentivial e depois examinadas as respostas à combinação de LBH589 e TRAIL. A expressão ectópica de survivina ou c-FLIP foi assumida por transferência de Western, tal como apresentado na Fig. 4A. Lac Z é uma proteína irrelevante e aqui foi utilizado como um controlo. Como demonstrado acima, a combinação de LBH589 e TRAIL eficaz diminuiu a sobrevivência celular em Lac Z ou linhas celulares que expressam survivina, mas não o fez em ambas as linhas celulares que expressam FLIP ectópica

G (Fig. 4B), indicando o expressão forçada de FLIPL ectópica, ao invés de survivina, confere resistência das células à indução aumentada de apoptose por LBH589 e combinação de TRAIL. Ao detectar a apoptose, verificou-se que a combinação de LBH589 induziram fortemente a clivagem de caspase-8, caspase-9, caspase-3 e PARP em Panc-1 linhas de células que expressam LacZ ou survivina, mas apenas minimamente na FLIP

G células -expressing Panc-1 (Fig. 5A). Em concordância, a combinação de LBH589 e TRAIL causou cerca de 79% e 69% de apoptose em Panc-1 /lac Z-1 e Panc-1 células, respectivamente, mas apenas cerca de 25% de apoptose em Panc-1/4 de survivina- /FLIPL-5 células (Fig. 5B), confirmando ainda que FLIP

G sobre-expressão confere resistência da célula para a combinação de LBH589 e TRAIL. Colectivamente, estes resultados demonstram que c-FLIP downregulation desempenha um papel-chave na sensibilização LBH-589-mediada de células de cancro do pâncreas para a apoptose induzida por TRAIL.

Um

, A expressão ectópica de survivina ou c-FLIP nas várias trasnfectants como indicado foi detectada por transferência Western com anticorpo survivina ou c-FLIP.

B

, Os transfectantes dadas foram semeadas em placas de 96 poços e tratadas com as concentrações indicadas de LBH589 sozinho, 25 ng /ml de TRAIL sozinho, ou combinação individual de LBH589 com TRAIL. Após 24 h, as células foram submetidas ao ensaio de SRB para a medição da sobrevivência celular. Os dados são os meios de quatro determinações replicadas; bares; SDs ±. *,

P Art 0,0001 e #,

P Art 0,001 comparado com o tratamento LBH589 sozinho

Os transfectantes indicados foram tratados sem e com 50 nM. LBH589 mais 25 ng /ml TRAIL (L /T) durante 16 h (

a

) ou 24 h (

B

). As células foram então colhidas para a preparação de lisados ​​proteicos de células inteiras para detectar a caspase e clivagem PARP utilizando transferência de Western (

Um

) ou para a medição de apoptose utilizando coloração de anexina V (

B

). As células positivas por cento no canto inferior direito quadrantes superior direito e representam o total da população celular por apoptose.

LBH589 Donwregulates c-FLIP através da promoção Ubiqitin /mediada por proteassoma Degradação

Dada a crítica papel da regulação negativa c-FLIP na mediação aumento da apoptose induzida por TRAIL por LBH589 como demonstrado acima, abordamos ainda como LBH589 diminuição dos níveis de c-FLIP. Porque as proteínas c-flip são conhecidas por serem reguladas por degradação ubiquitina /proteassoma mediada por [23], [25], que, em seguida, determinar se a regulação negativa observada de c-FLIP por LBH589 seria mediada através deste processo. Assim, primeiro analisou se LBH589 promove a degradação c-FLIP. Para este fim, tratou-Panc 1cells com DMSO ou LBH589 durante 4 h e, em seguida, lavada a droga seguindo-se reencher as células com meio fresco contendo o inibidor de síntese de proteínas CHX. Nos tempos indicados coloca-CHX, as células foram recolhidas por transferência de Western para analisar a taxa de degradação C-FLIP. Como apresentado na Fig. 6A, a taxa de redução ou degradação de FLIP

L em células tratadas com LBH589 era aparentemente mais rápida do que em células de controlo tratadas com DMSO, indicando que, de facto facilita LBH589 degradação C-FLIP. A seguir, as células tratadas com LBH589 na ausência e na presença do inibidor de proteassoma MG132 e modulação C-FLIP, em seguida, comparados sob estas condições. Como apresentado na Fig. 6B, LBH589 diminuição dos níveis de c-flip, na ausência de MG132, mas não na presença de MG132, sugerindo que a degradação do C-FLIP-LBH589 induzida é dependente de proteassoma. Por imunoprecipitação /transferência de Western, também detectados os níveis mais elevados de FLIP ubiqutinated

L em células tratadas com LBH589 mais MG132 em comparação com as células expostas à sozinho ou MG132 sozinho (Fig. 6C) LBH589, indicando que HNK aumenta c-FLIP ubiquitinação . Tomados em conjunto, podemos concluir que LBH589 induz ubiquitina /degradação c-FLIP mediada por proteassoma, levando a regulação negativa de c-FLIP em células de cancro pancreático humano.

A

, as células Panc-1 foram tratadas com DMSO ou 50 nM LBH589 durante 4 h. As células foram então lavadas com PBS 3 vezes e novamente alimentadas com meio fresco contendo 10 ug /ml CHX. Nos tempos indicados coloca-CHX, as células foram colhidas para a preparação de lisados ​​proteicos de células inteiras e subsequente análise de Western blot. Os níveis de proteína foram quantificados com o software NIH Image J. (Bethesda, MA) e foram normalizados para GAPGH. Os resultados foram representados como os níveis de c-flip relativa em comparação com os relativos à data de tratamento 0 CHX (painel inferior).

B

, células Panc-1 foram pré-tratadas com 20? M MG132 durante 30 minutos antes da adição de 50 nM LBH589. Após o co-tratamento de 4 h, as células foram colhidas para a preparação de lisados ​​proteicos de células inteiras e subsequente análise de Western blot.

C

, Panc-1 /FLIP

G-5 células que expressam de forma estável ectópica bandeira-FLIP

L foram transfectadas com o plasmídeo de HA-ubiquitina utilizando FuGENE 6 reagente de transfecção durante 24 h. As células foram, em seguida, pré-tratado com 20 uM MG132 durante 30 minutos e, em seguida, co-tratadas com 50 nM LBH589 durante 4 h. lisados ​​de proteína de células inteiras foram então preparados para imunoprecipitação (IP) utilizando anticorpo anti-Flag seguido por Western blot (WB) utilizando anticorpo anti-HA para a detecção de FLIP ubiquitinada

L (Ub-FLIP

L) e anti anticorpo -flag para a detecção de FLIP ectópica

L.

Discussão

tumores de câncer pancreático humano ou linhas celulares apresentam respostas heterogéneas a TRAIL. Alguns destes tumores ou linhas celulares são intrinsecamente insensível à apoptose induzida por TRAIL [17], [18]. No presente estudo, nós apresentamos um achado romance que o inibidor da histona-desacetilase LBH589 aumenta eficazmente a apoptose induzida por TRAIL em células de cancro pancreático humano, incluindo aqueles resistentes à apoptose induzida por TRAIL. Dado que LBH589 mostra a actividade anti-cancro em modelos de cancro pancreático pré-clínicos [28] assim que o TRAIL tumor-selectiva é uma proteína terapêutica potencial cancro e está a ser testado na Fase I de ensaios clínicos, as nossas descobertas requerem mais de avaliação sobre a combinação de LBH589 e TRAIL como um potencial de regimes terapêuticos contra o câncer de pâncreas em modelos animais e em ensaios clínicos

.

Ambos survivina e XIAP são sugeridos para regular a apoptose mediada por TRAIL [12], [36], [37]. Alguns inibidores de HDAC, tais como o butirato de sódio e LAQ824 foram relatados para aumentar a apoptose induzida por TRAIL envolvendo donwregualtion de survivina e XIAP [38], [39]. Um estudo recente sugeriu que LBH589 aumenta a apoptose induzida por TRAIL através de regulação negativa de XIAP em células de mesotelioma [40]. No nosso estudo, verificou-se que a diminuição dos níveis LBH589 survivina em dois (isto é, Panc-1 e Capan-2) de três linhas celulares de cancro pancreático testadas, mas não, obviamente, alterar os níveis de XIAP (Fig. 3). Além disso, aplicada a expressão ectópica de survivina não conferem resistência a LBH589 /apoptose induzida por TRAIL (Figs. 4 e 5). Assim, survivina e XIAP é improvável que estar envolvido na regulação da sensibilização mediada por LBH589 de apoptose induzida por TRAIL em células de câncer de pâncreas.

Bcl-2 membros da família, como a Bcl-2 e Mcl-1 também têm sido sugerido na regulação de apoptose induzida por TRAIL [14], [35]. Outros inibidores de HDAC intensificar a apoptose induzida por TRAIL em células cancerosas diferentes envolvendo a modulação de membros da família Bcl-2, tais como a regulação negativa da proteína Bcl-2 e Bcl-X

L, e supra-regulação de Bax e Bim [39], [41] – [ ,,,0],44]. Em nosso estudo, LBH589 não alterar os níveis de Bax. Inesperadamente, LBH589 aumento dos níveis de Bcl-2 e de Mcl-1 (Fig. 3). Assim, a modulação destas proteínas é pouco provável ser associado a potenciação mediada por LBH589 de apoptose induzida por TRAIL em linhas celulares destes; Em vez disso, aumentar em Bcl-2, Mcl-1 e pode contrariar o efeito de LBH589 na sensibilização de células de cancro pancreático à apoptose induzida por TRAIL. Assim, ainda a inclusão de um inibidor de Bcl-2 ou Mcl-1 do presente regime pode resultar em eficácia anticancerígena ainda mais eficaz do que a combinação de LBH589 e TRAIL e deve ser mais explorado.

indução DR5 e c-FLIP downregulation são importantes mecanismos subjacentes aumento mediada por drogas ou sensibilização da apoptose induzida por TRAIL [45]. Em nosso estudo, descobrimos que LBH589 tanto fez não ou apenas fracamente aumento da expressão DR5 em linhas celulares de cancro do pâncreas (Fig. 3), sugerindo que DR5 modulação tem um papel limitado na sensibilização mediada por LBH589 de apoptose induzida por TRAIL nestas células. os níveis de c-FLIP têm sido sugeridos para ser associado com a sensibilidade de células de cancro pancreático à apoptose induzida por TRAIL-; Especificamente, os níveis mais elevados de C-FLIP foi detectada nas linhas celulares de cancro pancreático TRAIL-resistente em comparação com as células sensíveis TRAIL [17]. A inibição da c-FLIP com um pequeno ARN interferente ou uma molécula pequena sensibiliza as células de cancro do pâncreas para a apoptose induzida por TRAIL [13], [17]. Além disso, outros inibidores de HDAC, tais como LAQ824, MS-275, o composto FR901228, ácido valpróico e droxinostat foram mostrados para regular negativamente os níveis de c-flip e intensificar a apoptose induzida pelo receptor de morte [46] – [52]. No nosso estudo, nós também descobrimos que as linhas celulares resistentes a TRAIL-Panc-1 e Capan-2 tinham níveis basais mais elevados de C-FLIP do que a linha de células sensíveis a TRAIL (BxPC-3) (Fig. 3A). Assim como outros inibidores de HDAC, LBH589 diminuiu linhas celulares c-FLIP nestas três linhas de células testadas; esta regulação negativa c-FLIP é um evento rápido porque a redução c-FLIP foi detectado, mesmo em 3 h pós LBH589 tratamento (Fig. 3). Importante, imposta expressão de ectópica c-FLIP (isto é, FLIP

L) aboliu a capacidade da LBH589 para melhorar a apoptose induzida por TRAIL (Fig. 4 e 5). Colectivamente, estes resultados indicam que a regulação negativa de c-FLIP é fundamental para a sensibilização mediada por LBH589 de células de cancro do pâncreas para TRAIL-induziu apoptose.

c-FLIP é conhecido por ser regulada por ubiquitina /mediada por proteassoma degradação [ ,,,0],23], [24]. Estudos anteriores demonstraram que c-FLIP supressão induzida por certos inibidores de HDAC ocorre no nível de ARNm [39], [51]. Como os inibidores de HDAC regular negativamente os níveis de c-FLIP não foi completamente esclarecida. Em nosso estudo, descobrimos que LBH589 facilitado a degradação c-FLIP, como demonstrado no ensaio CHX perseguição. A presença do MG132 inibidor do proteassoma impedido c-FLIP da redução induzida por LBH589. Além disso, LBH589 aumentou os níveis de c-ubiquitinada FLIP (Fig. 6). Assim, estes resultados indicam que facilita LBH589 ubqitin /degradação C-FLIP mediada pelo proteasoma, resultando na regulação negativa c-FLIP. Para o melhor de nosso conhecimento, a constatação sobre a degradação c-FLIP ou downregulation por LBH589 é novo e garante uma investigação mais aprofundada sobre como a inibição da histona deacetilase leva à degradação c-FLIP.

As concentrações plasmáticas máximas de LBH589 em pacientes de cancro humanos variam de 200 nM a 1300 nM de acordo com as doses testadas [53]. As concentrações de LBH589 usados ​​em nosso estudo que regulam negativamente c-FLIP e melhorar a apoptose induzida por TRAIL estão entre 12,5 nM e 100 nM e, portanto, dentro do intervalo clinicamente viável. Portanto, o teste clínico futuro da combinação é garantido.

Reconhecimentos

F.R. Khuri e S-Y. Sun são Geórgia Cancer Coalition Distinguished Cancer Scholars.